臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件

基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用劉敬忠首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室

北京朝陽(yáng)醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用劉敬忠臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件中心法則

復(fù)轉(zhuǎn)錄翻譯

DNARNA蛋白質(zhì)

蛋白

制

反轉(zhuǎn)錄

糖蛋白脂蛋白酶類激素細(xì)胞因子

中心法則復(fù)轉(zhuǎn)錄翻譯基因重組技術(shù)

基因探針技術(shù)

基因重組藥物基因診斷基因治療

PKU

尿毒癥（口服artificialcells)基因重組技術(shù)

基因探針技術(shù)基因重組基因診斷

運(yùn)用基因探針，PCR技術(shù)等探測(cè)特定靶基因的存在與否，或是否有基因突變等缺陷，從而對(duì)疾病或病原體感染作出診斷叫基因診斷。

基因型表型基臨血生細(xì)影病因床清化菌像理診學(xué)學(xué)學(xué)學(xué)學(xué)斷診診診診診診斷斷斷斷斷斷基因診斷運(yùn)用基因探針，PCR技術(shù)等探測(cè)特基因診斷的特點(diǎn)靈敏度高（早期）特異性強(qiáng)操作簡(jiǎn)便取材大多不受組織器官限制可進(jìn)行早期診斷，癥狀前診斷及產(chǎn)前診斷檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)病毒等微生物時(shí)不需培養(yǎng)基因診斷的特點(diǎn)靈敏度高（早期）聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction（PCR）KaryB.Mullis1984年問(wèn)世,成為分子生物學(xué)和生命科學(xué)發(fā)展史上的里程碑1993榮獲諾貝爾獎(jiǎng)

Mendocin128號(hào)公路附近一棵七葉樹(shù)下的突發(fā)奇想專利官司之戰(zhàn):DuPont與Cetus對(duì)薄公堂聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReacti

PCR原理示意圖PCR原理示意圖PCR技術(shù)的應(yīng)用一、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用二、遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷：血友病、地中海貧血、DMD、PKU等等三、細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體等四、病毒五、白血病、腫瘤六、骨髓移植、器官移植供體配型選擇七、法醫(yī)學(xué)八、動(dòng)植物學(xué)九、古人類學(xué)、古生物學(xué)

PCR技術(shù)的應(yīng)用一、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件PCR原理示意圖PCR熱變性：從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提取的DNA約1ug，在含有適當(dāng)緩沖液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反應(yīng)混合物中，在94℃下熱變性4分鐘，使之解為單鏈。

熱變性：從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提取的DNA約1ug，退火：然后置反應(yīng)混合物于55℃，使引物與解為單鏈的DNA上互補(bǔ)序列雜交在一起，稱之為退火。并迅速加入2單位耐熱的TaqDNA聚合酶，混勻、離心10秒鐘。為防止在整個(gè)PCR過(guò)程中，水份的蒸發(fā)影響PCR效果，通常加入35ul石蠟油封蓋液面。退火：然后置反應(yīng)混合物于55℃，使引物與解為單鏈的DNA上互引物延伸：置上述反應(yīng)混合物于70℃水浴中1-2分鐘，在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs為原料（底物），從引物的3’端A開(kāi)始,沿著5’→3’的方向，合成每條模板的互補(bǔ)鏈，此稱引物延伸。結(jié)果，DNA拷貝數(shù)增加了一倍。引物延伸：置上述反應(yīng)混合物于70℃水浴中1-2分鐘，在DNA接著，將上述熱變性—退火—引物延伸（稱為一個(gè)循環(huán)）反復(fù)進(jìn)行30-35次。只是熱變性的時(shí)間縮短為1分鐘左右。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，DNA拷貝數(shù)便增加一倍（×2）。因此，如進(jìn)行n次循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加2n倍！進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加225倍，即上百萬(wàn)倍。在瓊脂糖凝膠電泳上可看到特異性長(zhǎng)度的擴(kuò)增帶?？梢?jiàn)PCR之所以高速擴(kuò)增的關(guān)鍵是因?yàn)槊看涡潞铣傻腄NA鏈在后來(lái)的循環(huán)中都可以作模板，猶如滾雪球，數(shù)量迅速增加。接著，將上述熱變性—退火—引物延伸（稱為一個(gè)循環(huán)）反復(fù)進(jìn)行3如果引物5’端有幾個(gè)與模板DNA不配對(duì)的堿基，仍可能與模板DNA退火、延伸，對(duì)PCR效果影響不大。這一特點(diǎn)，可使PCR產(chǎn)物兩端帶上限制酶的Linker，或造成DNA順序的缺失、插入、堿基替代等。大大增大了PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍。如果引物5’端有幾個(gè)與模板DNA不配對(duì)的堿基，仍可能與模板D影響PCR效果的重要因素及注意事項(xiàng)：PCR技術(shù)的原理似乎非常簡(jiǎn)單明了，PCR反應(yīng)的操作也并不復(fù)雜；但要取得好的結(jié)果和良好的可重復(fù)性并非易事。必須徹底弄通其分子生物學(xué)的奧妙之處，并把握其各種影響因素，規(guī)范操作。以下列出影響PCR擴(kuò)增效果的主要因素影響PCR效果的重要因素及注意事項(xiàng)：引物設(shè)計(jì)一定要科學(xué)合理，序列的特異性要高。長(zhǎng)度一般在18-25個(gè)堿基，Tm值可按公式（G+C總數(shù)x4）+（A+T總數(shù)x2）（℃）估算。盡可能避開(kāi)4個(gè)以上G或C等相同堿基串聯(lián)重復(fù)。盡可能避免引物內(nèi)部形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物之間形成二聚體（Dimer）的可能性。G、C與A、T的比例盡可能1:1左右。同一反應(yīng)管中的引物（甚至同一個(gè)Lab的所有引物）Tm值設(shè)計(jì)的相同。引物設(shè)計(jì)一定要科學(xué)合理，序列的特異性要高。引物在反應(yīng)體系中的濃度要經(jīng)過(guò)優(yōu)化。雙重PCR及多重PCR對(duì)各引物濃度間的比例要求更嚴(yán)?；蚪MDNA制備液純度要好。其用量也并非越多越好。各種試劑小量分裝保存，避免多次凍融。dNTP濃度要優(yōu)化。

引物在反應(yīng)體系中的濃度要經(jīng)過(guò)優(yōu)化。雙重PCR及多重PCR對(duì)各退火溫度參考Tm值進(jìn)行優(yōu)化。其對(duì)PCR的成敗，非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)與否關(guān)系最大。TaqDNA聚合酶的廠牌、批號(hào)和用量均要合適。對(duì)擴(kuò)增難度較大的PCR，Mg2+濃度要適當(dāng)增加。操作者的手法也有影響，要在實(shí)踐中總結(jié)提高技術(shù)。

退火溫度參考Tm值進(jìn)行優(yōu)化。其對(duì)PCR的成敗，非特異產(chǎn)物的出熒光定量PCR行HLA-DrB1位點(diǎn)分型法的建立及與血清學(xué)方法的比較熒光定量PCR行HLA-DrB1位點(diǎn)分型法的建立及與血清學(xué)方HLA分型技術(shù)HLA（人類白細(xì)胞抗原）MHC區(qū)基因（主要組織相容性復(fù)合物基因區(qū)）高度多態(tài)性的基因區(qū)HLA分型技術(shù)HLA（人類白細(xì)胞抗原）HLA分型技術(shù)一、淋巴細(xì)胞微量細(xì)胞毒試驗(yàn)

1964年，PaulTerasaki,LA,USA二、DNA分型法優(yōu)點(diǎn)：

1.血樣不要求新鮮;2.白血病患者WBC表面抗原被破壞,只能用DNA分型法;3.結(jié)果更準(zhǔn)確可靠HLA分型技術(shù)一、淋巴細(xì)胞微量細(xì)胞毒試驗(yàn)HLA分型技術(shù)DNA-RPLP,1982PCR/SSOPCR/反向斑點(diǎn)雜交PCR/SSCPPCR/SSPPCR/SBTR-Q-PCR/SSPPCR/dHPLC等HLA分型技術(shù)DNA-RPLP,1982

在序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）技術(shù)基礎(chǔ)上，將熒光定量PCR（FQ-PCR）技術(shù)與SSP結(jié)合起來(lái)，建立了自動(dòng)化程度更高的熒光定量PCR-HLA分型技術(shù)，完成了46例尸腎供受者的HLA-DBR1分型。FQ-PCR不需走電泳，減少了污染的機(jī)會(huì)，提高了自動(dòng)化程度。同時(shí)又開(kāi)展了以DNA測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的HLA分型（SBT）技術(shù)。在序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP三、主要方法：

1、HLA血清學(xué)分型。

2、常規(guī)PCR-SSP反應(yīng)。

3、SBT分型法：

(1)PCR擴(kuò)增DRB1片段。

(2)用ABI-373型自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。

(3)測(cè)序數(shù)據(jù)分析及分型。

三、主要方法：

結(jié)果和討論一、進(jìn)行PCR-SSP法HLA-DRB1位點(diǎn)分型：結(jié)果和討論一、進(jìn)行PCR-SSP法HLA-D臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件4、熒光定量PCR技術(shù)原理：

4、熒光定量PCR技術(shù)原理：圖3、熒光定量PCR中反應(yīng)前的模板濃度與Ct值成反比圖3、熒光定量PCR中反應(yīng)前的模板濃度與Ct值成反比圖4、15R-II號(hào)樣本熒光定量分型結(jié)果圖4、15R-II號(hào)樣本熒光定量分型結(jié)果圖5、SSP分型結(jié)果與上述一致圖5、SSP分型結(jié)果與上述一致FQ-PCR分型的優(yōu)點(diǎn)：

(1)熒光定量分型法省去了電泳分析、UVP成像的操作，簡(jiǎn)化步驟，提高自動(dòng)化程度，減少了工作量。

(2)判讀結(jié)果與擴(kuò)增由儀器同時(shí)完成，節(jié)省了PCR后處理的時(shí)間，結(jié)果更客觀。

(3)將引物的特異性和探針的特異性結(jié)合，提高了準(zhǔn)確性。FQ-PCR分型的優(yōu)點(diǎn)：

(4)只需在反應(yīng)前打開(kāi)離心管一次，即可完成所有的操作，減少了污染的機(jī)會(huì)，進(jìn)一步提高了特異性和靈敏性。(5)本FQ-PCRHLADRB1配型較常規(guī)FQ-PCR減少了合成的熒光探針數(shù)量。(6)可得出起始模板拷貝數(shù)定量結(jié)果。(4)只需在反應(yīng)前打開(kāi)離心管一次，即可完成所有的操作，減少了基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用特點(diǎn)：PCR技術(shù)一問(wèn)世，首先就應(yīng)用于β—珠蛋白生成障礙性貧血等遺傳病的基因診斷。不但要查特定基因是否存在，而且要查出相應(yīng)功能基因的缺陷：突變？缺失？插入？倒位？等等。采用的技術(shù)更復(fù)雜、多樣，與檢測(cè)病毒、細(xì)菌的要求不完全相同。實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)收?；驍U(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用特點(diǎn)：基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用技術(shù)：PCR/凝膠電泳

PCR/RFLPPCR/SSCPPCR/ASO(Allile-specificoligoprobe)PCR/sequencingASA(Allile-specificAmplification)m-PCR(multiplexPCR)F-Q-PCR(Real-TimePCR)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用技術(shù)：PCR/凝膠電泳

血友病甲基因診斷劉敬忠，梁燕，王立榮，肖白，朱章菱，周艷，劉亮，張晶首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室北京朝陽(yáng)醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所血友病甲基因診斷劉敬忠，梁燕，王立榮，肖白，甲型血友病Ⅷ因子基因倒位的研究及檢測(cè)新技術(shù)：

血友病甲（HA）是常見(jiàn)的X-連鎖遺傳性出血性疾病，是由于凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因缺陷所致。約半數(shù)重型HA的患者，是由于FⅧ基因第22內(nèi)含子（IVS22）發(fā)生基因倒位所致。迄今，國(guó)際上檢測(cè)這種基因倒位都是用Southern印跡雜交技術(shù)。雖然這種技術(shù)能夠準(zhǔn)確的查出這種基因倒位，但操作步驟多，流程長(zhǎng)，出結(jié)果慢，難度大，需要DNA樣品量大以及操作放射性同位素標(biāo)記的探針等。我們從1996年開(kāi)始在國(guó)際上率先研究利用長(zhǎng)距離DNA擴(kuò)增技術(shù)（LD-PCR），替代Southern雜交進(jìn)行FⅧ基因倒位的診斷。經(jīng)過(guò)近二年的努力終獲成功，并進(jìn)行了推廣應(yīng)用。主要完成了以下幾方面工作：甲型血友病Ⅷ因子基因倒位的研究及檢測(cè)新技術(shù)：血友病甲臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件自行設(shè)計(jì)合成了長(zhǎng)距離PCR的四個(gè)引物P、Q、A、B。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度P/Q為12Kb，A/B為10Kb，P/B及A/Q為11Kb。

自行設(shè)計(jì)合成了長(zhǎng)距離PCR的四個(gè)引物P、Q、A、B。預(yù)期擴(kuò)增

四引物及三引物L(fēng)D-PCR體系的比較四引物及三引物L(fēng)D-PCR體系的比較

系統(tǒng)優(yōu)化了引物濃度，酶用量，deaza-dGTP的比例，DMSO濃度，基因組DNA的質(zhì)量和用量，退火及延伸溫度、時(shí)間，低濃度瓊脂糖凝膠電泳條件及操作方法等。使10-12KbDNA擴(kuò)增及檢測(cè)倒位終獲成功。這充分體現(xiàn)了該成果的科學(xué)性和先進(jìn)性系統(tǒng)優(yōu)化了引物濃度，酶用量，deaza-dGTP不同量模板DNA對(duì)LD-PCR的影響

1--5號(hào)的DNA量分別為0.25，0.5，0.75，1.0，1.25μg不同量模板DNA對(duì)LD-PCR的影響

1--5號(hào)的DNA量不同量deaza-dNTP對(duì)LD-PCR的影響

1--5號(hào)dNTP濃度分別為200，300，400，500，

600μM不同量deaza-dNTP對(duì)LD-PCR的影響

1--5號(hào)d

53份重型HA患者及家系成員DNA標(biāo)本，分別用經(jīng)典的Southern印跡雜交和本LD-PCR技術(shù)在雙盲條件下進(jìn)行FⅧ基因倒位檢測(cè)。兩者得出的診斷結(jié)論完全一致。表明用LD-PCR技術(shù)診斷該基因倒位，檢出攜帶者的特異性和靈敏度均達(dá)到百分之百。而且具有操作步驟較簡(jiǎn)便，需DNA量少，出結(jié)果快，不需操作放射性同位素標(biāo)記探針，在無(wú)法取得先癥者患兒血樣的情況下，也可直接查攜帶者是否攜帶倒位基因，如果是可直接做產(chǎn)前診斷等優(yōu)點(diǎn)。53份重型HA患者及家系成員DNA標(biāo)本，分別用經(jīng)典的雙盲實(shí)驗(yàn)（53份DNA）結(jié)果證明：LD-PCR可獨(dú)立用于重型HA基因倒位的檢測(cè)雙盲實(shí)驗(yàn)（53份DNA）結(jié)果證明：LD-PCR可獨(dú)立用于重型應(yīng)用實(shí)驗(yàn)成功的LD-PCR技術(shù)，對(duì)來(lái)自北京、天津、江蘇、湖北、廣西、四川、山東、福建等省市的108個(gè)重型HA患者及數(shù)目不等的家系成員進(jìn)行了檢測(cè)，共查出FⅧ基因倒位47例，占44%，與國(guó)際上用Southern雜交技術(shù)查出的基因倒位引起的HA約占重型HA的40-50%一致。另外，檢出30余位倒位基因攜帶者，為將來(lái)開(kāi)展產(chǎn)前基因診斷，杜絕新的HA患兒出生打下了基礎(chǔ)，對(duì)優(yōu)生、提高人口素質(zhì)有重要意義。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)成功的LD-PCR技術(shù)，對(duì)來(lái)自北京、天津、江蘇、湖北臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件14個(gè)DNA標(biāo)本LD-PCR電泳結(jié)果

M：λDNA/HindⅢ酶解產(chǎn)物，三條帶分別為23.1kb，9.4kb，6.6kb14個(gè)DNA標(biāo)本LD-PCR電泳結(jié)果

M：λDNA/Hind臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件美國(guó)Steve.S.Sommer去年與我們同期發(fā)表了一篇類似技術(shù)方法的摘要文章。但我們較他們有兩個(gè)顯著不同特點(diǎn)：一是我們強(qiáng)調(diào)了運(yùn)用P、Q和B這三個(gè)引物就完全可以滿足診斷的需要，省去一個(gè)引物A，減少一條10Kb擴(kuò)增帶。這條10Kb帶是多余的，且使11Kb及12Kb帶出現(xiàn)的難度增大。二是我們研究成功方法后，立即迅速應(yīng)用于患者及其家系的診斷和攜帶者檢出，現(xiàn)已達(dá)一百余家系，產(chǎn)生了很大社會(huì)效益和一定的經(jīng)濟(jì)效益，并開(kāi)始向兄弟單位推廣應(yīng)用。美國(guó)Steve.S.Sommer去年與我們同期發(fā)表了一篇類似

HA8家系PCR/BclⅠ酶解分析結(jié)果

M:pBR322/MspⅠ；0:Ⅱ-2（酶解前）擴(kuò)增帶長(zhǎng)374bp，圖中211bp和163bp為酶解后產(chǎn)物

MⅡ3Ⅰ1Ⅰ2Ⅱ1Ⅱ20

HA8家系PCR/BclⅠ酶解分析結(jié)果

M:pBR32

HA15家系St14位點(diǎn)VNTR多態(tài)基因連鎖分析結(jié)果

M:ΦX174/HaeⅢ

MⅡ1Ⅱ2Ⅱ3Ⅰ2Ⅰ1HA15家系St14位點(diǎn)VNTR多態(tài)基因連鎖分析結(jié)果

MHA18家系內(nèi)含子13（A）和內(nèi)含子22（B）可變串聯(lián)重復(fù)數(shù)目多態(tài)性分析結(jié)果

A為內(nèi)含子13中（CA）重復(fù)分型結(jié)果：Ⅰ-1為21/-，Ⅱ-2為21/20，Ⅰ-2為22/20，Ⅱ-1為21/-，Ⅲ-1為21/21，她是攜帶者；B為內(nèi)含子22中（GT）（AG）重復(fù)分型結(jié)果：Ⅰ-1為26/-，Ⅱ-2為26/26，Ⅰ-2為27/26，Ⅲ-1為26/25，Ⅱ-1為25/-

Ⅰ1Ⅱ2Ⅰ2Ⅲ1Ⅱ1HA18家系內(nèi)含子13（A）和內(nèi)含子22（B）可變串聯(lián)重復(fù)數(shù)血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷劉敬忠首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室北京朝陽(yáng)醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷劉敬忠血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷缺失型α-地中海貧血基因診斷技術(shù)的改進(jìn)劉敬忠，周桔，王立榮，周艷首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室北京朝陽(yáng)醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所缺失型α-地中海貧血基因診斷技術(shù)的改進(jìn)劉敬忠，周桔，王立榮，臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件臨床診斷Bart’s（--/--）基因型臨床分型靜止型（-/）--SEA-3.7-4.2標(biāo)準(zhǔn)型（--/）HbH病（--/-）臨床診斷Bart’s基因型臨床分型靜止型標(biāo)準(zhǔn)型HbH病

問(wèn)題：PCR技術(shù)可重復(fù)性差,難度大，

結(jié)果判斷復(fù)雜，

引物設(shè)計(jì)有待改進(jìn)

措施：1、重新設(shè)計(jì)引物

2、改進(jìn)和優(yōu)化PCR反應(yīng)體系

酶、deaza-dGTP、DMSO、

退火溫度、gradientgel等

問(wèn)題：PCR技術(shù)可重復(fù)性差,難度大，

A’B’C’A’B’C’G’ES1S2S3M1123456M2789M2101112M31.2%/2.0%濃度梯度瓊脂糖凝膠1，4，正常（αα/αα）；2，5，-3.7/αα；3，6，-3.7/--SEA；7，αα/αα；8，-4.2/αα；9，12，-4.2/--SEA；10，αα/αα；11，--SEA/--SEA；12，9，-4.2/--SEA1.58Kb287bp173bp1.9Kb1.7Kb

A’B’C’A’B’C根據(jù)本試劑盒三個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜作出基因診斷根據(jù)本試劑盒三個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜作出基因診斷單管四重PCR試劑盒檢測(cè)α-珠蛋白的基因三種缺失類型及引物設(shè)計(jì)示意圖

單管四重PCR試劑盒檢測(cè)α-珠蛋白的基因10種DNA的四重PCR圖譜10種DNA的四重PCR圖譜25個(gè)海南黎族人DNA的擴(kuò)增圖譜25個(gè)海南黎族人DNA的擴(kuò)增圖譜

20個(gè)廣西、廣東α-地貧68標(biāo)本的多重PCR擴(kuò)增圖20個(gè)廣西、廣東α-地貧68標(biāo)本的多重PCR擴(kuò)增圖根據(jù)圖譜作出診斷

擴(kuò)增帶電電泳圖

及診斷序號(hào)0.8Kb1.6Kb1.9Kb1.5Kb診斷1--+-正常(αα/αα);但不排除αα/αTα的可能性2-++--α3.7攜帶者(-α3.7/αα)3--++-α4.2攜帶者(-α4.2/αα)

4-+---α3.7純合子(-α3.7/-α3.7)

5---+-α4.2純合子(-α4.2/-α4.2)6-+-+-α3.7/-α4.2雙重雜合子

7+-----SEA/--SEA巴氏水腫胎兒

8++----SEA/-α3.7(缺失型HbH病)

9+--+--SEA/-α4.2(缺失型HbH病)

10+-+---SEA/αα（--SEA攜帶者）--SEA/αTα(非缺失型HbH病)

11----PCR失敗,查找原因,重復(fù)作

根據(jù)圖譜作出診斷擴(kuò)增帶電0.8Kb1.6Kb1.DNA的提取方法：鹽析法酚-氯仿抽提法

Chelex快速法DNA的提取方法：0.8kb質(zhì)粒靈敏度檢測(cè)0.8kb質(zhì)粒靈敏度檢測(cè)0.8kb穩(wěn)定性結(jié)果:1#-a3.7/--2#-a4.2/--3#aa/--4#-a3.7/-a4.25#aa/--0小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)96小時(shí)0.8kb穩(wěn)定性結(jié)果:1#-a3.7/--2#31例陽(yáng)性標(biāo)本29例陽(yáng)性標(biāo)本60例陰性標(biāo)本31例陽(yáng)性標(biāo)本B7B12，E8B11B7,B11,B12:-a3.7/--

1#1.0ul2#2.0ul3#3.0ul4例可疑標(biāo)本的鑒定B7B12，E8B11B7,B11,B12:-a3.206bp替代109bp10-8=33拷貝靈敏度206bp替代109bp10-8=33206bp標(biāo)準(zhǔn)曲線206bp標(biāo)準(zhǔn)曲線靈敏度靈敏度靈敏度436bp試劑盒檢測(cè)結(jié)果0.2ug0.1ug0.05ug0.02ug0.01ug

靈敏度436bp試劑盒檢測(cè)結(jié)果0.2ug平行性平行性0小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)96小時(shí)436bp穩(wěn)定性結(jié)果1#-a3.7/--2#-a4.2/--3#-a3.7/-a4.24#-a4.2/-a4.25#--/--0小時(shí)60例陽(yáng)性標(biāo)本及4例陰性標(biāo)本60例陽(yáng)性標(biāo)本及4例陰性標(biāo)本1.5kb試劑盒引物優(yōu)化1#G/E+22#G’+2/4.2R3#G/4.2R4#G’+2/E+21.5kb試劑盒引物優(yōu)化1#G/E+22#GSYBR-PCR/D.C.技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):RealTime-PCR的優(yōu)點(diǎn)………….不需探針易優(yōu)化等SYBR-PCR/D.C.技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):謝謝！謝謝！后面內(nèi)容直接刪除就行資料可以編輯修改使用資料可以編輯修改使用資料僅供參考，實(shí)際情況實(shí)際分析后面內(nèi)容直接刪除就行主要經(jīng)營(yíng)：課件設(shè)計(jì)，文檔制作，網(wǎng)絡(luò)軟件設(shè)計(jì)、圖文設(shè)計(jì)制作、發(fā)布廣告等秉著以優(yōu)質(zhì)的服務(wù)對(duì)待每一位客戶，做到讓客戶滿意！致力于數(shù)據(jù)挖掘，合同簡(jiǎn)歷、論文寫作、PPT設(shè)計(jì)、計(jì)劃書、策劃案、學(xué)習(xí)課件、各類模板等方方面面，打造全網(wǎng)一站式需求主要經(jīng)營(yíng)：課件設(shè)計(jì)，文檔制作，網(wǎng)絡(luò)軟件設(shè)計(jì)、圖文設(shè)計(jì)制作、發(fā)感謝您的觀看和下載Theusercandemonstrateonaprojectororcomputer,orprintthepresentationandmakeitintoafilmtobeusedinawiderfield感謝您的觀看和下載Theusercandemonstr后面內(nèi)容直接刪除就行資料可以編輯修改使用資料可以編輯修改使用資料僅供參考，實(shí)際情況實(shí)際分析后面內(nèi)容直接刪除就行主要經(jīng)營(yíng)：課件設(shè)計(jì)，文檔制作，網(wǎng)絡(luò)軟件設(shè)計(jì)、圖文設(shè)計(jì)制作、發(fā)布廣告等秉著以優(yōu)質(zhì)的服務(wù)對(duì)待每一位客戶，做到讓客戶滿意！致力于數(shù)據(jù)挖掘，合同簡(jiǎn)歷、論文寫作、PPT設(shè)計(jì)、計(jì)劃書、策劃案、學(xué)習(xí)課件、各類模板等方方面面，打造全網(wǎng)一站式需求主要經(jīng)營(yíng)：課件設(shè)計(jì)，文檔制作，網(wǎng)絡(luò)軟件設(shè)計(jì)、圖文設(shè)計(jì)制作、發(fā)感謝您的觀看和下載Theusercandemonstrateonaprojectororcomputer,orprintthepresentationandmakeitintoafilmtobeusedinawiderfield感謝您的觀看和下載Theusercandemonstr基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用劉敬忠首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室

北京朝陽(yáng)醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用劉敬忠臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件中心法則

復(fù)轉(zhuǎn)錄翻譯

DNARNA蛋白質(zhì)

蛋白

制

反轉(zhuǎn)錄

糖蛋白脂蛋白酶類激素細(xì)胞因子

中心法則復(fù)轉(zhuǎn)錄翻譯基因重組技術(shù)

基因探針技術(shù)

基因重組藥物基因診斷基因治療

PKU

尿毒癥（口服artificialcells)基因重組技術(shù)

基因探針技術(shù)基因重組基因診斷

運(yùn)用基因探針，PCR技術(shù)等探測(cè)特定靶基因的存在與否，或是否有基因突變等缺陷，從而對(duì)疾病或病原體感染作出診斷叫基因診斷。

基因型表型基臨血生細(xì)影病因床清化菌像理診學(xué)學(xué)學(xué)學(xué)學(xué)斷診診診診診診斷斷斷斷斷斷基因診斷運(yùn)用基因探針，PCR技術(shù)等探測(cè)特基因診斷的特點(diǎn)靈敏度高（早期）特異性強(qiáng)操作簡(jiǎn)便取材大多不受組織器官限制可進(jìn)行早期診斷，癥狀前診斷及產(chǎn)前診斷檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)病毒等微生物時(shí)不需培養(yǎng)基因診斷的特點(diǎn)靈敏度高（早期）聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction（PCR）KaryB.Mullis1984年問(wèn)世,成為分子生物學(xué)和生命科學(xué)發(fā)展史上的里程碑1993榮獲諾貝爾獎(jiǎng)

Mendocin128號(hào)公路附近一棵七葉樹(shù)下的突發(fā)奇想專利官司之戰(zhàn):DuPont與Cetus對(duì)薄公堂聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReacti

PCR原理示意圖PCR原理示意圖PCR技術(shù)的應(yīng)用一、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用二、遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷：血友病、地中海貧血、DMD、PKU等等三、細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體等四、病毒五、白血病、腫瘤六、骨髓移植、器官移植供體配型選擇七、法醫(yī)學(xué)八、動(dòng)植物學(xué)九、古人類學(xué)、古生物學(xué)

PCR技術(shù)的應(yīng)用一、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件PCR原理示意圖PCR熱變性：從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提取的DNA約1ug，在含有適當(dāng)緩沖液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反應(yīng)混合物中，在94℃下熱變性4分鐘，使之解為單鏈。

熱變性：從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提取的DNA約1ug，退火：然后置反應(yīng)混合物于55℃，使引物與解為單鏈的DNA上互補(bǔ)序列雜交在一起，稱之為退火。并迅速加入2單位耐熱的TaqDNA聚合酶，混勻、離心10秒鐘。為防止在整個(gè)PCR過(guò)程中，水份的蒸發(fā)影響PCR效果，通常加入35ul石蠟油封蓋液面。退火：然后置反應(yīng)混合物于55℃，使引物與解為單鏈的DNA上互引物延伸：置上述反應(yīng)混合物于70℃水浴中1-2分鐘，在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs為原料（底物），從引物的3’端A開(kāi)始,沿著5’→3’的方向，合成每條模板的互補(bǔ)鏈，此稱引物延伸。結(jié)果，DNA拷貝數(shù)增加了一倍。引物延伸：置上述反應(yīng)混合物于70℃水浴中1-2分鐘，在DNA接著，將上述熱變性—退火—引物延伸（稱為一個(gè)循環(huán)）反復(fù)進(jìn)行30-35次。只是熱變性的時(shí)間縮短為1分鐘左右。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，DNA拷貝數(shù)便增加一倍（×2）。因此，如進(jìn)行n次循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加2n倍！進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加225倍，即上百萬(wàn)倍。在瓊脂糖凝膠電泳上可看到特異性長(zhǎng)度的擴(kuò)增帶?？梢?jiàn)PCR之所以高速擴(kuò)增的關(guān)鍵是因?yàn)槊看涡潞铣傻腄NA鏈在后來(lái)的循環(huán)中都可以作模板，猶如滾雪球，數(shù)量迅速增加。接著，將上述熱變性—退火—引物延伸（稱為一個(gè)循環(huán)）反復(fù)進(jìn)行3如果引物5’端有幾個(gè)與模板DNA不配對(duì)的堿基，仍可能與模板DNA退火、延伸，對(duì)PCR效果影響不大。這一特點(diǎn)，可使PCR產(chǎn)物兩端帶上限制酶的Linker，或造成DNA順序的缺失、插入、堿基替代等。大大增大了PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍。如果引物5’端有幾個(gè)與模板DNA不配對(duì)的堿基，仍可能與模板D影響PCR效果的重要因素及注意事項(xiàng)：PCR技術(shù)的原理似乎非常簡(jiǎn)單明了，PCR反應(yīng)的操作也并不復(fù)雜；但要取得好的結(jié)果和良好的可重復(fù)性并非易事。必須徹底弄通其分子生物學(xué)的奧妙之處，并把握其各種影響因素，規(guī)范操作。以下列出影響PCR擴(kuò)增效果的主要因素影響PCR效果的重要因素及注意事項(xiàng)：引物設(shè)計(jì)一定要科學(xué)合理，序列的特異性要高。長(zhǎng)度一般在18-25個(gè)堿基，Tm值可按公式（G+C總數(shù)x4）+（A+T總數(shù)x2）（℃）估算。盡可能避開(kāi)4個(gè)以上G或C等相同堿基串聯(lián)重復(fù)。盡可能避免引物內(nèi)部形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物之間形成二聚體（Dimer）的可能性。G、C與A、T的比例盡可能1:1左右。同一反應(yīng)管中的引物（甚至同一個(gè)Lab的所有引物）Tm值設(shè)計(jì)的相同。引物設(shè)計(jì)一定要科學(xué)合理，序列的特異性要高。引物在反應(yīng)體系中的濃度要經(jīng)過(guò)優(yōu)化。雙重PCR及多重PCR對(duì)各引物濃度間的比例要求更嚴(yán)?；蚪MDNA制備液純度要好。其用量也并非越多越好。各種試劑小量分裝保存，避免多次凍融。dNTP濃度要優(yōu)化。

引物在反應(yīng)體系中的濃度要經(jīng)過(guò)優(yōu)化。雙重PCR及多重PCR對(duì)各退火溫度參考Tm值進(jìn)行優(yōu)化。其對(duì)PCR的成敗，非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)與否關(guān)系最大。TaqDNA聚合酶的廠牌、批號(hào)和用量均要合適。對(duì)擴(kuò)增難度較大的PCR，Mg2+濃度要適當(dāng)增加。操作者的手法也有影響，要在實(shí)踐中總結(jié)提高技術(shù)。

退火溫度參考Tm值進(jìn)行優(yōu)化。其對(duì)PCR的成敗，非特異產(chǎn)物的出熒光定量PCR行HLA-DrB1位點(diǎn)分型法的建立及與血清學(xué)方法的比較熒光定量PCR行HLA-DrB1位點(diǎn)分型法的建立及與血清學(xué)方HLA分型技術(shù)HLA（人類白細(xì)胞抗原）MHC區(qū)基因（主要組織相容性復(fù)合物基因區(qū)）高度多態(tài)性的基因區(qū)HLA分型技術(shù)HLA（人類白細(xì)胞抗原）HLA分型技術(shù)一、淋巴細(xì)胞微量細(xì)胞毒試驗(yàn)

1964年，PaulTerasaki,LA,USA二、DNA分型法優(yōu)點(diǎn)：

1.血樣不要求新鮮;2.白血病患者WBC表面抗原被破壞,只能用DNA分型法;3.結(jié)果更準(zhǔn)確可靠HLA分型技術(shù)一、淋巴細(xì)胞微量細(xì)胞毒試驗(yàn)HLA分型技術(shù)DNA-RPLP,1982PCR/SSOPCR/反向斑點(diǎn)雜交PCR/SSCPPCR/SSPPCR/SBTR-Q-PCR/SSPPCR/dHPLC等HLA分型技術(shù)DNA-RPLP,1982

在序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）技術(shù)基礎(chǔ)上，將熒光定量PCR（FQ-PCR）技術(shù)與SSP結(jié)合起來(lái)，建立了自動(dòng)化程度更高的熒光定量PCR-HLA分型技術(shù)，完成了46例尸腎供受者的HLA-DBR1分型。FQ-PCR不需走電泳，減少了污染的機(jī)會(huì)，提高了自動(dòng)化程度。同時(shí)又開(kāi)展了以DNA測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的HLA分型（SBT）技術(shù)。在序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP三、主要方法：

1、HLA血清學(xué)分型。

2、常規(guī)PCR-SSP反應(yīng)。

3、SBT分型法：

(1)PCR擴(kuò)增DRB1片段。

(2)用ABI-373型自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。

(3)測(cè)序數(shù)據(jù)分析及分型。

三、主要方法：

結(jié)果和討論一、進(jìn)行PCR-SSP法HLA-DRB1位點(diǎn)分型：結(jié)果和討論一、進(jìn)行PCR-SSP法HLA-D臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件4、熒光定量PCR技術(shù)原理：

4、熒光定量PCR技術(shù)原理：圖3、熒光定量PCR中反應(yīng)前的模板濃度與Ct值成反比圖3、熒光定量PCR中反應(yīng)前的模板濃度與Ct值成反比圖4、15R-II號(hào)樣本熒光定量分型結(jié)果圖4、15R-II號(hào)樣本熒光定量分型結(jié)果圖5、SSP分型結(jié)果與上述一致圖5、SSP分型結(jié)果與上述一致FQ-PCR分型的優(yōu)點(diǎn)：

(1)熒光定量分型法省去了電泳分析、UVP成像的操作，簡(jiǎn)化步驟，提高自動(dòng)化程度，減少了工作量。

(2)判讀結(jié)果與擴(kuò)增由儀器同時(shí)完成，節(jié)省了PCR后處理的時(shí)間，結(jié)果更客觀。

(3)將引物的特異性和探針的特異性結(jié)合，提高了準(zhǔn)確性。FQ-PCR分型的優(yōu)點(diǎn)：

(4)只需在反應(yīng)前打開(kāi)離心管一次，即可完成所有的操作，減少了污染的機(jī)會(huì)，進(jìn)一步提高了特異性和靈敏性。(5)本FQ-PCRHLADRB1配型較常規(guī)FQ-PCR減少了合成的熒光探針數(shù)量。(6)可得出起始模板拷貝數(shù)定量結(jié)果。(4)只需在反應(yīng)前打開(kāi)離心管一次，即可完成所有的操作，減少了基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用特點(diǎn)：PCR技術(shù)一問(wèn)世，首先就應(yīng)用于β—珠蛋白生成障礙性貧血等遺傳病的基因診斷。不但要查特定基因是否存在，而且要查出相應(yīng)功能基因的缺陷：突變？缺失？插入？倒位？等等。采用的技術(shù)更復(fù)雜、多樣，與檢測(cè)病毒、細(xì)菌的要求不完全相同。實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)收?；驍U(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用特點(diǎn)：基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用技術(shù)：PCR/凝膠電泳

PCR/RFLPPCR/SSCPPCR/ASO(Allile-specificoligoprobe)PCR/sequencingASA(Allile-specificAmplification)m-PCR(multiplexPCR)F-Q-PCR(Real-TimePCR)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用技術(shù)：PCR/凝膠電泳

血友病甲基因診斷劉敬忠，梁燕，王立榮，肖白，朱章菱，周艷，劉亮，張晶首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室北京朝陽(yáng)醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所血友病甲基因診斷劉敬忠，梁燕，王立榮，肖白，甲型血友?、蜃踊虻刮坏难芯考皺z測(cè)新技術(shù)：

血友病甲（HA）是常見(jiàn)的X-連鎖遺傳性出血性疾病，是由于凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因缺陷所致。約半數(shù)重型HA的患者，是由于FⅧ基因第22內(nèi)含子（IVS22）發(fā)生基因倒位所致。迄今，國(guó)際上檢測(cè)這種基因倒位都是用Southern印跡雜交技術(shù)。雖然這種技術(shù)能夠準(zhǔn)確的查出這種基因倒位，但操作步驟多，流程長(zhǎng)，出結(jié)果慢，難度大，需要DNA樣品量大以及操作放射性同位素標(biāo)記的探針等。我們從1996年開(kāi)始在國(guó)際上率先研究利用長(zhǎng)距離DNA擴(kuò)增技術(shù)（LD-PCR），替代Southern雜交進(jìn)行FⅧ基因倒位的診斷。經(jīng)過(guò)近二年的努力終獲成功，并進(jìn)行了推廣應(yīng)用。主要完成了以下幾方面工作：甲型血友?、蜃踊虻刮坏难芯考皺z測(cè)新技術(shù)：血友病甲臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件自行設(shè)計(jì)合成了長(zhǎng)距離PCR的四個(gè)引物P、Q、A、B。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度P/Q為12Kb，A/B為10Kb，P/B及A/Q為11Kb。

自行設(shè)計(jì)合成了長(zhǎng)距離PCR的四個(gè)引物P、Q、A、B。預(yù)期擴(kuò)增

四引物及三引物L(fēng)D-PCR體系的比較四引物及三引物L(fēng)D-PCR體系的比較

系統(tǒng)優(yōu)化了引物濃度，酶用量，deaza-dGTP的比例，DMSO濃度，基因組DNA的質(zhì)量和用量，退火及延伸溫度、時(shí)間，低濃度瓊脂糖凝膠電泳條件及操作方法等。使10-12KbDNA擴(kuò)增及檢測(cè)倒位終獲成功。這充分體現(xiàn)了該成果的科學(xué)性和先進(jìn)性系統(tǒng)優(yōu)化了引物濃度，酶用量，deaza-dGTP不同量模板DNA對(duì)LD-PCR的影響

1--5號(hào)的DNA量分別為0.25，0.5，0.75，1.0，1.25μg不同量模板DNA對(duì)LD-PCR的影響

1--5號(hào)的DNA量不同量deaza-dNTP對(duì)LD-PCR的影響

1--5號(hào)dNTP濃度分別為200，300，400，500，

600μM不同量deaza-dNTP對(duì)LD-PCR的影響

1--5號(hào)d

53份重型HA患者及家系成員DNA標(biāo)本，分別用經(jīng)典的Southern印跡雜交和本LD-PCR技術(shù)在雙盲條件下進(jìn)行FⅧ基因倒位檢測(cè)。兩者得出的診斷結(jié)論完全一致。表明用LD-PCR技術(shù)診斷該基因倒位，檢出攜帶者的特異性和靈敏度均達(dá)到百分之百。而且具有操作步驟較簡(jiǎn)便，需DNA量少，出結(jié)果快，不需操作放射性同位素標(biāo)記探針，在無(wú)法取得先癥者患兒血樣的情況下，也可直接查攜帶者是否攜帶倒位基因，如果是可直接做產(chǎn)前診斷等優(yōu)點(diǎn)。53份重型HA患者及家系成員DNA標(biāo)本，分別用經(jīng)典的雙盲實(shí)驗(yàn)（53份DNA）結(jié)果證明：LD-PCR可獨(dú)立用于重型HA基因倒位的檢測(cè)雙盲實(shí)驗(yàn)（53份DNA）結(jié)果證明：LD-PCR可獨(dú)立用于重型應(yīng)用實(shí)驗(yàn)成功的LD-PCR技術(shù)，對(duì)來(lái)自北京、天津、江蘇、湖北、廣西、四川、山東、福建等省市的108個(gè)重型HA患者及數(shù)目不等的家系成員進(jìn)行了檢測(cè)，共查出FⅧ基因倒位47例，占44%，與國(guó)際上用Southern雜交技術(shù)查出的基因倒位引起的HA約占重型HA的40-50%一致。另外，檢出30余位倒位基因攜帶者，為將來(lái)開(kāi)展產(chǎn)前基因診斷，杜絕新的HA患兒出生打下了基礎(chǔ)，對(duì)優(yōu)生、提高人口素質(zhì)有重要意義。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)成功的LD-PCR技術(shù)，對(duì)來(lái)自北京、天津、江蘇、湖北臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件14個(gè)DNA標(biāo)本LD-PCR電泳結(jié)果

M：λDNA/HindⅢ酶解產(chǎn)物，三條帶分別為23.1kb，9.4kb，6.6kb14個(gè)DNA標(biāo)本LD-PCR電泳結(jié)果

M：λDNA/Hind臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件美國(guó)Steve.S.Sommer去年與我們同期發(fā)表了一篇類似技術(shù)方法的摘要文章。但我們較他們有兩個(gè)顯著不同特點(diǎn)：一是我們強(qiáng)調(diào)了運(yùn)用P、Q和B這三個(gè)引物就完全可以滿足診斷的需要，省去一個(gè)引物A，減少一條10Kb擴(kuò)增帶。這條10Kb帶是多余的，且使11Kb及12Kb帶出現(xiàn)的難度增大。二是我們研究成功方法后，立即迅速應(yīng)用于患者及其家系的診斷和攜帶者檢出，現(xiàn)已達(dá)一百余家系，產(chǎn)生了很大社會(huì)效益和一定的經(jīng)濟(jì)效益，并開(kāi)始向兄弟單位推廣應(yīng)用。美國(guó)Steve.S.Sommer去年與我們同期發(fā)表了一篇類似

HA8家系PCR/BclⅠ酶解分析結(jié)果

M:pBR322/MspⅠ；0:Ⅱ-2（酶解前）擴(kuò)增帶長(zhǎng)374bp，圖中211bp和163bp為酶解后產(chǎn)物

MⅡ3Ⅰ1Ⅰ2Ⅱ1Ⅱ20

HA8家系PCR/BclⅠ酶解分析結(jié)果

M:pBR32

HA15家系St14位點(diǎn)VNTR多態(tài)基因連鎖分析結(jié)果

M:ΦX174/HaeⅢ

MⅡ1Ⅱ2Ⅱ3Ⅰ2Ⅰ1HA15家系St14位點(diǎn)VNTR多態(tài)基因連鎖分析結(jié)果

MHA18家系內(nèi)含子13（A）和內(nèi)含子22（B）可變串聯(lián)重復(fù)數(shù)目多態(tài)性分析結(jié)果

A為內(nèi)含子13中（CA）重復(fù)分型結(jié)果：Ⅰ-1為21/-，Ⅱ-2為21/20，Ⅰ-2為22/20，Ⅱ-1為21/-，Ⅲ-1為21/21，她是攜帶者；B為內(nèi)含子22中（GT）（AG）重復(fù)分型結(jié)果：Ⅰ-1為26/-，Ⅱ-2為26/26，Ⅰ-2為27/26，Ⅲ-1為26/25，Ⅱ-1為25/-

Ⅰ1Ⅱ2Ⅰ2Ⅲ1Ⅱ1HA18家系內(nèi)含子13（A）和內(nèi)含子22（B）可變串聯(lián)重復(fù)數(shù)血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷劉敬忠首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室北京朝陽(yáng)醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷劉敬忠血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷缺失型α-地中海貧血基因診斷技術(shù)的改進(jìn)劉敬忠，周桔，王立榮，周艷首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室北京朝陽(yáng)醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所缺失型α-地中海貧血基因診斷技術(shù)的改進(jìn)劉敬忠，周桔，王立榮，臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件臨床診斷Bart’s（--/--）基因型臨床分型靜止型（-/）--SEA-3.7-4.2標(biāo)準(zhǔn)型（--/）HbH病（--/-）臨床診斷Bart’s基因型臨床分型靜止型標(biāo)準(zhǔn)型HbH病

問(wèn)題：PCR技術(shù)可重復(fù)性差,難度大，

結(jié)果判斷復(fù)雜，

引物設(shè)計(jì)有待改進(jìn)

措施：1、重新設(shè)計(jì)引物

2、改進(jìn)和優(yōu)化PCR反應(yīng)體系

酶、deaza-dGTP、DMSO、

退火溫度、gradientgel等

問(wèn)題：PCR技術(shù)可重復(fù)性差,難度大，

A’B’C’A’B’C’G’ES1S2S3M1123456M2789M2101112M31.2%/2.0%濃度梯度瓊脂糖凝膠1，4，正常（αα/αα）；2，5，-3.7/αα；3，6，-3.7/--SEA；7，αα/αα；8，-4.2/αα；9，12，-4.2/--SEA；10，αα/αα；11，--SEA/--SEA；12，9，-4.2/--SEA1.58Kb287bp173bp1.9Kb1.7Kb

A’B’C’A’B’C根據(jù)本試劑盒三個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜作出基因診斷根據(jù)本試劑盒三個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜作出基因診斷單管四重PCR試劑盒檢測(cè)α-珠蛋白的基因三種缺失類型及引物設(shè)計(jì)示意圖

單管四重PCR試劑盒檢測(cè)α-珠蛋白的基因10種DNA的四重PCR圖譜10種DNA的四重PCR圖譜25個(gè)海南黎族人DNA的擴(kuò)增圖譜25個(gè)海南黎族人DNA的擴(kuò)增圖譜

20個(gè)廣西、廣東α-地貧158標(biāo)本的多重PCR擴(kuò)增圖20個(gè)廣西、廣東α-地貧68標(biāo)本的多重PCR擴(kuò)增圖根據(jù)圖譜作出診斷

擴(kuò)增帶電電泳圖

及診斷序號(hào)0.8Kb1.6Kb1.9Kb1.5Kb診斷1--+-正常(αα/αα);但不排除αα/αTα的可能性2-++--α3.7攜帶者(-α3.7/αα)3--++-α4.2攜帶者(-α4.2/αα)

4-+---α3.7純合子(-α3.7/-α3.7)

5--