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文檔簡介

從大腸桿菌中提取質粒DNA生藥0911黃晶實驗流程實驗原理實驗前準備實驗步驟補充事項實驗流程大腸桿菌置于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)使質粒DNA擴增收集和裂解細菌分離和純化質粒DNA實驗原理在堿性溶液中，雙鏈DNA氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結構破壞而變性，由于質粒DNA分子量相對較小，且呈環(huán)狀超螺旋結構，在高堿性pH條件下兩條互補鏈不會充分分離，當加入中和緩沖液乙酸鉀時變性質粒DNA又恢復到原來的構型；實驗原理線性的大分子量細菌染色體DNA則不能復性與細胞碎片、蛋白質、SDS等形成不溶性復合物，通過離心沉淀，細胞碎片、染色體DNA及大量蛋白質等可被除去，而質粒DNA留在上清液中。再用異丙醇沉淀，乙醇洗滌，可以除去殘留的蛋白質，得到純化的質粒DNA。實驗前準備實驗材料：含有質粒DNA的大腸桿菌DH５α實驗儀器：塑料離心管架；10,100,1000μＬ移液槍；1.5mＬEP離心管；低溫高速離心機一臺；無菌工作臺；高壓鍋；玻璃儀器及滴管等。實驗前準備試劑準備：LB培養(yǎng)基；

pH為8.0的GET緩沖溶液；

0.2mol/L的NaOH(含1%SDS）；

pH為4.8的乙酸鉀溶液；異丙醇溶液及75%乙醇溶液；

pH為8.0TE緩沖液實驗步驟GET緩沖溶液中的EDTA可除去細胞壁上的鈣離子，使溶菌酶更易與細胞壁接觸。加入200μL新配制的0.2mol/LNaOH(含1%SDS)，加蓋，顛倒2~3次，使之混勻，冰浴5min。SDS可使細胞膜裂解蛋白質變性。實驗步驟加入200μL無菌蒸餾水溶解，再加入1/2V的7.5mol/LNH4Ac，混勻后水浴3~5min,12000r/min離心5min,取上清。上清液中加入等體積異丙醇或兩倍體積無水乙醇，室溫置5min,12000r/min離心30min,棄上清。補充事項質粒DNA的提取以堿裂解法分離，提取，純化質粒DNA最為常用。堿裂解法適用于小量質粒DNA的提取。LB培養(yǎng)基配方：1L中含有胰蛋白胨10g，NaCL10g,瓊脂糖或瓊脂15g，用NaOH調至pH為8.0。補充事項pH為8.0GET緩沖液：50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA,25mmol/LTris-

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