化學應(yīng)激對大蒜培養(yǎng)細胞SOD的誘導

化學應(yīng)激對大蒜培養(yǎng)細胞SOD的誘導

摘要采用化學誘導劑對大蒜培養(yǎng)細胞的超氧化物歧物酶(SOD)進行了體外誘導，供試誘導劑均能使SOD活力顯著升高，誘導能力的大小依次為甲基紫精>水楊酸>甲基萘醌。水楊酸與冷脅迫或熱休克復合處理比冷脅迫或熱休克單獨處理的SOD活力分別提高了1.5～2倍和2～4倍。結(jié)果表明水楊酸誘導的SOD以Mn.SOD和Fe.SOD為主，僅有少量Cu/Zn.SOD。

關(guān)鍵詞化學應(yīng)激；水楊酸；自由基引發(fā)劑；SOD；誘導InductionofSODbyChemicalStress

inCulturedGarlicCells

ZengQingping,GuoYong1

(TropicalMedicineInstitute,GuangzhouUniversityofTraditionalChinese

Medicine,Guangzhou510407,1DepartmentofBiotechnology,

SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510641)AbstractInductionofsuperoxidedismutase(SOD)inculturedgarliccellswasperformedinvitrobyusingseveralkindsofchemicalinducers.TheresultsshowedthatallinducersinpresentinvestigationdramaticallyincreasedSODactivity,andthepotentialforinductionwasthesequenceasfollowing:methylviologen>salicylicacid>menodione.ItwasalsofoundthatSODactivitywasincreasedas1.5～2foldand2～4fold,respectively,inthecombinedtreatmentofsalicylicacidwithchillingorwithheatshockcomparedasthosewithasingletreatmentbychillingorbyheatshockalone.Thesalicylicacid-inducedSODwasmainlyFe.SODandMn.SOD,andonlyatraceofCu/Zn.SOD.

KeyWordsChemicalstress,Salicylicacid,Freeradicalgenerator,SOD,Induction有氧代謝過程以及微體脂肪酸β-氧化和乙醛酸體光呼吸時的電子傳遞、外界環(huán)境污染(輻射，毒素，化學試劑)的影響以及感染和衰老等生理原因，都將使細胞內(nèi)部產(chǎn)生大量的活性氧自由基［1］。若這些自由基得不到及時清除，則可啟動細胞自殺程序而發(fā)生細胞凋亡［2］。然而，細胞通過產(chǎn)生非酶類抗氧化劑和合成抗氧化酶，可以有效地清除自由基。在一定范圍內(nèi)，氧化應(yīng)激程度、抗氧化劑含量、細胞活力之間存在著一致關(guān)系。為了掌握植物細胞在化學污染環(huán)境中的抗氧化酶合成動態(tài)，我們采用體外化學應(yīng)激模擬對大蒜培養(yǎng)細胞SOD的誘導進行了探討。1材料

白皮大蒜(AlliumsativumL.),廣東產(chǎn)；腎上腺素購自瑞典Fulka公司，甲基萘醌(維生素K3)購自美國Sigma公司，甲基紫精購自英國Zeneca公司，培養(yǎng)基所需化學試劑均為市售國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。2方法

2.1大蒜細胞培養(yǎng)

將大蒜愈傷組織置于含2mg/L2，4-D和0.1mg/LKT的MS培養(yǎng)基中，25℃，1200Lx，12h/d，每3周繼代1次。取3周齡愈傷組織，接種于25mlMS液體培養(yǎng)基中，25℃，130r/min振蕩培養(yǎng)。

2.2化學應(yīng)激處理

將不同濃度的化學誘導劑溶液直接加至固體培養(yǎng)基中或?qū)腋〖毎D(zhuǎn)入用液體培養(yǎng)基配制的不同濃度的誘導劑溶液中，25℃，光下(1200Lx)處理不同時間。

2.3SOD活力測定與SOD類型鑒別

見參考文獻［3］。3結(jié)果

3.1化學誘導劑對培養(yǎng)細胞SOD誘導的動力學

3.1.1水楊酸濃度及處理時間與SOD活力的關(guān)系以不同濃度水楊酸處理大蒜懸浮培養(yǎng)細胞，并于24h后測定SOD活力。經(jīng)0.5～1.0mmol/L水楊酸處理后，細胞的SOD活力顯著升高，并且作用濃度與誘導效果呈現(xiàn)一定的依存性。

用1.0mmol/L水楊酸短時間(2～6h)或長時間(1～3d)處理大蒜懸浮培養(yǎng)細胞后，分別測定SOD活力。水楊酸短時間處理的細胞，其SOD活力逐漸增大，于4h時達到峰值，SOD活力為對照的1.7倍，隨后有所下降。水楊酸長時間處理細胞的SOD活力也顯著升高，但與短時間處理的差別不大，SOD活力為對照的1.7～1.9倍。

3.1.2甲基紫精濃度與SOD活力的關(guān)系

以不同濃度的甲基紫精處理大蒜懸浮培養(yǎng)細胞，并于24h后測定其SOD活力。在0.05mmol/L濃度以下，其變化趨勢為隨濃度升高活力增強，最高可達2.4倍。

3.1.3甲基萘醌濃度與SOD活力的關(guān)系

以不同濃度的甲基萘醌處理大蒜懸浮培養(yǎng)細胞，并于24h后測定SOD活力。低濃度甲基萘醌對SOD活力的誘導作用較強。隨著濃度的逐漸增大，SOD活力不斷下降。

3.2水楊酸對物理應(yīng)激反應(yīng)的累加效應(yīng)

3.2.1水楊酸與冷脅迫的共同作用在大蒜懸浮培養(yǎng)細胞中加入終濃度為0.5mmol/L水楊酸，置于4℃冰箱中，定時取樣測定SOD活力，判斷水楊酸對冷脅迫誘導是否具有強化作用，結(jié)果如1所示。Treatment1：1.25℃，light,waterlogging

2.25℃，light

3.4℃，dark

Treatment2：25℃，light,salicylicacid

Treatment3：4℃，salicylicacid

Treatment4：4℃，waterlogging

Treatment5：4℃，light,waterlogging冷脅迫細胞受水楊酸促進可以顯著提高SOD活力，長時間光照處理比黑暗處理高2.08倍。

3.2.2水楊酸與熱休克的相互作用在大蒜懸浮培養(yǎng)細胞中加入終濃度為0.5mmol/L水楊酸，置于40℃恒溫水浴中，定時取樣測定SOD活力，確認水楊酸對熱休克誘導的強化作用，結(jié)果如2所示。Treatment1:1.25℃，light,waterlogging

2.25℃，light

3.4℃，dark

Treatment2：25℃，light,salicylicacid

Treatment3：40℃，salicylicacid

Treatment4：40℃，waterlogging

Treatment5：40℃，light,waterlogging正如冷脅迫一樣，熱休克細胞也可受水楊酸促進而誘導較高的SOD活力，并以光照及長時間處理效果最好，比長時間黑暗處理高3.65倍。

3.3水楊酸誘導SOD同工酶的分類

將水楊酸誘導的SOD用不同濃度的KCN的氯仿-乙醇處理，觀察其對SOD活力的影響，用于判斷水楊酸誘導SOD所屬的類型，結(jié)果如表1所示。Tab1Inhibitionofsalicylicacid-induced

SODactivitybyspecificinhibitorsInhibition(%)Noinhibitor00.05mmol/LKCN7.310.5mmol/LKCN5.835%chloroform-ethnol27.7015%chloroform-ethnol82.33

氯仿-乙醇可以有效地抑制水楊酸誘導產(chǎn)生的SOD，其抑制程度已達原活力的4/5，進一步證實這種SOD主要屬于Mn.SOD和Fe.SOD。4討論

光抑制、缺氧、缺水、外來物污染以及病菌或病毒感染等多種氧化應(yīng)激均能誘導SOD活力增高。就化學誘導劑而言，以甲基紫精(即除草劑“百草枯”)研究較多。甲基紫精具有很強的氧化還原活性，它通過誘發(fā)自由基生成而使植物產(chǎn)生廣泛的氧化損傷。在光照條件下，甲基紫精對菜豆的各種類型SOD均有強烈誘導作用［4］，而在黑暗條件下，甲基紫精可誘導玉米葉綠體Cu/ZnSOD的合成［5］。

本研究除證實甲基紫精能顯著提高大蒜培養(yǎng)細胞的SOD活力外，還發(fā)現(xiàn)甲基萘醌和水楊酸也能誘導SOD。經(jīng)水楊酸處理的細胞，其SOD活力比對照提高1.84倍，水楊酸與冷脅迫以及熱休克相互作用誘導的SOD活力為對照的2.08倍和3.65倍。在有水楊酸持續(xù)存在的環(huán)境中，細胞在數(shù)天內(nèi)仍能維持較高的SOD活力。我們曾發(fā)現(xiàn)淹水不利于冷脅迫或熱休克對SOD的誘導，但水楊酸可以緩解這一負面效應(yīng)而顯著提高SOD活力。這一效果可能是以SOD的大量產(chǎn)生以及通過對冷脅迫與熱休克誘導作用的強化而實現(xiàn)的。

目前除甲基紫精屬于自由基引發(fā)劑已成定論外，水楊酸與甲基萘醌誘導的SOD的機理尚未闡明。我們的初步觀察表明，水楊酸和甲基萘醌均能促進腎上腺素的自氧化(未發(fā)表結(jié)果)，喑示其引發(fā)或自發(fā)產(chǎn)生自由基可能為二者作用機理之一。Chen等［6］發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶(CAT)是水楊酸的胞內(nèi)受體。當CAT與水楊酸結(jié)合后，可以阻斷H2O2的酶促轉(zhuǎn)變，而H2O2的積累又能激活信號傳導系統(tǒng)，從而誘導抗性保護基因的表達。我們證明水楊酸誘導的SOD主要是Mn.SOD和Fe.SOD，僅有少量Cu/Zn.SOD。據(jù)此可以推測，水楊酸可能主要通過作用于富含CAT的細胞器(如微體等)而誘導特異性SOD合成。對此，我們將作進一步探討。作者單位：曾慶平(廣州中醫(yī)藥大學熱帶醫(yī)學研究所，廣州510407)

郭勇(華南理工大學生物工程系，廣州510641)參考文獻

1BowlerC,VanMontaguM,InzeD,Superoxidedismutaseandstresstolerance.AnnRevPlantPhysiolPlantMolBiol,1992,43∶83

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3曾慶平，郭勇.物理應(yīng)激對大蒜培養(yǎng)細胞SOD的誘導.藥物生物技術(shù)，1998，5(3)∶153

4ChiaLS,McRaeDG,ThompsonJE.Light-dependenceofparaquat-initiatedmembranedeteriorationinbeanplants:evidencefortheinvolvementofsuperoxide.PhysiolPlant,1982,56∶492

5MattersGL,ScandaliosJG.Effectofthefreeradicalgeneratingherbicideparaquatontheexpr