多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片斷

關(guān)于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片斷第一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日★分子生物學(xué)研究中最強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一★其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過(guò)程美國(guó)科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎(jiǎng)第二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日㈠.DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一.基礎(chǔ)知識(shí)脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥(niǎo)嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）第三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日一個(gè)核苷酸上的磷酸基團(tuán)上的“－OH”和另一個(gè)核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過(guò)3’、5’、磷酸二酯鍵彼此連接起來(lái)形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“－OH”末端稱(chēng)為3’端，而磷酸基團(tuán)的末端稱(chēng)為5’端3.多脫氧核苷酸鏈得形成多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖第四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)⑴.DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤(pán)旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。⑵.

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。⑶.兩條鏈上的堿基通過(guò)

連結(jié)起來(lái)，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與

配對(duì)，

一定同胞嘧啶配對(duì)。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥(niǎo)嘌呤第五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日㈡.DNA的復(fù)制2.時(shí)期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期。3.場(chǎng)所細(xì)胞核（主要）、線粒體、葉綠體。1.概念由一個(gè)DNA形成兩個(gè)完全相同的DNA的過(guò)程。4.基本條件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈第六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日⑴.邊解旋邊復(fù)制(過(guò)程）5.復(fù)制特點(diǎn)⑵.半保留復(fù)制（結(jié)果）6.遵循原則：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則7.精確復(fù)制的原因8.復(fù)制的意義DNA分子通過(guò)復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性⑴規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板⑵堿基互補(bǔ)配對(duì)能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無(wú)誤的進(jìn)行第七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日總結(jié)：胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系打開(kāi)DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸第八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日(二）PCR原理及條件1．概念：PCR即_______________，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。它能以極少量的_____為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA2．DNA的平面結(jié)構(gòu)：AGCT5'端3'端氫鍵ATGC3'端:-OH端5'端:磷酸基團(tuán)的末端注意：1、DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能從3‘端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物

2、DNA的合成方向總是從子鏈的5‘端向3‘端延伸第九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日（1）、DNA

分子的熱變性原理DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：復(fù)性的目的：解開(kāi)雙鏈有利于引物與兩條單鏈結(jié)合在80~100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為變性。3、PCR原理第十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日①在80－100°C的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為變性.②當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈.

高溫雖然打開(kāi)了雙鏈，可會(huì)導(dǎo)致酶失活。怎么辦？

第十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化.3、TaqDNA聚合酶的應(yīng)用第十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）、PCR反應(yīng)的條件①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）；③四種脫氧核苷酸；④耐高溫的聚合酶（TaqDNA聚合酶）；⑤控制溫度，但不需解旋酶；⑥需要在一定的緩沖液中進(jìn)行。第十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)1~3步30輪（2）、步驟：變性——復(fù)性——延伸第十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開(kāi)DNA雙鏈模板合成子鏈原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸

思考：3、體內(nèi)DNA復(fù)制的條件是什么？體外擴(kuò)增DNA如何提供相似環(huán)境？

變性（80-100℃

）Taq聚合酶（耐高溫）20—30個(gè)核苷酸構(gòu)成DNA或RNA第十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制與PCR的比較第十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日DNA聚合酶與DNA連接酶的異同第十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等特點(diǎn)。6

、PCR技術(shù)的特點(diǎn)第十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日（五）PCR的反應(yīng)過(guò)程1、PCR的反應(yīng)步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟──變性、復(fù)性和延伸①變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備2、循環(huán)過(guò)程第十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性第二十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日②復(fù)性（退火）

模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合第二十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火第二十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日③延伸DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈第二十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸第二十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日靶序列

靶序列第1個(gè)PCR循環(huán)完成后：得到兩個(gè)拷貝的靶序列第二十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第二十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日4、循環(huán)特點(diǎn)：①上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板②結(jié)果單鏈中有最初母鏈的只兩條（無(wú)引物存在于兩個(gè)子代DNA分子中③其它子代DNA分子都為雙引物分子式④處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長(zhǎng)1×2N①②第二十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日4、PCR循環(huán)的結(jié)果②DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增①?gòu)牡诙喲h(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸第二十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日3、30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量第二十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日PCR反應(yīng)條件：

①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境②DNA模板③分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物④A、T、G、C四種脫氧核苷酸

⑤耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶

⑥能?chē)?yán)格控制溫度變化的溫控設(shè)備第三十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日1、PCR儀㈠.設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。二.PCR的實(shí)驗(yàn)操作第三十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。第三十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日微量離心管微量移液器第三十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日1、準(zhǔn)備2、移液（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟

按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑第三十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日①過(guò)程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁②注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻A、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢第三十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序①過(guò)程：將微量離心管放在離心機(jī)上,離心約10s4、離心5、反應(yīng)②離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果第三十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日PCR三步曲

預(yù)變性保溫變性94℃30s延伸72℃1min復(fù)性55℃30s94℃5min第三十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第三十八頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：6、注意事項(xiàng)①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；②分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭第三十九頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算三、課題成果評(píng)價(jià)1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1、原理可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)第四十頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日稀釋2μLPCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋對(duì)照調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零測(cè)定取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值計(jì)算DNA含量（g/ml）＝50×(260nm的讀數(shù)）×稀釋倍數(shù)2.過(guò)程第四十一頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日第四十二頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日比色杯第四十三頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日PCR的突出優(yōu)點(diǎn)快速高效靈活易于操作四、課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）第四十四頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日五、實(shí)驗(yàn)小結(jié)PCR儀加熱使（）變性,復(fù)性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（）為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,經(jīng)（）三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過(guò)30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍;將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見(jiàn)到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。模板互補(bǔ)Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復(fù)性和延伸72℃第四十五頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日1.提示：繪圖可參考教科書(shū)中圖5-9。PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個(gè)這樣的片段（2n=230=1073741824)。2.提示：PCR引物是根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)的。引物的設(shè)計(jì)需要豐富的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，感興趣的學(xué)生可以參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（見(jiàn)本專(zhuān)題參考書(shū)目），書(shū)中有詳盡的論述。書(shū)后題第四十六頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月28日㈠.理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算三.課題成果評(píng)價(jià)1.一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2.a條DNA，復(fù)制n次，DNA為a×2n㈡.實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1.原理可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。2.過(guò)程⑴.稀釋2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋.第四十七頁(yè)，共五十二頁(yè)，2022年，8月