人教版選修三12《基因工程的基本操作程序》課件

1．2基因工程的基本操作程序1．2基因工程的基本操作程序1學(xué)習(xí)導(dǎo)航1.掌握目的基因獲取的常見方法。

[難點(diǎn)]2.學(xué)會基因表達(dá)載體構(gòu)建的方法和要求。

[重點(diǎn)]3.理解目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的具體過程。4.掌握目的基因檢測與鑒定的具體操作。

[要點(diǎn)]學(xué)習(xí)導(dǎo)航2新知初探思維啟動一、目的基因的獲取1..從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物的不同______的DNA片段導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物不同的基因，稱為基因文庫。基因新知初探思維啟動一、目的基因的獲取基因3基因文庫包括兩種：________文庫，即包含一種生物所有基因的文庫；__________文庫,即只包含一種生物的一部分基因的文庫，如cDNA文庫。2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因(1)PCR的含義：是一項(xiàng)在生物______復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。(2)目的：短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。(3)原理：________________?；蚪M部分基因體外DNA雙鏈復(fù)制基因文庫包括兩種：________文庫，即包含一種生物所有基4(4)過程：第一步：加熱至90～95℃,_______________

;第二步：冷卻至_________℃，引物與兩條單鏈DNA相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。如此重復(fù)循環(huán)多次。(5)特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增。DNA解鏈為單鏈55～60(4)過程：DNA解鏈為單鏈55～605想一想1．PCR過程中，需要解旋酶嗎？所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有什么特點(diǎn)？【提示】

PCR過程中，DNA雙鏈解開是在高溫下完成的，不需要解旋酶；由于PCR過程溫度較高，所以需要能耐高溫的DNA聚合酶。想一想63.用化學(xué)方法人工合成如果基因比較___,核苷酸序列又已知,也可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的組成：必須有啟動子、____________、終止子以及標(biāo)記基因等。小目的基因3.用化學(xué)方法人工合成小目的基因7三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1..轉(zhuǎn)化___________進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱為轉(zhuǎn)化。2.常用的導(dǎo)入方法(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：采用最多的方法是________轉(zhuǎn)化法，其次還有基因槍法和花粉管通道法。目的基因農(nóng)桿菌三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因農(nóng)桿菌8(2)將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞：最常用的方法是__________技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是_________。(3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法：①用_______處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生物狀態(tài),這種細(xì)胞稱為________細(xì)胞。②將重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定溫度下完成轉(zhuǎn)化過程。顯微注射受精卵Ca2＋感受態(tài)(2)將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞：最常用的方法是________9想一想2．從細(xì)胞器的功能上分析，若通過基因工程生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？【提示】不可以，糖蛋白上的糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成的，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌是原核生物，細(xì)胞中不含有這兩種細(xì)胞器。想一想10四、目的基因的檢測與鑒定1..首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了_________,方法是采用______________技術(shù)。2.其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了________,方法是采用__________技術(shù)。目的基因DNA分子雜交mRNA分子雜交四、目的基因的檢測與鑒定目的基因DNA分子雜交mRNA分子雜113.最后檢測目的基因是否翻譯成________,從分子水平檢測的方法是采用______________技術(shù)。4.有時(shí)還需進(jìn)行___________水平的鑒定。如需要做抗蟲或抗病的接種實(shí)驗(yàn)等。蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交個(gè)體生物學(xué)3.最后檢測目的基因是否翻譯成________,從分子水平檢12要點(diǎn)突破講練互動要點(diǎn)一“目的基因的獲取”應(yīng)注意的幾個(gè)問題1..PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的比較比較項(xiàng)目DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所細(xì)胞內(nèi)(主要在細(xì)胞核內(nèi))細(xì)胞外(主要在PCR擴(kuò)增儀中)要點(diǎn)突破講練互動要點(diǎn)一“目的基因的獲取”應(yīng)注意的幾個(gè)問題比13比較項(xiàng)目DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別酶DNA解旋酶、DNA聚合酶耐熱的DNA聚合酶溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件控制溫度，需90℃～95℃高溫結(jié)果合成DNA分子合成DNA片段或基因聯(lián)系(1)模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板(2)原料：均為四種脫氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸比較項(xiàng)目DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別酶DNA解旋酶、DNA聚合酶142.人工合成目的基因常用方法人工合成目的基因的方法主要有兩種。(1)反轉(zhuǎn)錄法，主要用于相對分子質(zhì)量較大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA為模板，借助反轉(zhuǎn)錄酶合成堿基互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，其過程如下：2.人工合成目的基因常用方法15(2)化學(xué)合成法，即依照某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列，通過密碼子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因，其過程如下：(2)化學(xué)合成法，即依照某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列，通過密碼子推16(2012·青島市高二期末)1970年，科學(xué)家證實(shí)了RNA病毒能依賴RNA合成DNA的過程，并發(fā)現(xiàn)了催化此過程的酶。下面為形成cDNA的過程和PCR擴(kuò)增過程示意圖。請根據(jù)圖解回答下列問題：例1(2012·青島市高二期末)17(1)催化①過程的酶是________；核酸酶H的作用是________。(2)③過程也稱為DNA的變性，此過程在溫度高達(dá)90～95℃時(shí)才能完成，說明DNA分子具有________性。(1)催化①過程的酶是________；核酸酶H的作用是__18(3)由圖中信息分析可知，催化②⑤過程的酶都是______________，兩者在作用特性上的區(qū)別是________________________________________________________________________。(4)如果RNA單鏈中有堿基100個(gè)，其中A占25%，U占15%，則通過該過程合成的一個(gè)雙鏈DNA片段中有胞嘧啶________個(gè)。(3)由圖中信息分析可知，催化②⑤過程的酶都是_______19【解析】根據(jù)圖示可以看出，該過程是RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下形成cDNA(負(fù)鏈DNA)，構(gòu)成RNA—DNA中間體。中間體中的RNA再經(jīng)過RNA酶H水解，而以剩下的負(fù)鏈DNA復(fù)制成雙鏈DNA。①過程是由RNA合成DNA的過程，需要逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行催化。②過程是以單鏈DNA復(fù)制獲得雙鏈DNA的過程需要DNA聚合酶催化。【解析】根據(jù)圖示可以看出，該過程是RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作20⑤屬于雙鏈DNA復(fù)制的過程，需要DNA聚合酶催化。⑤過程在70～75℃環(huán)境下進(jìn)行，所需要的酶能夠耐高溫?！敬鸢浮?/p>

(1)反轉(zhuǎn)錄酶(或逆轉(zhuǎn)錄酶)分解RNA(2)穩(wěn)定(3)DNA聚合酶催化⑤過程的酶耐高溫(4)60⑤屬于雙鏈DNA復(fù)制的過程，需要DNA聚合酶催化。⑤過程在721互動探究(1)上述過程中需要限制酶和DNA連接酶嗎？(2)由mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成的DNA具有啟動子嗎?【提示】

(1)不需要。(2)無?；犹骄?2【探規(guī)尋律】

(1)PCR技術(shù)不需要解旋酶，但需利用90～95℃高溫使DNA分子解旋。(2)PCR技術(shù)的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列合成引物。(3)PCR技術(shù)需要耐高溫的DNA聚合酶【探規(guī)尋律】(1)PCR技術(shù)不需要解旋酶，但需利用90～923要點(diǎn)二基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(1)啟動子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，可驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄。要點(diǎn)二基因表達(dá)載體的構(gòu)建24(2)目的基因：編碼相關(guān)蛋白質(zhì)，形成基因工程產(chǎn)品或產(chǎn)生新的生物性狀。(3)終止子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段,位于基因的尾端，作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。(4)標(biāo)記基因：一般為抗生素抗性基因或熒光基因等，其作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因(目的基因是否導(dǎo)入成功)。(2)目的基因：編碼相關(guān)蛋白質(zhì)，形成基因工程產(chǎn)品或產(chǎn)生新的生253.基因表達(dá)載體應(yīng)具備的條件(1)對受體細(xì)胞無害，不影響受體細(xì)胞的正常生理活動；(2)能自我復(fù)制，能通過復(fù)制進(jìn)行基因擴(kuò)增；(3)具有標(biāo)記基因，以便于鑒定目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞；(4)重組DNA大小應(yīng)適合，以方便操作。3.基因表達(dá)載體應(yīng)具備的條件26特別提醒

(1)用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含目的基因的DNA分子的目的是產(chǎn)生相同的黏性末端，便于兩者完成拼接。(2)終止子與終止密碼子的區(qū)別①終止子是DNA分子上決定轉(zhuǎn)錄停止的一段DNA序列，其組成單位是脫氧核苷酸；②終止密碼子是指mRNA分子上決定翻譯停止的三個(gè)相鄰堿基，其組成單位是核糖核苷酸。特別提醒(1)用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含目的基因的DNA分27(2012·南師大附中高二檢測)如圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，ampR為青霉素抗性基因，tetR為四環(huán)素抗性基因,P為啟動子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別含有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。例2(2012·南師大附中高二檢測28人教版選修三12《基因工程的基本操作程序》29(1)將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒表達(dá)載體分別用EcoRⅠ

酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接后，其中由兩個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有________________、________________、________________三種。若要從這些連接物中分離出重組質(zhì)粒，需要對這些連接產(chǎn)物進(jìn)行____________________________________________________________。(1)將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒表達(dá)載體分別用EcoRⅠ30(2)用上述3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是________。(3)目的基因表達(dá)時(shí)，RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)是________，其合成的產(chǎn)物是________________________________________________________________________。(2)用上述3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞接種到含31(4)在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接,酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是________。【答案】

(1)目的基因—載體連接物載體—載體連接物目的基因—目的基因連接物分離純化(2)載體—載體連接物(3)啟動子mRNA(4)EcoRⅠ和BamHⅠ(只答一種酶不可)(4)在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)32【誤區(qū)警示】

(1)切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶一般是同一種酶，以獲得互補(bǔ)的末端，利于重組質(zhì)粒的構(gòu)建。(2)目的基因的首端和尾端需加上啟動子和終止子?！菊`區(qū)警示】(1)切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶一般是同一種酶33要點(diǎn)三將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞不同受體細(xì)胞的常用導(dǎo)入方法受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)Ca2＋處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞要點(diǎn)三將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物34受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例將目的基因插入Ti質(zhì)粒的TDNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的DNA上→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例35特別提醒

(1)完成基因表達(dá)載體的構(gòu)建，需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。(2)Ca2＋(或CaCl2溶液)對微生物細(xì)胞的作用是增加細(xì)胞壁的通透性。(3)目的基因能否在植株細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并表達(dá)的關(guān)鍵是目的基因是否插入到受體細(xì)胞染色體DNA上(利用的原理是基因重組)。特別提醒(1)完成基因表達(dá)載體的構(gòu)建，需要限制性核酸內(nèi)切酶36科學(xué)家通過基因工程的方法，將蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉株細(xì)胞內(nèi)，并成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，從而培育出了能抗棉鈴蟲的棉花植株——抗蟲棉。其過程大致如圖所示，請分析回答：例3科學(xué)家通過基因工程的方法，將蘇云金芽37(1)Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌中的一種質(zhì)粒，其上有TDNA，把目的基因插入Ti質(zhì)粒的TDNA是利用TDNA__________________________________________________________________________________________的特點(diǎn)。(2)Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉株細(xì)胞內(nèi)并成功實(shí)現(xiàn)表達(dá)的過程，在基因工程中稱為________________。(1)Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌中的一種質(zhì)粒，其上有TDNA，把目的38(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有很多種,該題中涉及的是________________。(4)目的基因能否在棉株內(nèi)穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是__________________?！窘馕觥勘绢}以抗蟲棉的培育過程為背景,考查了運(yùn)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因作物的步驟、方法。(1)Ti質(zhì)粒的最大優(yōu)點(diǎn)是能將目的基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞的染色體DNA中，從而使目的基因在棉花體內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)。(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有很多種,該題中涉及的是_39(2)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化。(3)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法很多，以農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒為目的基因載體的稱為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(4)目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因。(2)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)40【答案】

(1)可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上(2)轉(zhuǎn)化(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(4)目的基因是否插入到受體細(xì)胞染色體DNA上【答案】(1)可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并且整合到受體細(xì)胞染色體DN41【探規(guī)尋律】目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的結(jié)果【探規(guī)尋律】目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的結(jié)果42要點(diǎn)四目的基因的檢測與鑒定類型步驟目的原理過程結(jié)果分子水平檢測第一步轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入了目的基因DNA分子雜交含目的基因的DNA探針與轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA分子雜交若有雜交帶，說明插入成功第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交含目的基因的DNA探針與轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交若有雜交帶，說明轉(zhuǎn)錄成功要點(diǎn)四目的基因的檢測與鑒定類型步驟目的原理過程結(jié)果分子水平43類型步驟目的原理過程結(jié)果分子水平檢測第三步目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交提取蛋白質(zhì),與已知的相應(yīng)抗體雜交若有雜交帶，表明翻譯成功個(gè)體水平鑒定做抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較，以確定功能是否相同類型步驟目的原理過程結(jié)果分子水平檢測第三步目的基因是否翻44(2011·高考海南卷)回答有關(guān)基因工程的問題：(1)構(gòu)建基因工程表達(dá)載體時(shí)，用不同類型的限制酶切割DNA后，可能產(chǎn)生黏性末端，也可能產(chǎn)生________末端。若要在限制酶切割目的基因和質(zhì)粒后使其直接進(jìn)行連接，則應(yīng)選擇能使二者產(chǎn)生________(相同、不同)黏性末端的限制酶。例4(2011·高考海南卷)回答有關(guān)45(2)利用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素時(shí)，構(gòu)建的表達(dá)載體含有人胰島素基因及其啟動子等，其中啟動子的作用是________。在用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，常用________處理大腸桿菌，以利于表達(dá)載體進(jìn)入；為了檢測胰島素基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，可用標(biāo)記的胰島素基因片段作探針與mRNA雜交，該雜交技術(shù)稱為________。為了檢測胰島素基因轉(zhuǎn)錄的mRNA是否翻譯成________，常用抗原—抗體雜交技術(shù)。(2)利用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素時(shí)，構(gòu)建的表達(dá)載體含有人胰島素46(3)如果要將某目的基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入植物細(xì)胞，先要將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的________中，然后用該農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，通過DNA重組將目的基因插入植物細(xì)胞的________上?！窘馕觥?/p>

(1)限制酶切割產(chǎn)生兩種末端：黏性末端和平末端；若用DNA連接酶連接兩個(gè)末端，兩個(gè)末端必須是相同的。(3)如果要將某目的基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入植物細(xì)胞，先要將47(2)基因工程檢測的方法：檢測目的基因是否導(dǎo)入，使用DNA分子雜交技術(shù)；檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄，使用分子雜交技術(shù)；檢測是否形成蛋白質(zhì)，使用抗原—抗體雜交技術(shù)。(3)基因工程的目的是獲得穩(wěn)定遺傳的新品種,因此要把目的基因插入到染色體的DNA分子中。(2)基因工程檢測的方法：檢測目的基因是否導(dǎo)入，使用DNA分48【答案】

(1)平相同(2)RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位Ca2＋

DNA分子雜交技術(shù)蛋白質(zhì)(3)TDNA染色體DNA【答案】(1)平相同49變式訓(xùn)練(2012·廣州六中高二檢測)利用外源基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，可生產(chǎn)人類所需的產(chǎn)品。下列選項(xiàng)中能說明目的基因完成表達(dá)的是(

)A．棉花細(xì)胞中檢測到載體上的標(biāo)記基因B．山羊乳腺細(xì)胞中檢測到人生長激素的基因C．大腸桿菌中檢測到人胰島素基因的mRNAD．酵母菌細(xì)胞中提取到人的干擾素變式訓(xùn)練50解析：選D?；虻谋磉_(dá)即控制蛋白質(zhì)的合成，包括轉(zhuǎn)錄和翻譯，僅僅轉(zhuǎn)錄出mRNA還不能叫表達(dá)，只有合成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)才能證明目的基因完成了在受體細(xì)胞中的表達(dá)。解析：選D。基因的表達(dá)即控制蛋白質(zhì)的合成，包括轉(zhuǎn)錄和翻譯，僅51【易誤警示】

(1)目的基因檢測與鑒定的三個(gè)步驟，都是在體外進(jìn)行的。(2)在DNA分子、mRNA分子上檢測目的基因是否插入、目的基因是否轉(zhuǎn)錄時(shí)，用的探針都是用放射性同位素等標(biāo)記含有目的基因的DNA片段?！疽渍`警示】(1)目的基因檢測與鑒定的三個(gè)步驟，都是在體外52知能演練輕巧奪冠知能演練輕巧奪冠53本部分內(nèi)容講解結(jié)束按ESC鍵退出全屏播放本部分內(nèi)容講解結(jié)束按ESC鍵退出全屏播放54人教版選修三12《基因工程的基本操作程序》551．2基因工程的基本操作程序1．2基因工程的基本操作程序56學(xué)習(xí)導(dǎo)航1.掌握目的基因獲取的常見方法。

[難點(diǎn)]2.學(xué)會基因表達(dá)載體構(gòu)建的方法和要求。

[重點(diǎn)]3.理解目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的具體過程。4.掌握目的基因檢測與鑒定的具體操作。

[要點(diǎn)]學(xué)習(xí)導(dǎo)航57新知初探思維啟動一、目的基因的獲取1..從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物的不同______的DNA片段導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物不同的基因，稱為基因文庫?；蛐轮跆剿季S啟動一、目的基因的獲取基因58基因文庫包括兩種：________文庫，即包含一種生物所有基因的文庫；__________文庫,即只包含一種生物的一部分基因的文庫，如cDNA文庫。2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因(1)PCR的含義：是一項(xiàng)在生物______復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。(2)目的：短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。(3)原理：________________。基因組部分基因體外DNA雙鏈復(fù)制基因文庫包括兩種：________文庫，即包含一種生物所有基59(4)過程：第一步：加熱至90～95℃,_______________

;第二步：冷卻至_________℃，引物與兩條單鏈DNA相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。如此重復(fù)循環(huán)多次。(5)特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增。DNA解鏈為單鏈55～60(4)過程：DNA解鏈為單鏈55～6060想一想1．PCR過程中，需要解旋酶嗎？所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有什么特點(diǎn)？【提示】

PCR過程中，DNA雙鏈解開是在高溫下完成的，不需要解旋酶；由于PCR過程溫度較高，所以需要能耐高溫的DNA聚合酶。想一想613.用化學(xué)方法人工合成如果基因比較___,核苷酸序列又已知,也可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的組成：必須有啟動子、____________、終止子以及標(biāo)記基因等。小目的基因3.用化學(xué)方法人工合成小目的基因62三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1..轉(zhuǎn)化___________進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱為轉(zhuǎn)化。2.常用的導(dǎo)入方法(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：采用最多的方法是________轉(zhuǎn)化法，其次還有基因槍法和花粉管通道法。目的基因農(nóng)桿菌三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因農(nóng)桿菌63(2)將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞：最常用的方法是__________技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是_________。(3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法：①用_______處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生物狀態(tài),這種細(xì)胞稱為________細(xì)胞。②將重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定溫度下完成轉(zhuǎn)化過程。顯微注射受精卵Ca2＋感受態(tài)(2)將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞：最常用的方法是________64想一想2．從細(xì)胞器的功能上分析，若通過基因工程生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？【提示】不可以，糖蛋白上的糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成的，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌是原核生物，細(xì)胞中不含有這兩種細(xì)胞器。想一想65四、目的基因的檢測與鑒定1..首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了_________,方法是采用______________技術(shù)。2.其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了________,方法是采用__________技術(shù)。目的基因DNA分子雜交mRNA分子雜交四、目的基因的檢測與鑒定目的基因DNA分子雜交mRNA分子雜663.最后檢測目的基因是否翻譯成________,從分子水平檢測的方法是采用______________技術(shù)。4.有時(shí)還需進(jìn)行___________水平的鑒定。如需要做抗蟲或抗病的接種實(shí)驗(yàn)等。蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交個(gè)體生物學(xué)3.最后檢測目的基因是否翻譯成________,從分子水平檢67要點(diǎn)突破講練互動要點(diǎn)一“目的基因的獲取”應(yīng)注意的幾個(gè)問題1..PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的比較比較項(xiàng)目DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所細(xì)胞內(nèi)(主要在細(xì)胞核內(nèi))細(xì)胞外(主要在PCR擴(kuò)增儀中)要點(diǎn)突破講練互動要點(diǎn)一“目的基因的獲取”應(yīng)注意的幾個(gè)問題比68比較項(xiàng)目DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別酶DNA解旋酶、DNA聚合酶耐熱的DNA聚合酶溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件控制溫度，需90℃～95℃高溫結(jié)果合成DNA分子合成DNA片段或基因聯(lián)系(1)模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板(2)原料：均為四種脫氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸比較項(xiàng)目DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別酶DNA解旋酶、DNA聚合酶692.人工合成目的基因常用方法人工合成目的基因的方法主要有兩種。(1)反轉(zhuǎn)錄法，主要用于相對分子質(zhì)量較大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA為模板，借助反轉(zhuǎn)錄酶合成堿基互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，其過程如下：2.人工合成目的基因常用方法70(2)化學(xué)合成法，即依照某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列，通過密碼子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因，其過程如下：(2)化學(xué)合成法，即依照某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列，通過密碼子推71(2012·青島市高二期末)1970年，科學(xué)家證實(shí)了RNA病毒能依賴RNA合成DNA的過程，并發(fā)現(xiàn)了催化此過程的酶。下面為形成cDNA的過程和PCR擴(kuò)增過程示意圖。請根據(jù)圖解回答下列問題：例1(2012·青島市高二期末)72(1)催化①過程的酶是________；核酸酶H的作用是________。(2)③過程也稱為DNA的變性，此過程在溫度高達(dá)90～95℃時(shí)才能完成，說明DNA分子具有________性。(1)催化①過程的酶是________；核酸酶H的作用是__73(3)由圖中信息分析可知，催化②⑤過程的酶都是______________，兩者在作用特性上的區(qū)別是________________________________________________________________________。(4)如果RNA單鏈中有堿基100個(gè)，其中A占25%，U占15%，則通過該過程合成的一個(gè)雙鏈DNA片段中有胞嘧啶________個(gè)。(3)由圖中信息分析可知，催化②⑤過程的酶都是_______74【解析】根據(jù)圖示可以看出，該過程是RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下形成cDNA(負(fù)鏈DNA)，構(gòu)成RNA—DNA中間體。中間體中的RNA再經(jīng)過RNA酶H水解，而以剩下的負(fù)鏈DNA復(fù)制成雙鏈DNA。①過程是由RNA合成DNA的過程，需要逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行催化。②過程是以單鏈DNA復(fù)制獲得雙鏈DNA的過程需要DNA聚合酶催化?！窘馕觥扛鶕?jù)圖示可以看出，該過程是RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作75⑤屬于雙鏈DNA復(fù)制的過程，需要DNA聚合酶催化。⑤過程在70～75℃環(huán)境下進(jìn)行，所需要的酶能夠耐高溫?！敬鸢浮?/p>

(1)反轉(zhuǎn)錄酶(或逆轉(zhuǎn)錄酶)分解RNA(2)穩(wěn)定(3)DNA聚合酶催化⑤過程的酶耐高溫(4)60⑤屬于雙鏈DNA復(fù)制的過程，需要DNA聚合酶催化。⑤過程在776互動探究(1)上述過程中需要限制酶和DNA連接酶嗎？(2)由mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成的DNA具有啟動子嗎?【提示】

(1)不需要。(2)無?；犹骄?7【探規(guī)尋律】

(1)PCR技術(shù)不需要解旋酶，但需利用90～95℃高溫使DNA分子解旋。(2)PCR技術(shù)的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列合成引物。(3)PCR技術(shù)需要耐高溫的DNA聚合酶【探規(guī)尋律】(1)PCR技術(shù)不需要解旋酶，但需利用90～978要點(diǎn)二基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(1)啟動子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，可驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄。要點(diǎn)二基因表達(dá)載體的構(gòu)建79(2)目的基因：編碼相關(guān)蛋白質(zhì)，形成基因工程產(chǎn)品或產(chǎn)生新的生物性狀。(3)終止子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段,位于基因的尾端，作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。(4)標(biāo)記基因：一般為抗生素抗性基因或熒光基因等，其作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因(目的基因是否導(dǎo)入成功)。(2)目的基因：編碼相關(guān)蛋白質(zhì)，形成基因工程產(chǎn)品或產(chǎn)生新的生803.基因表達(dá)載體應(yīng)具備的條件(1)對受體細(xì)胞無害，不影響受體細(xì)胞的正常生理活動；(2)能自我復(fù)制，能通過復(fù)制進(jìn)行基因擴(kuò)增；(3)具有標(biāo)記基因，以便于鑒定目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞；(4)重組DNA大小應(yīng)適合，以方便操作。3.基因表達(dá)載體應(yīng)具備的條件81特別提醒

(1)用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含目的基因的DNA分子的目的是產(chǎn)生相同的黏性末端，便于兩者完成拼接。(2)終止子與終止密碼子的區(qū)別①終止子是DNA分子上決定轉(zhuǎn)錄停止的一段DNA序列，其組成單位是脫氧核苷酸；②終止密碼子是指mRNA分子上決定翻譯停止的三個(gè)相鄰堿基，其組成單位是核糖核苷酸。特別提醒(1)用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含目的基因的DNA分82(2012·南師大附中高二檢測)如圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，ampR為青霉素抗性基因，tetR為四環(huán)素抗性基因,P為啟動子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別含有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。例2(2012·南師大附中高二檢測83人教版選修三12《基因工程的基本操作程序》84(1)將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒表達(dá)載體分別用EcoRⅠ

酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接后，其中由兩個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有________________、________________、________________三種。若要從這些連接物中分離出重組質(zhì)粒，需要對這些連接產(chǎn)物進(jìn)行____________________________________________________________。(1)將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒表達(dá)載體分別用EcoRⅠ85(2)用上述3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是________。(3)目的基因表達(dá)時(shí)，RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)是________，其合成的產(chǎn)物是________________________________________________________________________。(2)用上述3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞接種到含86(4)在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接,酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是________?！敬鸢浮?/p>

(1)目的基因—載體連接物載體—載體連接物目的基因—目的基因連接物分離純化(2)載體—載體連接物(3)啟動子mRNA(4)EcoRⅠ和BamHⅠ(只答一種酶不可)(4)在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)87【誤區(qū)警示】

(1)切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶一般是同一種酶，以獲得互補(bǔ)的末端，利于重組質(zhì)粒的構(gòu)建。(2)目的基因的首端和尾端需加上啟動子和終止子?！菊`區(qū)警示】(1)切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶一般是同一種酶88要點(diǎn)三將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞不同受體細(xì)胞的常用導(dǎo)入方法受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)Ca2＋處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞要點(diǎn)三將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物89受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例將目的基因插入Ti質(zhì)粒的TDNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的DNA上→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子受體細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例90特別提醒

(1)完成基因表達(dá)載體的構(gòu)建，需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。(2)Ca2＋(或CaCl2溶液)對微生物細(xì)胞的作用是增加細(xì)胞壁的通透性。(3)目的基因能否在植株細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并表達(dá)的關(guān)鍵是目的基因是否插入到受體細(xì)胞染色體DNA上(利用的原理是基因重組)。特別提醒(1)完成基因表達(dá)載體的構(gòu)建，需要限制性核酸內(nèi)切酶91科學(xué)家通過基因工程的方法，將蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉株細(xì)胞內(nèi)，并成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，從而培育出了能抗棉鈴蟲的棉花植株——抗蟲棉。其過程大致如圖所示，請分析回答：例3科學(xué)家通過基因工程的方法，將蘇云金芽92(1)Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌中的一種質(zhì)粒，其上有TDNA，把目的基因插入Ti質(zhì)粒的TDNA是利用TDNA__________________________________________________________________________________________的特點(diǎn)。(2)Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉株細(xì)胞內(nèi)并成功實(shí)現(xiàn)表達(dá)的過程，在基因工程中稱為________________。(1)Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌中的一種質(zhì)粒，其上有TDNA，把目的93(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有很多種,該題中涉及的是________________。(4)目的基因能否在棉株內(nèi)穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是__________________?！窘馕觥勘绢}以抗蟲棉的培育過程為背景,考查了運(yùn)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因作物的步驟、方法。(1)Ti質(zhì)粒的最大優(yōu)點(diǎn)是能將目的基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞的染色體DNA中，從而使目的基因在棉花體內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)。(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有很多種,該題中涉及的是_94(2)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化。(3)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法很多，以農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒為目的基因載體的稱為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(4)目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因。(2)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)95【答案】

(1)可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上(2)轉(zhuǎn)化(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(4)目的基因是否插入到受體細(xì)胞染色體DNA上【答案】(1)可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并且整合到受體細(xì)胞染色體DN96【探規(guī)尋律】目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的結(jié)果【探規(guī)尋律】目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的結(jié)果97要點(diǎn)四目的基因的檢測與鑒定類型步驟目的原理過程結(jié)果分子水平檢測第一步轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入了目的基因DNA分子雜交含目的