臍血庫的建立和臍血干細(xì)胞移植的臨床研究課件

生物技術(shù)3班

朱建國臍血移植生物技術(shù)3班臍血移植1

臍血是從臍帶和胎盤采集的血，其中含有豐富的干細(xì)胞和祖細(xì)胞。

干細(xì)胞是具有全部或部分分化能力和自我更新能力的細(xì)胞。

祖細(xì)胞是能夠通過一系列細(xì)胞分裂產(chǎn)生特定細(xì)胞系的親代細(xì)胞。

臍血是從臍帶和胎盤采集的血，其中含有豐富的干細(xì)胞和2

“造血”正是依賴造血干/祖細(xì)胞來完成源源不斷的分裂、增殖和分化過程。臍血是替代骨髓進(jìn)行造血細(xì)胞移植的理想的細(xì)胞來源，此外，它在基因治療中也有很大的應(yīng)用潛力。

“造血”正是依賴造血干/祖細(xì)胞來完成源源不斷的分裂3臍血干/祖細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)

人臍血中的造血細(xì)胞包括造血干細(xì)胞（Hematopoieticstemcells，HSC）以及成熟血細(xì)胞的直接祖先，即造血祖細(xì)胞（Hematopoieticprogrenitorcells，HPC）。

臍血干/祖細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)

人臍血中的造血細(xì)胞包括造血4

臍血造血細(xì)胞的主要特征有：1）能在體外長期存活；2）具有廣泛的增殖能力，這可能是由于它們具有快速脫離細(xì)胞周期G0/G1期的性質(zhì)；3）作為以逆轉(zhuǎn)錄病毒為媒介的高效基因轉(zhuǎn)移的理想靶細(xì)胞。

臍血造血細(xì)胞的主要特征有：5

實(shí)驗(yàn)研究和臨床血液移植中，人們往往把CD34抗原作為為鑒定和分離人干/祖細(xì)胞的重要標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)研究和臨床血液移植中，人們往往把CD34抗原作為為6CD34

CD34抗原是一種整合的膜糖蛋白，其分子量為90-120kD，可能與細(xì)胞間黏附及造血相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。Gao等將人類CD34+細(xì)胞和CD34-細(xì)胞作了比較，認(rèn)為前者的NOD/SCID鼠移植潛能比后者高出100倍以上，也在一定程度上說明了以CD34抗原作為判別依據(jù)的可行性。

但不是所有的造血細(xì)胞的表面都帶有CD34抗原。CD34CD34抗原是一種整合的膜糖蛋白，其分子量為907

不同胎齡的胎兒與初生嬰兒相比，臍血造血祖細(xì)胞的表型和功能有一定的差別。Wyrsch等比較了懷孕16-34周的不成熟胎兒和足月出生的嬰兒的臍血，發(fā)現(xiàn)循環(huán)（circulating）祖細(xì)胞的頻率在懷孕的4-6個(gè)月時(shí)達(dá)到最高，而隨后又線性下降。這表明未足月嬰兒的臍血干/祖細(xì)胞具有更強(qiáng)的擴(kuò)增能力，而在基因治療方面也有更強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

不同胎齡的胎兒與初生嬰兒相比，臍血造血祖細(xì)胞的表型和功能有8

端粒是所有的真核生物染色體的末端部分，富含G/C重復(fù)序列。隨著細(xì)胞分裂和分化的不斷進(jìn)行，端粒的重復(fù)片段逐漸丟失，而其長度也逐漸變短。

DePauw等利用一種新的精確計(jì)算方法，并結(jié)合PNAFISH和數(shù)字熒光顯微鏡的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)臍血干細(xì)胞（UCBSC）的端粒平均長度明顯長于成人的骨髓干細(xì)胞（BMSC），這被認(rèn)為是臍血造血增殖潛能高于骨髓的理論依據(jù)之一。

端粒是所有的真核生物染色體的末端部分，富含G/C重9造血干/祖細(xì)胞的生長是由造血細(xì)胞因子來調(diào)控的。各種造血因子幾乎都是多效性的，它們對不同細(xì)胞行使不同功能。這種功能上的顯著不同依賴于不同的靶細(xì)胞，不同的因子濃度以及不同細(xì)胞因子的相互作用。在體外培養(yǎng)中細(xì)胞因子的加入可能會(huì)很大程度地改變細(xì)胞的原始表型。Porretti等從兩份臍血中分離純化CD34+細(xì)胞后在加有IL-6，IL-11，F(xiàn)L和血小板生成素（TPO）的無血清培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)兩周后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞的免疫表型發(fā)生了顯著的改變。這提示上述細(xì)胞因子組合具有促進(jìn)CD34+細(xì)胞分化成熟的作用。造血干/祖細(xì)胞的生長是由造血細(xì)胞因子來調(diào)控的。各種造10CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增兩周的免疫表型變化

細(xì)胞表型第一份臍血第二份臍血起始兩周后起始兩周后CD34+７１１０８５１９CD34+/38-/33-１.２０.４０.１６CD34+/38-/33+２１.５８.３＜０.１６６CD34+/38+/33-６９.２９０.８６４.５２５.４CD34+/38-/W90+２.７０.１４０.１１CD34+/33+/13+４５９７４３９５CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增兩周的免疫表型變化細(xì)胞表型第一份臍血11臍血造血干/祖細(xì)胞的分離和純化

臍血造血干/祖細(xì)胞的分離和純化是研究臍血造血干/祖細(xì)胞和臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一，迄今有以下幾種方法用于臍血造血干/祖細(xì)胞的分離和純化：①單純離心分離法，該方法分離的干/祖細(xì)胞損失率達(dá)40～80%；②不連續(xù)密度梯度離心法，臍血干/祖細(xì)胞主要集中于低密度(近1.063g/ml)組分中，該方法增加了體外操作的過程，易污染；臍血造血干/祖細(xì)胞的分離和純化臍血造血干/祖細(xì)胞的12

③三聯(lián)袋(triplebloodbagsystem)分步離心濃集法，該法可除去59%RBC，體積減少56%，CD34+細(xì)胞回收率為87%；④Ficoll、peroll、甲基纖維素、明膠、淀粉等方法，有結(jié)果表明明膠法干/祖細(xì)胞損失率較低，集落形成細(xì)胞(CFC)、CD34+細(xì)胞的回收率分別為92%和86%；⑤免疫磁珠吸附法(MACS)，生物素-抗生素親和柱法，這些方法具有快速、純度好、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已趨于商品化，并有應(yīng)用于臨床的報(bào)道；③三聯(lián)袋(triplebloodbagsystem)分13

⑥流式細(xì)胞技術(shù)分選法(FCM)，該方法以流式細(xì)胞儀分選CD34+及其亞群細(xì)胞純度可高達(dá)95%～99%，是目前分選CD34+細(xì)胞純度最高的方法，但耗時(shí)費(fèi)資，產(chǎn)率并不高，也難保持無菌，目前主要應(yīng)用于科研。

因此選擇較好的臍血干/祖細(xì)胞分離純化的方法既要考慮純度、產(chǎn)率、又要顧及生物學(xué)活性及臨床應(yīng)用的可行性。

⑥流式細(xì)胞技術(shù)分選法(FCM)，該方法以流式細(xì)胞儀分選C14臍血的體外擴(kuò)增

根據(jù)Patricia等的定義:細(xì)胞增殖（proliferation）是指從某一特定的細(xì)胞群產(chǎn)生新細(xì)胞的過程，而不管產(chǎn)生的細(xì)胞的類型；細(xì)胞擴(kuò)增（expansion）是指產(chǎn)生更多保持起始細(xì)胞群的特定特征的細(xì)胞；細(xì)胞分化（differentiation）是指形態(tài)上可以識別的細(xì)胞祖先產(chǎn)生下代細(xì)胞，以及特定造血系產(chǎn)生成熟細(xì)胞。臍血的體外擴(kuò)增

根據(jù)Patricia等的定義:15造血干/祖細(xì)胞體外生長示意圖

A.起始細(xì)胞群能產(chǎn)生新細(xì)胞，因此總細(xì)胞數(shù)量增加（增殖）。產(chǎn)生的細(xì)胞表現(xiàn)出了不同造血系的成熟特征（分化）。然而保持起始細(xì)胞特征的細(xì)胞數(shù)量卻減少了。——增殖分化

B.起始細(xì)胞群增殖和分化，保持起始細(xì)胞特征的細(xì)胞數(shù)量不變?！鲋尘S持分化

C.起始細(xì)胞群增殖和分化，保持起始細(xì)胞特征的細(xì)胞數(shù)量增加（擴(kuò)增）?！只鲋硵U(kuò)增

造血干/祖細(xì)胞體外生長示意圖A.起始細(xì)胞群能產(chǎn)16通常認(rèn)為，單份臍血的干細(xì)胞量只能滿足體重不大于30kg的兒童，成人應(yīng)用因數(shù)量不足而受到限制。根據(jù)Gluckman等人的研究，臍血移植中有核細(xì)胞的劑量至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，高有核細(xì)胞劑量對嗜中性粒細(xì)胞植入有促進(jìn)效應(yīng)，且有核細(xì)胞劑量>3.7×107/kg是預(yù)測良好生存的因素之一。鑒于人臍血干/祖細(xì)胞在臨床上的重要意義，一些研究小組致力于探索出這些細(xì)胞體外擴(kuò)增的理想條件。

通常認(rèn)為，單份臍血的干細(xì)胞量只能滿足體重不大于30kg的兒17CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增能力除了與胎兒的孕期有關(guān)以外，還與不同的細(xì)胞周期有關(guān)。Summers等研究了分別處于細(xì)胞周期的G1和G0期的臍血CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增的質(zhì)量和數(shù)量。他們將細(xì)胞培養(yǎng)在無血清無基質(zhì)細(xì)胞、但添加有SCF，F(xiàn)L-3，TPO的培養(yǎng)基中，通過流式細(xì)胞儀計(jì)算每周收獲的細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的G0期細(xì)胞不但產(chǎn)生更多的CD34+細(xì)胞，而且G1細(xì)胞群的后裔中表達(dá)CD34抗原的細(xì)胞比例比G0細(xì)胞群下降地快得多。其結(jié)論是G0期的臍血CD34+細(xì)胞比G1期的細(xì)胞在體外產(chǎn)生祖細(xì)胞的能力高1000倍。CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增能力除了與胎兒的孕期有關(guān)以外，還18

在培養(yǎng)基中添加胎牛血清是維持和擴(kuò)增干細(xì)胞的常用方法之一，但是血清中可能存在一些過敏原或感染因子，如牛海綿狀腦炎或其他朊病毒疾病等。Lazzari等在使用相同的細(xì)胞因子組合的條件下比較了三種無血清培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基StemPro34SFM（LifeTech-nologies）和CellGroSCGM（CellGenix）擴(kuò)增有核細(xì)胞的能力比培養(yǎng)基X-Vivo10，（BioWhit-taker）高4倍以上，而擴(kuò)增CD34+細(xì)胞的能力分別高出5倍和7倍以上。Gilmore等發(fā)現(xiàn)無血清培養(yǎng)基QBSF-60的使用可以使CD34+細(xì)胞擴(kuò)增4倍左右。如果要擴(kuò)增出供成人移植的足夠的干細(xì)胞，這種培養(yǎng)基中的細(xì)胞快速擴(kuò)增可以顯著減少所使用的擴(kuò)增培養(yǎng)基的總量。在培養(yǎng)基中添加胎牛血清是維持和擴(kuò)增干細(xì)胞的常用方法之19該條件下細(xì)胞擴(kuò)增的機(jī)制仍不清楚，有可能是因?yàn)檠宓腇CS中可能包括造血移植因子或分化因子，從而削減了CD34+細(xì)胞的數(shù)量。對于細(xì)胞生長環(huán)境中可能存在的造血抑制因子，一些研究者采用添加抗體的方法，也有報(bào)道在培養(yǎng)基中添加使用不同的基質(zhì)細(xì)胞株。

該條件下細(xì)胞擴(kuò)增的機(jī)制仍不清楚，有可能是因?yàn)檠宓腇20

至今為止絕大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)條件都是以使用重組細(xì)胞因子為基礎(chǔ)的。Guzmán等認(rèn)為，在CD34+細(xì)胞占總細(xì)胞的50%以上時(shí)，通過細(xì)胞因子的理想組合可以獲得造血細(xì)胞的顯著增殖和擴(kuò)增。許多研究者都認(rèn)為使用早期作用細(xì)胞因子（earlyactingcyto-kines），如FL（FLT-3配體）和TPO（血小板生成素），對臍血干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增有很重要的影響。使用含有FL和TPO的培養(yǎng)基，Shadduck實(shí)驗(yàn)室獲得了CD34+細(xì)胞20-30倍的擴(kuò)增。再加入干細(xì)胞因子和IL-6到培養(yǎng)系統(tǒng)后，4-6周的體外培養(yǎng)可以獲得CD34+細(xì)胞100倍的擴(kuò)增。Yamaguchi等將臍血CD34+細(xì)胞放在加有血小板生成素（TPO）、FLT3/FLT2配體（FL）和干細(xì)胞

至今為止絕大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)條件都是以使用重組細(xì)胞因子為基礎(chǔ)21因子（SCF）的、但不含血清的單層人原始骨髓基質(zhì)細(xì)胞上培養(yǎng)。培養(yǎng)2和4周以后，CD34+細(xì)胞和克隆形成單位分別擴(kuò)增了100和1000倍以上，而卵石區(qū)域形成細(xì)胞也分別擴(kuò)增了18和60倍。嚴(yán)重并發(fā)免疫缺陷紊亂（severecombinedimmunodeficientdisorder，SCID）的小鼠的重建細(xì)胞（SRC）分析表明了培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞的植入有效性。在可以從干細(xì)胞捐獻(xiàn)者或者其受體獲得基質(zhì)細(xì)胞的臨床條件下，體外擴(kuò)增系統(tǒng)具有顯著的應(yīng)用價(jià)值。

因子（SCF）的、但不含血清的單層人原始骨髓基質(zhì)細(xì)22臍血庫的建立和臍血干細(xì)胞移植的臨床研究

臍血移植的最佳方案之一是利用經(jīng)胚胎選擇的新生兒的臍血來治療其兄弟姐妹的疾病。該技術(shù)于2000年8月在美國首次應(yīng)用于臨床：為一個(gè)患有范尼可貧血的6歲女孩莫利“創(chuàng)造”了一個(gè)弟弟，用他的臍血為莫利進(jìn)行成功的移植。而英國也在日前批準(zhǔn)了為一個(gè)三歲的地中海貧血患兒人工選擇胚胎，以進(jìn)行下一步臍血移植。

臍血庫的建立和臍血干細(xì)胞移植的臨床研究

臍血移植的23

臍血移植除了適合于相關(guān)供體移植以外，在無關(guān)供體移植方面也有令人矚目的應(yīng)用潛力。Hirose等的研究表明，臍血中的B細(xì)胞的IgH的N端明顯短于外周血B細(xì)胞，IgH基因幾乎沒有重排，而且B細(xì)胞分化相關(guān)基因之一的末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶（TdT）不表達(dá)，這些都表明來自臍血的B細(xì)胞更不成熟。由于臍血細(xì)胞獨(dú)特的免疫學(xué)特性，在移植中最具臨床相關(guān)性的HLA的6等位基因只要匹配5種甚至3種即可使用，而臍血移植后發(fā)生移植物抗宿主?。℅VHD）的可能性又要低于骨髓和外周血。

臍血移植除了適合于相關(guān)供體移植以外，在無關(guān)供體移植方面24

臍血的進(jìn)一步開發(fā)和利用必須要求有一個(gè)可以隨時(shí)獲得的、安全可靠的臍血干細(xì)胞來源。1992年美國Arizona大學(xué)建立了世界上最早的臍血庫之一，1994年臍血庫便向公眾開放。至1998年12月僅紐約、Dusseldof、Milan三個(gè)主要的臍血庫已凍存一萬份以上的可供移植的無關(guān)供體的臍血，從而使接受臍血移植的患者與日俱增。而根據(jù)2000年初的統(tǒng)計(jì)，臍血庫已經(jīng)儲(chǔ)備了超過30000份的臍血，實(shí)施的兒童臍血移植超過1500例，而應(yīng)用于成人惡/良性疾病的治療的臍血移植也逐年增加。特別

臍血的進(jìn)一步開發(fā)和利用必須要求有一個(gè)可以隨時(shí)獲得的、25

值得注意的是，無關(guān)供體臍血移植在近幾年迅速發(fā)展，并且已經(jīng)占了總移植數(shù)量的絕大多數(shù)。歐洲臍血登記處統(tǒng)計(jì)的每年無關(guān)/相關(guān)臍血移植的數(shù)量值得注意的是，無關(guān)供體臍血移植在近幾年迅速發(fā)展，并26

根據(jù)歐洲臍血登記處2000年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在來自29個(gè)國家121個(gè)移植中心的527例臍血移植中，138例的供體有親緣關(guān)系，而399例無親緣關(guān)系。結(jié)果表明臍血移植的存活率與骨髓移植相近。而急性或慢性的移植物抗宿主病的發(fā)病率在臍血移植中卻有明顯的減少，甚至是在HLA不匹配的情況下也是如此。而就骨髓移植來說，HLA必須嚴(yán)格匹配。當(dāng)開始尋找適合的供體到移植實(shí)施，5%患者的等待期在2個(gè)月以內(nèi)，50%患者的等待期在4個(gè)月以內(nèi)，而95%患者的等待期在16個(gè)月內(nèi)。這使相當(dāng)一部分可以根據(jù)歐洲臍血登記處2000年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在來自29個(gè)27獲益于骨髓移植的病人在等待合適供體的過程中死亡。成功的配型在少數(shù)人種中則更加困難。

雖然HLA匹配的兄弟姐妹作為供體時(shí)的骨髓移植比使用非相關(guān)的臍血移植具有更好的臨床效果，但是在沒有合適供體的情況下，臍血移植是一個(gè)很好的選擇。Ooi等報(bào)道，7個(gè)患脊髓發(fā)育不良綜合癥（MDS）相關(guān)的二級急性白血病患者在接受HLA不匹配的臍血移植后，五人存活并在7-31個(gè)月內(nèi)無疾病。39個(gè)患有惡性血液病的兒童在移植

獲益于骨髓移植的病人在等待合適供體的過程中死亡。成功28了無關(guān)供體的臍血后，預(yù)計(jì)的三年無風(fēng)險(xiǎn)存活率為49.2-16.6%。相信隨著臨床經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，臍血移植將會(huì)為更多血液或免疫疾病患者帶來福音。

了無關(guān)供體的臍血后，預(yù)計(jì)的三年無風(fēng)險(xiǎn)存活率為49.229臍血在基因治療中的潛在應(yīng)用

基因治療是將外源基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，通過在患者體內(nèi)表達(dá)，糾正或治療疾病的過程。臍血干/祖細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新能力和增殖能力，因此是外源基因?qū)氲睦硐胧荏w。雖然轉(zhuǎn)基因的方法很多，但是將目的基因?qū)肽氀?祖細(xì)胞的最主要方法是逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入法。因?yàn)槟氀杉?xì)胞能分泌生長因子，且它們更多處于細(xì)胞周期中，這對于采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移至關(guān)重要：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能介導(dǎo)處于增殖、分裂中的細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。

臍血在基因治療中的潛在應(yīng)用

基因治療是將外源基因轉(zhuǎn)入靶30

在臍血移植后的免疫重建中，使用基因修飾的樹突狀細(xì)胞（dendriticcells，DCs）在免疫治療中會(huì)成為一種預(yù)防感染和復(fù)發(fā)的有效途徑。在HIV感染的治療方面，也可以利用多種以臍血細(xì)胞為受體的基因治療方法，如轉(zhuǎn)導(dǎo)“保護(hù)”基因進(jìn)入臍血細(xì)胞，使其在HIV敏感的靶細(xì)胞上表達(dá)，特別是CD34+淋巴細(xì)胞。Wang等也成功地將耐藥基因MGMT和MDR1利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)入人臍血CD34+細(xì)胞中，這兩種基因的共表達(dá)使耐藥性能分別提高了5.8-6.3倍和5倍。這為臨床上改善病人在化療過程中的綜合耐藥性能提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

在臍血移植后的免疫重建中，使用基因修飾的樹突狀細(xì)胞（31造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因和自體移植來治療遺傳性血液疾病和免疫缺陷的最大優(yōu)勢在于，這種療法在提供與異源移植相同益處的同時(shí)，能避免可能伴隨的免疫并發(fā)癥。但是由于相當(dāng)一部分臍血早期祖細(xì)胞處于休止期，外源基因轉(zhuǎn)入率較低，這給成功的基因治療帶來了最大的阻礙。一次最近的臨床試驗(yàn)報(bào)道了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療X-連鎖嚴(yán)重并發(fā)免疫缺陷的嬰兒，由于基因修正的淋巴球的選擇性生長使免疫系統(tǒng)獲得重建[24]。Moore研究小組在最佳條件造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因和自體移植來治療遺傳性血液疾病和免32下擴(kuò)增臍血CD34+細(xì)胞后，使用DHFR（dihydrofolatereductase）轉(zhuǎn)基因，40%的細(xì)胞成功地進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。相信處理造血細(xì)胞的更新的方法能獲得轉(zhuǎn)基因和臨床治療的更高效率。下擴(kuò)增臍血CD34+細(xì)胞后，使用DHFR（dihyd33市場前景

1、白血病為人類三大癌癥之一，每年吞噬無數(shù)人的生命。目前白血病患者的唯一根治方法就是造血干/祖細(xì)胞移植（包括骨髓移植和臍帶血移植），重建再造血功能。骨髓來源的有限和臍帶血中干/祖細(xì)胞總量的偏低都給造血干/祖細(xì)胞移植的成功帶來了一定的難度。因此，體外造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)將會(huì)大大提高臍帶血在白血病患者移植中的應(yīng)用價(jià)值，不但具有巨大的社會(huì)效應(yīng)，也將具有不可估量的經(jīng)濟(jì)效益。

市場前景1、白血病為人類三大癌癥之一，每年吞噬無數(shù)人34

2、人類貧血癥的種類很多，并多為由于遺傳原因所造成的再造血功能喪失，而恢復(fù)其再造血功能的治療手段也是進(jìn)行造血干/祖細(xì)胞移植。雖然單個(gè)種類的貧血癥患者數(shù)量相對較少，但總的貧血癥患者為數(shù)也是相當(dāng)可觀的。3、造血干/祖細(xì)胞具有分化成各中造血細(xì)胞的潛能，因此以造血干/祖細(xì)胞為細(xì)胞材料平臺，將來進(jìn)行相應(yīng)的基因操作，能將造血干/祖細(xì)胞移植技術(shù)擴(kuò)展到其他一些目前人類還沒有辦法解決的疑難雜癥的治療上，比如：糖尿病、高血壓、老年癡呆癥

2、人類貧血癥的種類很多，并多為由于遺傳原因所造成的再35等。造血干/祖細(xì)胞的基因操作必須以擴(kuò)增技術(shù)為前提。

4、大量的各種惡性腫瘤患者需要進(jìn)行放療和化療，而放療和化療會(huì)造成患者嗜中性粒細(xì)胞等免疫性細(xì)胞大量下降，極大地降低了免疫功能。所以對患者來說，放療和化療是不得已的治療方法。但是，如果在臨床上能解決這些治療方法中存在的重建造血功能問題，則將大大提高這些療法的價(jià)值。與本實(shí)驗(yàn)室合作的美國UniversityofColoradoHealthScienceCenter的BMT實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用體外擴(kuò)增的造血干/祖細(xì)胞對等。造血干/祖細(xì)胞的基因操作必須以擴(kuò)增技術(shù)為前提。36放療和化療的成人患者成功地進(jìn)行了11個(gè)病例的移植。擴(kuò)增造血干/祖細(xì)胞在放療和化療上的應(yīng)用將具有巨大的市場。放療和化療的成人患者成功地進(jìn)行了11個(gè)病例的移植。擴(kuò)增37臍血庫的建立和臍血干細(xì)胞移植的臨床研究課件38

生物技術(shù)3班

朱建國臍血移植生物技術(shù)3班臍血移植39

臍血是從臍帶和胎盤采集的血，其中含有豐富的干細(xì)胞和祖細(xì)胞。

干細(xì)胞是具有全部或部分分化能力和自我更新能力的細(xì)胞。

祖細(xì)胞是能夠通過一系列細(xì)胞分裂產(chǎn)生特定細(xì)胞系的親代細(xì)胞。

臍血是從臍帶和胎盤采集的血，其中含有豐富的干細(xì)胞和40

“造血”正是依賴造血干/祖細(xì)胞來完成源源不斷的分裂、增殖和分化過程。臍血是替代骨髓進(jìn)行造血細(xì)胞移植的理想的細(xì)胞來源，此外，它在基因治療中也有很大的應(yīng)用潛力。

“造血”正是依賴造血干/祖細(xì)胞來完成源源不斷的分裂41臍血干/祖細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)

人臍血中的造血細(xì)胞包括造血干細(xì)胞（Hematopoieticstemcells，HSC）以及成熟血細(xì)胞的直接祖先，即造血祖細(xì)胞（Hematopoieticprogrenitorcells，HPC）。

臍血干/祖細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)

人臍血中的造血細(xì)胞包括造血42

臍血造血細(xì)胞的主要特征有：1）能在體外長期存活；2）具有廣泛的增殖能力，這可能是由于它們具有快速脫離細(xì)胞周期G0/G1期的性質(zhì)；3）作為以逆轉(zhuǎn)錄病毒為媒介的高效基因轉(zhuǎn)移的理想靶細(xì)胞。

臍血造血細(xì)胞的主要特征有：43

實(shí)驗(yàn)研究和臨床血液移植中，人們往往把CD34抗原作為為鑒定和分離人干/祖細(xì)胞的重要標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)研究和臨床血液移植中，人們往往把CD34抗原作為為44CD34

CD34抗原是一種整合的膜糖蛋白，其分子量為90-120kD，可能與細(xì)胞間黏附及造血相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。Gao等將人類CD34+細(xì)胞和CD34-細(xì)胞作了比較，認(rèn)為前者的NOD/SCID鼠移植潛能比后者高出100倍以上，也在一定程度上說明了以CD34抗原作為判別依據(jù)的可行性。

但不是所有的造血細(xì)胞的表面都帶有CD34抗原。CD34CD34抗原是一種整合的膜糖蛋白，其分子量為9045

不同胎齡的胎兒與初生嬰兒相比，臍血造血祖細(xì)胞的表型和功能有一定的差別。Wyrsch等比較了懷孕16-34周的不成熟胎兒和足月出生的嬰兒的臍血，發(fā)現(xiàn)循環(huán)（circulating）祖細(xì)胞的頻率在懷孕的4-6個(gè)月時(shí)達(dá)到最高，而隨后又線性下降。這表明未足月嬰兒的臍血干/祖細(xì)胞具有更強(qiáng)的擴(kuò)增能力，而在基因治療方面也有更強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

不同胎齡的胎兒與初生嬰兒相比，臍血造血祖細(xì)胞的表型和功能有46

端粒是所有的真核生物染色體的末端部分，富含G/C重復(fù)序列。隨著細(xì)胞分裂和分化的不斷進(jìn)行，端粒的重復(fù)片段逐漸丟失，而其長度也逐漸變短。

DePauw等利用一種新的精確計(jì)算方法，并結(jié)合PNAFISH和數(shù)字熒光顯微鏡的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)臍血干細(xì)胞（UCBSC）的端粒平均長度明顯長于成人的骨髓干細(xì)胞（BMSC），這被認(rèn)為是臍血造血增殖潛能高于骨髓的理論依據(jù)之一。

端粒是所有的真核生物染色體的末端部分，富含G/C重47造血干/祖細(xì)胞的生長是由造血細(xì)胞因子來調(diào)控的。各種造血因子幾乎都是多效性的，它們對不同細(xì)胞行使不同功能。這種功能上的顯著不同依賴于不同的靶細(xì)胞，不同的因子濃度以及不同細(xì)胞因子的相互作用。在體外培養(yǎng)中細(xì)胞因子的加入可能會(huì)很大程度地改變細(xì)胞的原始表型。Porretti等從兩份臍血中分離純化CD34+細(xì)胞后在加有IL-6，IL-11，F(xiàn)L和血小板生成素（TPO）的無血清培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)兩周后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞的免疫表型發(fā)生了顯著的改變。這提示上述細(xì)胞因子組合具有促進(jìn)CD34+細(xì)胞分化成熟的作用。造血干/祖細(xì)胞的生長是由造血細(xì)胞因子來調(diào)控的。各種造48CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增兩周的免疫表型變化

細(xì)胞表型第一份臍血第二份臍血起始兩周后起始兩周后CD34+７１１０８５１９CD34+/38-/33-１.２０.４０.１６CD34+/38-/33+２１.５８.３＜０.１６６CD34+/38+/33-６９.２９０.８６４.５２５.４CD34+/38-/W90+２.７０.１４０.１１CD34+/33+/13+４５９７４３９５CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增兩周的免疫表型變化細(xì)胞表型第一份臍血49臍血造血干/祖細(xì)胞的分離和純化

臍血造血干/祖細(xì)胞的分離和純化是研究臍血造血干/祖細(xì)胞和臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一，迄今有以下幾種方法用于臍血造血干/祖細(xì)胞的分離和純化：①單純離心分離法，該方法分離的干/祖細(xì)胞損失率達(dá)40～80%；②不連續(xù)密度梯度離心法，臍血干/祖細(xì)胞主要集中于低密度(近1.063g/ml)組分中，該方法增加了體外操作的過程，易污染；臍血造血干/祖細(xì)胞的分離和純化臍血造血干/祖細(xì)胞的50

③三聯(lián)袋(triplebloodbagsystem)分步離心濃集法，該法可除去59%RBC，體積減少56%，CD34+細(xì)胞回收率為87%；④Ficoll、peroll、甲基纖維素、明膠、淀粉等方法，有結(jié)果表明明膠法干/祖細(xì)胞損失率較低，集落形成細(xì)胞(CFC)、CD34+細(xì)胞的回收率分別為92%和86%；⑤免疫磁珠吸附法(MACS)，生物素-抗生素親和柱法，這些方法具有快速、純度好、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已趨于商品化，并有應(yīng)用于臨床的報(bào)道；③三聯(lián)袋(triplebloodbagsystem)分51

⑥流式細(xì)胞技術(shù)分選法(FCM)，該方法以流式細(xì)胞儀分選CD34+及其亞群細(xì)胞純度可高達(dá)95%～99%，是目前分選CD34+細(xì)胞純度最高的方法，但耗時(shí)費(fèi)資，產(chǎn)率并不高，也難保持無菌，目前主要應(yīng)用于科研。

因此選擇較好的臍血干/祖細(xì)胞分離純化的方法既要考慮純度、產(chǎn)率、又要顧及生物學(xué)活性及臨床應(yīng)用的可行性。

⑥流式細(xì)胞技術(shù)分選法(FCM)，該方法以流式細(xì)胞儀分選C52臍血的體外擴(kuò)增

根據(jù)Patricia等的定義:細(xì)胞增殖（proliferation）是指從某一特定的細(xì)胞群產(chǎn)生新細(xì)胞的過程，而不管產(chǎn)生的細(xì)胞的類型；細(xì)胞擴(kuò)增（expansion）是指產(chǎn)生更多保持起始細(xì)胞群的特定特征的細(xì)胞；細(xì)胞分化（differentiation）是指形態(tài)上可以識別的細(xì)胞祖先產(chǎn)生下代細(xì)胞，以及特定造血系產(chǎn)生成熟細(xì)胞。臍血的體外擴(kuò)增

根據(jù)Patricia等的定義:53造血干/祖細(xì)胞體外生長示意圖

A.起始細(xì)胞群能產(chǎn)生新細(xì)胞，因此總細(xì)胞數(shù)量增加（增殖）。產(chǎn)生的細(xì)胞表現(xiàn)出了不同造血系的成熟特征（分化）。然而保持起始細(xì)胞特征的細(xì)胞數(shù)量卻減少了?！鲋撤只?/p>

B.起始細(xì)胞群增殖和分化，保持起始細(xì)胞特征的細(xì)胞數(shù)量不變?！鲋尘S持分化

C.起始細(xì)胞群增殖和分化，保持起始細(xì)胞特征的細(xì)胞數(shù)量增加（擴(kuò)增）。——分化增殖擴(kuò)增

造血干/祖細(xì)胞體外生長示意圖A.起始細(xì)胞群能產(chǎn)54通常認(rèn)為，單份臍血的干細(xì)胞量只能滿足體重不大于30kg的兒童，成人應(yīng)用因數(shù)量不足而受到限制。根據(jù)Gluckman等人的研究，臍血移植中有核細(xì)胞的劑量至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，高有核細(xì)胞劑量對嗜中性粒細(xì)胞植入有促進(jìn)效應(yīng)，且有核細(xì)胞劑量>3.7×107/kg是預(yù)測良好生存的因素之一。鑒于人臍血干/祖細(xì)胞在臨床上的重要意義，一些研究小組致力于探索出這些細(xì)胞體外擴(kuò)增的理想條件。

通常認(rèn)為，單份臍血的干細(xì)胞量只能滿足體重不大于30kg的兒55CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增能力除了與胎兒的孕期有關(guān)以外，還與不同的細(xì)胞周期有關(guān)。Summers等研究了分別處于細(xì)胞周期的G1和G0期的臍血CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增的質(zhì)量和數(shù)量。他們將細(xì)胞培養(yǎng)在無血清無基質(zhì)細(xì)胞、但添加有SCF，F(xiàn)L-3，TPO的培養(yǎng)基中，通過流式細(xì)胞儀計(jì)算每周收獲的細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的G0期細(xì)胞不但產(chǎn)生更多的CD34+細(xì)胞，而且G1細(xì)胞群的后裔中表達(dá)CD34抗原的細(xì)胞比例比G0細(xì)胞群下降地快得多。其結(jié)論是G0期的臍血CD34+細(xì)胞比G1期的細(xì)胞在體外產(chǎn)生祖細(xì)胞的能力高1000倍。CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增能力除了與胎兒的孕期有關(guān)以外，還56

在培養(yǎng)基中添加胎牛血清是維持和擴(kuò)增干細(xì)胞的常用方法之一，但是血清中可能存在一些過敏原或感染因子，如牛海綿狀腦炎或其他朊病毒疾病等。Lazzari等在使用相同的細(xì)胞因子組合的條件下比較了三種無血清培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基StemPro34SFM（LifeTech-nologies）和CellGroSCGM（CellGenix）擴(kuò)增有核細(xì)胞的能力比培養(yǎng)基X-Vivo10，（BioWhit-taker）高4倍以上，而擴(kuò)增CD34+細(xì)胞的能力分別高出5倍和7倍以上。Gilmore等發(fā)現(xiàn)無血清培養(yǎng)基QBSF-60的使用可以使CD34+細(xì)胞擴(kuò)增4倍左右。如果要擴(kuò)增出供成人移植的足夠的干細(xì)胞，這種培養(yǎng)基中的細(xì)胞快速擴(kuò)增可以顯著減少所使用的擴(kuò)增培養(yǎng)基的總量。在培養(yǎng)基中添加胎牛血清是維持和擴(kuò)增干細(xì)胞的常用方法之57該條件下細(xì)胞擴(kuò)增的機(jī)制仍不清楚，有可能是因?yàn)檠宓腇CS中可能包括造血移植因子或分化因子，從而削減了CD34+細(xì)胞的數(shù)量。對于細(xì)胞生長環(huán)境中可能存在的造血抑制因子，一些研究者采用添加抗體的方法，也有報(bào)道在培養(yǎng)基中添加使用不同的基質(zhì)細(xì)胞株。

該條件下細(xì)胞擴(kuò)增的機(jī)制仍不清楚，有可能是因?yàn)檠宓腇58

至今為止絕大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)條件都是以使用重組細(xì)胞因子為基礎(chǔ)的。Guzmán等認(rèn)為，在CD34+細(xì)胞占總細(xì)胞的50%以上時(shí)，通過細(xì)胞因子的理想組合可以獲得造血細(xì)胞的顯著增殖和擴(kuò)增。許多研究者都認(rèn)為使用早期作用細(xì)胞因子（earlyactingcyto-kines），如FL（FLT-3配體）和TPO（血小板生成素），對臍血干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增有很重要的影響。使用含有FL和TPO的培養(yǎng)基，Shadduck實(shí)驗(yàn)室獲得了CD34+細(xì)胞20-30倍的擴(kuò)增。再加入干細(xì)胞因子和IL-6到培養(yǎng)系統(tǒng)后，4-6周的體外培養(yǎng)可以獲得CD34+細(xì)胞100倍的擴(kuò)增。Yamaguchi等將臍血CD34+細(xì)胞放在加有血小板生成素（TPO）、FLT3/FLT2配體（FL）和干細(xì)胞

至今為止絕大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)條件都是以使用重組細(xì)胞因子為基礎(chǔ)59因子（SCF）的、但不含血清的單層人原始骨髓基質(zhì)細(xì)胞上培養(yǎng)。培養(yǎng)2和4周以后，CD34+細(xì)胞和克隆形成單位分別擴(kuò)增了100和1000倍以上，而卵石區(qū)域形成細(xì)胞也分別擴(kuò)增了18和60倍。嚴(yán)重并發(fā)免疫缺陷紊亂（severecombinedimmunodeficientdisorder，SCID）的小鼠的重建細(xì)胞（SRC）分析表明了培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞的植入有效性。在可以從干細(xì)胞捐獻(xiàn)者或者其受體獲得基質(zhì)細(xì)胞的臨床條件下，體外擴(kuò)增系統(tǒng)具有顯著的應(yīng)用價(jià)值。

因子（SCF）的、但不含血清的單層人原始骨髓基質(zhì)細(xì)60臍血庫的建立和臍血干細(xì)胞移植的臨床研究

臍血移植的最佳方案之一是利用經(jīng)胚胎選擇的新生兒的臍血來治療其兄弟姐妹的疾病。該技術(shù)于2000年8月在美國首次應(yīng)用于臨床：為一個(gè)患有范尼可貧血的6歲女孩莫利“創(chuàng)造”了一個(gè)弟弟，用他的臍血為莫利進(jìn)行成功的移植。而英國也在日前批準(zhǔn)了為一個(gè)三歲的地中海貧血患兒人工選擇胚胎，以進(jìn)行下一步臍血移植。

臍血庫的建立和臍血干細(xì)胞移植的臨床研究

臍血移植的61

臍血移植除了適合于相關(guān)供體移植以外，在無關(guān)供體移植方面也有令人矚目的應(yīng)用潛力。Hirose等的研究表明，臍血中的B細(xì)胞的IgH的N端明顯短于外周血B細(xì)胞，IgH基因幾乎沒有重排，而且B細(xì)胞分化相關(guān)基因之一的末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶（TdT）不表達(dá)，這些都表明來自臍血的B細(xì)胞更不成熟。由于臍血細(xì)胞獨(dú)特的免疫學(xué)特性，在移植中最具臨床相關(guān)性的HLA的6等位基因只要匹配5種甚至3種即可使用，而臍血移植后發(fā)生移植物抗宿主?。℅VHD）的可能性又要低于骨髓和外周血。

臍血移植除了適合于相關(guān)供體移植以外，在無關(guān)供體移植方面62

臍血的進(jìn)一步開發(fā)和利用必須要求有一個(gè)可以隨時(shí)獲得的、安全可靠的臍血干細(xì)胞來源。1992年美國Arizona大學(xué)建立了世界上最早的臍血庫之一，1994年臍血庫便向公眾開放。至1998年12月僅紐約、Dusseldof、Milan三個(gè)主要的臍血庫已凍存一萬份以上的可供移植的無關(guān)供體的臍血，從而使接受臍血移植的患者與日俱增。而根據(jù)2000年初的統(tǒng)計(jì)，臍血庫已經(jīng)儲(chǔ)備了超過30000份的臍血，實(shí)施的兒童臍血移植超過1500例，而應(yīng)用于成人惡/良性疾病的治療的臍血移植也逐年增加。特別

臍血的進(jìn)一步開發(fā)和利用必須要求有一個(gè)可以隨時(shí)獲得的、63

值得注意的是，無關(guān)供體臍血移植在近幾年迅速發(fā)展，并且已經(jīng)占了總移植數(shù)量的絕大多數(shù)。歐洲臍血登記處統(tǒng)計(jì)的每年無關(guān)/相關(guān)臍血移植的數(shù)量值得注意的是，無關(guān)供體臍血移植在近幾年迅速發(fā)展，并64

根據(jù)歐洲臍血登記處2000年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在來自29個(gè)國家121個(gè)移植中心的527例臍血移植中，138例的供體有親緣關(guān)系，而399例無親緣關(guān)系。結(jié)果表明臍血移植的存活率與骨髓移植相近。而急性或慢性的移植物抗宿主病的發(fā)病率在臍血移植中卻有明顯的減少，甚至是在HLA不匹配的情況下也是如此。而就骨髓移植來說，HLA必須嚴(yán)格匹配。當(dāng)開始尋找適合的供體到移植實(shí)施，5%患者的等待期在2個(gè)月以內(nèi)，50%患者的等待期在4個(gè)月以內(nèi)，而95%患者的等待期在16個(gè)月內(nèi)。這使相當(dāng)一部分可以根據(jù)歐洲臍血登記處2000年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在來自29個(gè)65獲益于骨髓移植的病人在等待合適供體的過程中死亡。成功的配型在少數(shù)人種中則更加困難。

雖然HLA匹配的兄弟姐妹作為供體時(shí)的骨髓移植比使用非相關(guān)的臍血移植具有更好的臨床效果，但是在沒有合適供體的情況下，臍血移植是一個(gè)很好的選擇。Ooi等報(bào)道，7個(gè)患脊髓發(fā)育不良綜合癥（MDS）相關(guān)的二級急性白血病患者在接受HLA不匹配的臍血移植后，五人存活并在7-31個(gè)月內(nèi)無疾病。39個(gè)患有惡性血液病的兒童在移植

獲益于骨髓移植的病人在等待合適供體的過程中死亡。成功66了無關(guān)供體的臍血后，預(yù)計(jì)的三年無風(fēng)險(xiǎn)存活率為49.2-16.6%。相信隨著臨床經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，臍血移植將會(huì)為更多血液或免疫疾病患者帶來福音。

了無關(guān)供體的臍血后，預(yù)計(jì)的三年無風(fēng)險(xiǎn)存活率為49.267臍血在基因治療中的潛在應(yīng)用

基因治療是將外源基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，通過在患者體內(nèi)表達(dá)，糾正或治療疾病的過程。臍血干/祖細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新能力和增殖能力，因此是外源基因?qū)氲睦硐胧荏w。雖然轉(zhuǎn)基因的方法很多，但是將目的基因?qū)肽氀?祖細(xì)胞的最主要方法是逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入法。因?yàn)槟氀杉?xì)胞能分泌生長因子，且它們更多處于細(xì)胞周期中，這對于采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移至關(guān)重要：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能介導(dǎo)處于增殖、分裂中的細(xì)胞進(jìn)行基因