實驗動物取血尿液其他體液的采集實驗動物的剖檢方法

名稱：生物樣品的采集及實驗動物的解剖和臟器系數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)

關(guān)鍵詞：生物樣品的采集實驗動物解剖臟器系數(shù)測定

目的：在藥物毒理學(xué)研究中，常常需要收集實驗動物的血液、尿液或其它體液進(jìn)行常規(guī)檢查或生化分析，因此，正確采集實驗動物的生物材料是藥物毒理學(xué)最基本和最重要的操作技術(shù)。對實驗動物進(jìn)行大體解剖檢查是藥物毒理實驗的常規(guī)觀察項目，簡便易行并能提供重要資料。測定動物死后器官濕重和含水量是常用的指標(biāo)之一，可以從大體標(biāo)本大概地估計內(nèi)臟器官病變的程度，特別適用于某些可致內(nèi)臟水腫、實質(zhì)細(xì)胞腫脹、間質(zhì)纖維組織增生或臟器萎縮等藥物的研究。組織勻漿的制備以及在勻漿技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離技術(shù)，也是藥物毒理實驗的重要技術(shù)之一。學(xué)習(xí)和掌握藥物毒理學(xué)試驗中常用的生物材料的采集方法；實驗動物的處死方法、大體解剖檢查、臟器系數(shù)和含水量的測定以及組織勻漿的制備；了解病理切片常規(guī)收集樣本的部位和方法。

主體內(nèi)容

（一）血液的采集

1、大鼠與小鼠的采血方法：

①鼠尾采血：當(dāng)所需血量很少時采用本法。固定動物并露出鼠尾，將尾部浸入45~50℃溫水中數(shù)分鐘，使尾靜脈充血，擦干，再用酒精棉球擦試消毒。剪掉尾尖（約0.2~0.3cm），拭去第一滴血。然后用血色素吸管定量吸取尾血，或?qū)⑽惭苯拥稳肴萜鲀?nèi)。采血完畢用干棉球壓迫止血。亦可不剪尾，用7~8號注射針頭連上注射器直接刺破尾靜脈采血。

②眼眶靜脈叢采血：當(dāng)需用中等量的血液，而又避免動物死亡時采用本法。左手拇指及食指緊緊握住大鼠或小鼠頸部，壓迫頸部兩側(cè)使眶后靜脈叢充血，但用力要恰當(dāng)，防止動物窒息死亡。右手持玻璃毛細(xì)管從右眼或左眼內(nèi)眥部以45°角刺入，刺入深度小鼠約2～3mm,大鼠4～5mm。若遇阻力稍后退調(diào)整角度后再刺入，如穿刺適當(dāng)，血液能自然流入毛細(xì)管內(nèi)。得到所需的血量后，即除去加于頸部的壓力，拔出毛細(xì)管，用干棉球壓迫止血。

③斷頭采血：當(dāng)需用較大量的血液，而又不需繼續(xù)保存動物生命時采用本法。左手握住動物，右手持剪刀，快速剪掉頭頸部，倒立動物讓血液滴入容器。需注意防止斷毛落入容器中。

2、家兔采血方法：

①耳緣靜脈采血：本法為最常用的取血方法之一，可多次反復(fù)取血。將家兔固定于兔箱中，拔掉擬采血耳緣部細(xì)毛，用手指輕輕彈耳或電燈照射兔耳，使耳部血管擴(kuò)張，然后消毒。左手壓迫耳根，用針頭刺破靜脈或以刀片在血管上切一小口，讓血液自然流出。也可直接用注射器進(jìn)針耳緣靜脈抽取血液。采血完畢用干棉球壓迫止血，如一時不易止血，可用木夾夾住耳殼10~20分鐘。

②心臟穿刺采血：將家兔仰臥位固定在兔臺上或由助手捉持，在左胸第2~4肋部剪毛，常規(guī)消毒。于第3~4肋胸骨左緣心跳最明顯處穿刺，針頭刺入心臟后即見血液涌入注射器。采血完畢迅速將針頭拔出，這樣心肌上的穿刺孔較易閉合，針眼處用酒精棉球壓迫止血。體重2公斤的家兔每隔2~3周可重復(fù)采血10~20ml。

③股動脈采血：將家兔仰臥固定在兔臺上，左手拉直動物后肢，右手持注射器，以血管博動為指標(biāo)，將針頭刺入股動脈。若已刺入動脈，即有鮮紅色血液流入注射器。抽血完畢迅速拔出針頭，用干棉球壓迫止血。

3、狗的采血方法：

①后肢外側(cè)小隱靜脈和前肢皮下頭靜脈采血：本法最常用，且方便。后肢外側(cè)小隱靜脈位于后肢脛部下1/3的外側(cè)淺表的皮下，由前側(cè)走向后上側(cè)，前肢皮下頭靜脈位于前肢腳爪上方背側(cè)的正前方。抽血前，將狗固定在狗臺上或使狗側(cè)臥，由助手固定好。剪去抽血部位的毛，常規(guī)消毒。一人用力壓迫靜脈近心端或用止血帶綁緊，使靜脈充盈，另一人持注射器進(jìn)行靜脈穿刺。取得所需血量后拔出針頭，以干棉球壓迫止血。

②耳緣靜脈采血：當(dāng)需少量血液或作血常規(guī)檢查時，可用狗的耳緣靜脈采血法。剪毛后先將狗的耳殼加熱，或用二甲苯棉球擦耳殼，然后以刀片切割已擴(kuò)張的血管，使血液滴入容器。采血完畢，以干棉球壓迫切割口以止血。

4、采集血液的注意點(diǎn)：

①實驗動物一次采血量過多或采血過于頻繁，都可影響動物健康，造成貧血甚至

死亡，其最大安全采血量見表1。

②采血方法的選擇，主要取決于實驗的目的和所需血量的多少，所需血量較少時可刺

破組織取毛細(xì)血管的血，當(dāng)需血量較多時可作靜脈采血，若需反復(fù)多次靜脈采血時，應(yīng)自遠(yuǎn)心端開始。

③若需抗凝全血，在注射器或試管內(nèi)需預(yù)先加入抗凝劑，常用的抗凝劑有：

A、草酸鉀：常用于供檢驗用血液樣品的抗凝。在試管內(nèi)加飽和草酸鉀溶液2滴，均勻浸濕管壁后，放入烘箱（80℃）烤干，包好備用。每管能使3~5ml血液不凝固，供鉀、鈣含量測定的血樣不能用草酸鉀抗凝。

B、肝素：取1%肝素溶液0.1ml于試管內(nèi)，均勻浸濕試管內(nèi)壁，放入烘箱（80~100℃）中烤干。每管能使5~10ml血液不凝固。市售的肝素注射液每ml含肝素12.500U，相當(dāng)于肝素鈉125mg。

C、枸櫞酸鈉：3.8%的枸櫞酸鈉溶液1份可使9份血液不凝固，用于紅細(xì)胞沉降速率測定。因其抗凝作用較弱而堿性較強(qiáng)，不適用于供化驗用的血液樣品。

（二）尿液的收集

1、一次尿收集法：在實驗研究中，有時為了某種實驗?zāi)康?，要求每間隔一定的時間收集一次尿液，如每4小時收集一次，以觀察藥物的排泄情況。此種情況下，常用以下方法收集尿液。

①逼尿法：本法適用于兔、貓。助手把動物抱住，操作者右手由腹腔向下逐漸用力壓迫膀胱，逼出尿液。

②導(dǎo)尿法：本法適用于兔、貓、猴和狗等動物，是較常用的方法之一。動物取仰臥位固定于手術(shù)臺上，尿道口常規(guī)消毒。以左手充分暴露尿道口且固定之，右手持導(dǎo)尿管（尖端涂有消毒凡士林或液體石蠟）順尿道輕而慢地插入，家兔插入約8~12cm，一旦進(jìn)入膀胱腔，即見尿液流出。若無尿流出，可將導(dǎo)尿管適當(dāng)上下左右移動，到尿液流出為止，然后用膠布將導(dǎo)尿管與動物體固定。

③輸尿管插管法：本法適用于兔、貓、猴和狗。以兔為例：將兔麻醉后仰臥位固定在手術(shù)臺上，于恥骨聯(lián)合上緣沿正中腹白線作一4~6cm的切口，打開腹腔，在膀胱底兩側(cè)找出左右兩根輸尿管，分離后于兩根輸尿管下各穿兩根線，一根結(jié)扎近膀胱端，在結(jié)扎線上方向腎臟方向剪一小口插入導(dǎo)管，用另一線結(jié)扎。將兩根導(dǎo)管的游離端一并放入量筒內(nèi)收集尿液。實驗過程中，應(yīng)用溫生理鹽水紗布覆蓋手術(shù)野，以保持腹腔溫度。

2、連續(xù)收集尿液的方法

大鼠和小鼠的留尿法：在小動物的毒理實驗中，常常收集24小時或某特定時間內(nèi)的尿液。為此常用代謝籠配上糞尿分離漏斗收集尿液，此裝置除支架外均用玻璃或有機(jī)玻璃制成，便于清洗。該裝置主要包括圓形有機(jī)玻璃籠罩，帶孔的圓玻璃底盤，供飲水和食料的裝置，錐形集尿漏斗和糞尿分離器等。動物置于代謝籠內(nèi)，糞尿分離漏斗的側(cè)口接一只150~200ml的集尿容器收集尿液。

一般5~6小時內(nèi)，平均每只小鼠可收集到0.4~0.5ml的尿液。如留尿前給予灌胃，每克體重灌液0.02ml，則可增至0.7~0.8ml。未經(jīng)水負(fù)荷的正常大鼠，排尿量約為0.5ml/100g體重/小時。

貓和兔連續(xù)集尿裝置的組成部分與大鼠的基本相同。但代謝籠常用鐵絲和搪瓷制成。集尿的容器要大一些。

3、收集尿液的注意點(diǎn)

①尿液收集器必須保證糞尿分開，防止糞便污染尿液。標(biāo)本容器務(wù)須潔凈，其容量視動物而定。

②標(biāo)本收集后，須在新鮮時進(jìn)行檢驗，若需放置時間較久，則須貯放在冰箱或加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?/p>

③分析尿中金屬離子時，代謝籠等應(yīng)避免用金屬材料制成，集尿容器最好用聚乙烯材料的。

④為了滿足實驗所需尿量，在收集尿液前，可灌喂適量的水及青菜。

（三）其它體液的采集

1、精液的采集：研究藥物對雄性動物生殖系統(tǒng)的作用時，精液的觀察甚為重要。常用的采集精液的方法有人工陰道法、按摩法、電刺激法及麻醉法等。實驗小動物如大、小鼠，也可以采集雌鼠陰道內(nèi)的陰栓來檢查精液凝固后的情況。鼠于交配后，精液在陰道內(nèi)凝固，如一白色栓塞堵在陰道中，叫做陰栓。小鼠的陰栓比較牢固，可在陰道內(nèi)存留1~2天；大鼠的陰栓不牢固，容易脫落。所以，檢查大鼠的陰栓時，除檢查陰道外，還應(yīng)在籠底尋找陰栓。出現(xiàn)陰栓說明已經(jīng)交配。

狗的精液采集可用簡便的辦法：將雄狗帶到發(fā)情雌狗的狗舍（雌狗一年內(nèi)二次發(fā)情期，經(jīng)常在1~2月和6~8月，每次可持續(xù)20~25天），因雌狗在發(fā)情期，外生殖器官紅腫并分泌很多特殊血性分泌物，當(dāng)雄狗接近發(fā)情雌狗嗅到這種分泌物時，可引起雄狗發(fā)情。此時立即將雄狗拉上狗臺，在雄狗已勃起的陰莖根部輕輕壓迫，即可引起雄狗射精。三種常用實驗動物精液正常值如表2。

2、唾液的采集：一般可引用食餌誘使唾液分泌，再從口腔內(nèi)采集。另外，還可用唾液腺導(dǎo)管引出法，分離出腮腺（或頜下腺與舌下腺）唾液導(dǎo)管，插入細(xì)塑料管，采集唾液。

3、胃液的采集：將胃管經(jīng)動物口腔插入胃內(nèi)，在胃管的出口端連接注射器吸取胃液。一般在禁食6小時后抽取。

（四）實驗動物的處死方法

1、大鼠和小鼠的處死方法：

①脊椎脫臼法：右手抓住鼠尾用力向后拉，同時左手拇指與食指用力向下按住鼠頭。將脊髓與腦髓拉斷，鼠便立刻死亡，這是小鼠最常用的處死方法。

②斷頭法：用剪刀在鼠頸部將鼠頭剪掉，迅速將鼠身倒置放血，由于剪斷腦脊髓和大量失血，會很快死亡。但易引起肺淤血，因此，重點(diǎn)觀察肺部病變的實驗，不宜采用此法。

③擊打法；右手抓住鼠尾，提起，用力摔擊其頭部，鼠痙攣后立即死亡。或用小木錘用力擊打鼠頭部也可致死。

④急性失血法：可采用鼠眼眶動脈和靜脈急性大量失血方法使鼠立即死亡。左手拇指和食指盡量將鼠頭部皮膚捏緊，使鼠眼球突出。右手持彎頭小鑷，在鼠右側(cè)眼球根部將眼球摘去，并將鼠倒置，頭向下，此時血液很快從眼眶內(nèi)流出。

⑤化學(xué)致死法：吸入CO，大、小鼠在CO濃度為0.2~0.5%環(huán)境中即可致死。

另外，皮下注射士的寧（小鼠0.76~2.0mg/kg，大鼠3.0~3.5mg/kg），吸入乙醚、氯仿均可致死。

2、家兔和狗的處死方法：

①空氣栓塞法：向動物靜脈內(nèi)注入一定量的空氣，使動物發(fā)生空氣栓塞，形成嚴(yán)重的血液循環(huán)障礙而死亡。一般家兔注入20~40ml空氣，狗注入80~150ml空氣即可致死。本法優(yōu)點(diǎn)是處死方法簡單、迅速，缺點(diǎn)是由于動物死于急性循環(huán)，各臟器淤血十分明顯。

②急性失血法；先使動物麻醉，暴露股三角區(qū)或腹腔，再切斷股動脈或腹主動脈，立即噴出血液。用一塊濕紗布不斷擦去切口周圍處的血液和血凝塊，同時不斷地用自來水沖洗流血，使切口處保持通暢，動物在3~5分鐘內(nèi)即可死亡。采用本法動物十分安靜，對臟器無損害，但器官貧血比較明顯，是目前活殺采集病理標(biāo)本較好的方法。

另外，對家兔也可用木錘用力錘擊其后腦部，損壞延腦，造成死亡。也可注入一定量的化學(xué)藥物，如氰化鉀溶液、福爾馬林溶液、士的寧等造成死亡。

（五）實驗動物的剖檢方法

動物尸體取仰臥位，將四肢固定，用水浸濕被毛。從下頜中央開始到恥骨聯(lián)合正中垂直切口，用骨剪把左右肋骨剪斷后，將胸骨向前下方翻開，即可暴露胸、腹腔。按胸腔、腹腔、顱腔的次序觀察各臟器位置、形狀及彼此相互關(guān)系，然后分別取下。先在胸腔入口處切斷食道和氣管，將心和肺一起取出。再依次摘除腹部臟器脾、肝、腎上腺、腎、胃、腸和盆腔器官，分別進(jìn)行各臟器的檢查。

在解剖和取材時，應(yīng)盡量減少由于器械或手術(shù)粗暴引起的機(jī)械損傷。刀、剪要鋒利，鑷子應(yīng)盡量鑷在不重要的部位，以減少人為損傷。

1、呼吸器官：先檢查喉頭、聲門粘膜有無出血和水腫，兩側(cè)肺表面有無出血、感染、肺實變或肺氣腫現(xiàn)象。再剪開氣管、支氣管及其分支，檢查粘膜有無充血、出血、感染情況，有無泡沫樣炎性滲出液、肺的切面有無實質(zhì)性病灶、氣腫、萎縮、出血等病變。

2、心臟：剪開心包膜，暴露出心臟，注意心臟的大小、外形和心外膜情況。自下腔靜脈入口處將右心房作直線剖開，然后從此線的中點(diǎn)沿心臟右緣剖至心尖部，再從心尖部在心室膈右側(cè)沿冠狀動脈溝平行地剖至肺動脈，觀察右心的心肌、心內(nèi)膜、三尖瓣和肺動脈瓣有無病變。自左右肺靜脈入口處將左心房直線剪開，沿心臟左緣剖至心尖部，再從心尖部在心室膈左側(cè)向上剖開左心室的前壁到主動脈，觀察左心的心肌、心內(nèi)膜、二尖瓣和主動脈瓣有無病變。

3、肝臟：觀察肝臟的形狀和色澤，包膜有無增厚粘連，肝實質(zhì)有無充血、出血、淤血和脂肪變，切面肝小葉的結(jié)構(gòu)是否清晰，門靜脈、膽管和血管有無擴(kuò)張等。切開膽囊（大鼠無膽囊），檢查膽囊充盈程度、膽汁性狀（顏色、透明度、濃度）和粘膜的形態(tài)。

4、脾臟：觀察脾臟的形態(tài)、質(zhì)地（堅硬、柔軟、脆弱）、體積大小和色澤、包膜表面是否平滑或有皺紋，切面濾泡、小梁和紅髓的結(jié)構(gòu)，正常動物這三種結(jié)構(gòu)清晰可見。

5、腎臟：注意腎臟外形、大小、軟硬度，包膜有無粘連、腎表面有無凹凸不平等。自腎凸面對準(zhǔn)腎門作一縱切面，切面應(yīng)使腎盂對半剖開，檢查皮質(zhì)和髓質(zhì)的界限、顏色、斑點(diǎn)等。腎盞和腎盂有無充血、出血、異常內(nèi)容物的積聚。根據(jù)實驗需要，亦可以一并剪開輸尿管、膀胱進(jìn)行檢查。

6、胃腸道：從食道下端沿胃大彎從賁門經(jīng)胃底剪到幽門，注意胃內(nèi)容物、胃粘膜顏色，有無增厚、出血、潰瘍和瘢痕。檢查各段腸道漿膜，腸系膜及其淋巴結(jié)的情況，拉開腸系膜觀察有無寄生蟲感染。

7、生殖器官：剪開睪丸鞘膜檢查鞘膜及腔內(nèi)液體后，將睪丸、附睪一起切開，觀察睪丸、附睪有無病變。雌性動物應(yīng)檢查卵巢、輸卵管及子宮等有無病變。

8、腦和脊髓：打開顱腔（小動物只需要普通家用剪刀及小骨鉗，大動物則需要弓形鋸），先觀察硬腦（脊）膜有無充血、出血、滲出等異常變化。然后從正中剪開硬腦（脊）膜，檢查腦實質(zhì)各部分有無異常變化。

（六）臟器系數(shù)和臟器含水量的測定

臟器系數(shù)指內(nèi)臟器官重量與體重(kg或100g)的比值，含水量（g）指器官濕重與干重之差。其方法是動物在麻醉下用急性失血法處死，按上述剖檢的順序依次摘取所需臟器，用生理鹽水稍加漂洗后吸干臟器表面水份，立即在感量為百分之一克天平上稱重，稱得的重量除以體重即得各臟器系數(shù)。測定含水量的部分，放在恒重的器皿中，準(zhǔn)確稱其濕重后，將組織盡量剪碎，在105℃烘箱中烘烤2小時后，稱其重量，再用同法烘烤，直至恒重，然后計算干、濕重差即得各臟器含水量。

（七）動物解剖后組織標(biāo)本的選取

藥物毒性實驗中，動物剖檢除大體觀察外，要求各臟器必須制作病理切片，在顯微鏡下觀察其細(xì)微變化。因此，對動物尸體解剖的同時，應(yīng)選取組織塊，供制片檢查。常規(guī)采取組織的部位及塊數(shù)如下：

心臟：1~2塊，即左室前壁連同乳頭肌1塊，右室