實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)程匯報(bào)課件

細(xì)胞培養(yǎng)匯報(bào)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)胰蛋白酶處理分離細(xì)胞細(xì)胞的凍存凍存細(xì)胞的復(fù)蘇MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力常見的細(xì)胞染色法一、原代培養(yǎng)由體內(nèi)取出組織或細(xì)胞進(jìn)行的首次培養(yǎng)離體時(shí)間短遺傳性狀和體內(nèi)細(xì)胞相似適于做細(xì)胞形態(tài)、功能和分化等研究第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)，持續(xù)1一4周組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊置溫箱中靜止培養(yǎng)待細(xì)胞從組織塊游出量增后，再補(bǔ)加培養(yǎng)液分散細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。布局：點(diǎn)燃酒精燈，安裝吸管帽。處理組織：把組織塊置于燒杯中，用PBS漂洗2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。剪切：將組織剪切成2~3毫米大小的塊，加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨?。消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定。分離：在消化過(guò)程中見消化液發(fā)混濁時(shí)，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過(guò)適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500~1000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。計(jì)數(shù)：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過(guò)大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，pH要求在7.2~7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，液體變酸，用NaHCO3調(diào)整。培養(yǎng)：置于36.5℃溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時(shí)需要換新塞。二、傳代培養(yǎng)將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞游離期、指數(shù)生長(zhǎng)期和停止期細(xì)胞接種密度過(guò)低，生長(zhǎng)停滯期，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢甚至全部死亡細(xì)胞接種密度過(guò)高，培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分迅速耗竭中毒，然后突然死亡懸浮型細(xì)胞的傳代培養(yǎng)單層細(xì)胞的傳代培養(yǎng)在新的培養(yǎng)容器內(nèi)加入步驟3計(jì)算出的所需添加的新鮮培養(yǎng)基及細(xì)胞懸液。如有必要，可在培養(yǎng)容器內(nèi)充滿無(wú)菌過(guò)濾的CO2，封好培養(yǎng)容器并置于合適的溫度下孵育培養(yǎng)。通常情況下，換液時(shí)不需要每次都完全更換成新的培養(yǎng)基，除非細(xì)胞密度非常高或者是培養(yǎng)基的pH偏酸性（培養(yǎng)基顏色偏黃）。如需完全更換培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液在125g離心力下離心10

min，吸棄舊培養(yǎng)基，然后使用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。三、胰蛋白酶處理分離細(xì)胞胰蛋白酶是一種能夠破壞基質(zhì)和黏附蛋白的蛋白水解酶各種細(xì)胞系附著于生長(zhǎng)表面的黏附程度各不相同進(jìn)行胰蛋白酶處理前需去除血清使用EDTA螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持胰蛋白酶的活性過(guò)度胰蛋白酶處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的裂解和活力的喪失將細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋松擰后置于37℃培養(yǎng)箱中孵育數(shù)分鐘。輕拍細(xì)胞培養(yǎng)瓶直至細(xì)胞完全脫落再懸細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)輕輕吹打細(xì)胞使得團(tuán)狀細(xì)胞分散，以需要的細(xì)胞密度接種細(xì)胞胰蛋白酶/EDTA10x儲(chǔ)存液胰蛋白酶（1:250）5.0gEDTA?四鈉鹽2.0g

NaCl0.85gH2O100ml

胰蛋白酶1x工作液（0.05%）胰蛋白酶/EDTA10x儲(chǔ)存液100ml

NaCl7.1gKCl0.4g葡萄糖1.0g

NaHCO30.35g1%酚紅1.0ml

H2O900ml四、細(xì)胞的凍存將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存的一種技術(shù)對(duì)因?qū)嶒?yàn)意外導(dǎo)致細(xì)胞損失作一備份提供尚未發(fā)生基因漂移的細(xì)胞株利用細(xì)胞凍存的形式來(lái)購(gòu)買、寄贈(zèng)、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞體細(xì)胞可在-135℃至-175℃液氮中保存數(shù)年，在-80℃保存數(shù)月細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑--終濃度5%，15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，使溶液冰點(diǎn)降低，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少細(xì)胞損傷標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1到-2℃/min，當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)吸干已長(zhǎng)滿細(xì)胞的細(xì)胞懂得內(nèi)培養(yǎng)瓶加2ml胰蛋白酶處理細(xì)胞讓液體在細(xì)胞表面來(lái)回流動(dòng)4-5次吸干胰蛋白酶液重復(fù)步驟3和4置37℃3-5分鐘將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面洗下，重懸細(xì)胞于3-5ml培養(yǎng)液中凍存液細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液（RPMI，DMEM等）7ml胎牛血清（FBS）2ml甘油或DMSO1ml五、細(xì)胞的凍復(fù)蘇將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng)，細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)，當(dāng)恢復(fù)到常溫狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常，生化反應(yīng)即可恢復(fù)細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程升溫要快，防止在解凍過(guò)程中水分進(jìn)入細(xì)胞，形成冰晶，影響細(xì)胞存活六、MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力MTT全稱為3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide，漢語(yǔ)化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（商品名：噻唑藍(lán)），是一種黃顏色的染料細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值（也有用570nm波長(zhǎng))，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等靈敏度高、經(jīng)濟(jì)每孔加150ulDMSO，脫色搖床振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。比色：選擇490nm（570nm）波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。藥物MTT法—貼壁細(xì)胞收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100μl,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至103-104cell/孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，一般5-7個(gè)梯度，每孔100μl，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況。5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。藥物MTT法—懸浮細(xì)胞收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序①補(bǔ)足的1640（無(wú)血清）培養(yǎng)基40μl；②加ActinomycinD（有毒性）10μl用培養(yǎng)液稀釋(儲(chǔ)存液100g/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測(cè)物10μl；④細(xì)胞懸液50μl（即5×104cell/孔），共100μl加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100mL1640）。置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入10μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。計(jì)算抑制率[（對(duì)照-本底）-（給藥-本底）]/（對(duì)照-本底）*100%注意事項(xiàng)MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解MTT有致癌性，做好防護(hù)措施MTT對(duì)菌很敏感，保持無(wú)菌環(huán)境選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度，每孔中的細(xì)胞數(shù)可以根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的速度調(diào)整，并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整濃度，太多敏感性降低，太少觀察不到差異鋪板時(shí)要保證每孔鋪的細(xì)胞數(shù)目均勻一致，一般每加幾孔就混勻一下保證培養(yǎng)箱中的濕度，減少開關(guān)培養(yǎng)箱的次數(shù)和時(shí)間檢測(cè)方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臜產(chǎn)物的水溶性差（需加有機(jī)溶劑溶解再檢測(cè)）好好好產(chǎn)品性狀粉末2瓶溶液1瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用即開即用即開即用檢測(cè)靈敏度高很高很高高較長(zhǎng)較短較短較短最短檢測(cè)波長(zhǎng)560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm細(xì)胞毒性高，細(xì)胞形態(tài)完全消失很低，細(xì)胞形態(tài)不變很低，細(xì)胞形態(tài)不變很低，細(xì)胞形態(tài)不變?cè)噭┓€(wěn)定性一般較差一般很好批量樣品檢測(cè)可以非常適合非常適合非常適合便捷程度一般便捷便捷非常便捷七、常見的細(xì)胞染色法簡(jiǎn)單染色法:常用堿性染料如美藍(lán)等進(jìn)行簡(jiǎn)單染色革蘭氏染色法:主要包括結(jié)晶紫初染,碘液媒染在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物,乙醇脫色以及番紅復(fù)染四個(gè)過(guò)程吉姆薩染色法:吉姆薩染液由天青，伊紅組成;嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)合，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。瑞氏染色法:瑞氏染料溶劑主要是由伊紅美藍(lán)組成細(xì)胞免疫熒光染色法:免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合常見的細(xì)胞染色劑酸性品紅(Acidfuchsin)是酸性染料，呈紅色粉末狀，能容于水，略溶於酒精(0.3%)。是良好的細(xì)胞制染色劑，在動(dòng)物制片上應(yīng)用很廣，在植物制片上用來(lái)染皮層、髓部等薄壁細(xì)胞和纖維素壁。它跟甲基綠同染，能顯示線粒體。組織切片在染色前先浸在帶酸性的水中，可增強(qiáng)它的染色力。酸性品紅容易跟堿起作用，所以染色過(guò)度，易在自來(lái)水中褪色。剛果紅(Congored)是酸性染料，呈棗紅色粉末狀，能溶于水和酒精，遇酸呈藍(lán)色。它能作染料，也用作指示劑。它在植物制片中常作為蘇木精或其他細(xì)胞染料的襯墊劑。用來(lái)染細(xì)胞質(zhì)時(shí)，能把膠制或纖維素染成紅色。在動(dòng)物組織制片中用來(lái)染神經(jīng)軸、彈性纖維、胚胎材料等。剛果紅可以跟蘇木精作二重染色，也可用作類淀粉染色，由於它能溶於水和酒精，所以洗滌和脫水處理要迅速固綠(Fastgreen)酸性染料，能溶于水（溶解度為4%）和酒精（溶解度為9%）。固綠是一種染含有漿質(zhì)的纖維素細(xì)胞組織的染色劑，在染細(xì)胞和植物組織上應(yīng)用極廣。它和蘇木精、番紅并列為植物組織學(xué)上三種最常用的染料。伊紅(Eosin)類染料種類很多。常用的伊紅Y，是酸性染料，呈紅色帶藍(lán)的小結(jié)晶或棕色粉末狀，溶於水(15℃溶解度44%)和酒精(無(wú)水酒精中溶解度2%)。伊紅在動(dòng)物制片中廣泛應(yīng)用，是很好的細(xì)胞質(zhì)染料，常用作蘇木精的襯染劑。番紅(Safranin)是堿性染料，能溶於水和酒精。番紅是細(xì)胞學(xué)和動(dòng)植物組織學(xué)生常用的染料，能染細(xì)胞核、染色體和植物蛋白質(zhì)，示維管束植物木質(zhì)化、木栓化和角質(zhì)化的組織，還能染孢子囊。亞甲藍(lán)或美藍(lán)(Methyleneblue)是堿性染料，呈藍(lán)色粉末狀，能溶於水(溶解度9.5%)和酒精(溶解度6%)。亞甲藍(lán)是動(dòng)物學(xué)和細(xì)胞學(xué)染色上十分重要的細(xì)胞核染料，其優(yōu)點(diǎn)是染色不會(huì)過(guò)深。蘇木精（Hematoxylin）無(wú)色棱形晶體，遇光變紅，難溶于冷水和乙醚，易溶于熱水和熱乙醇，溶于堿、氨和硼砂的溶液。在水溶液中，特別是在堿溶液中易被空氣氧化成紅棕色的氧化蘇木精。蘇木精是染細(xì)胞核的優(yōu)良材料，他能把細(xì)胞中不同的結(jié)構(gòu)分化出各種不同的顏色。分化時(shí)組織所染的顏色因處理的情況而異，用酸性溶液（如鹽酸—酒精）分化后呈紅色，水洗后仍恢復(fù)青藍(lán)色，用堿性溶液（如氨水）分化后呈藍(lán)色，水洗后呈藍(lán)黑色。中性紅(Neutralred)弱堿性染料，深綠色結(jié)晶粉末，易溶于水和醇。中性紅是一種弱堿性pH指示劑，變色范圍pH6.4～8.0之間（由紅變黃）。在中性或微堿性環(huán)境中，植物的活細(xì)胞能大量吸收中性紅并向液泡中排泌，由于液泡在一般情況下呈酸性反應(yīng)，因此，進(jìn)入液泡的中性紅便解離出大量陽(yáng)離子而呈現(xiàn)櫻桃紅色，在這種情況下，原生質(zhì)和細(xì)胞壁一般不著色；死細(xì)胞由于原生質(zhì)變性凝固，細(xì)胞液不能維持在液泡內(nèi)，因此，用中性紅染色后，不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象，相反，中性紅的陽(yáng)離子，卻與帶有一定負(fù)電荷的原生質(zhì)及細(xì)胞核結(jié)合，而使原生質(zhì)與細(xì)胞核染色。臺(tái)盼藍(lán)臺(tái)盼藍(lán)（TrypanBlue）黑褐色結(jié)晶粉末，可溶于水，正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。通常認(rèn)為細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡，這與中性紅作用相反。因此，借助臺(tái)盼藍(lán)染色可以非常簡(jiǎn)便、快速地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的死細(xì)胞鑒定染色方法之