細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室

鄧惠華細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室1

組織培養(yǎng)的基本概念和發(fā)展簡(jiǎn)史

早期培養(yǎng)組織培養(yǎng)的建立與發(fā)展現(xiàn)代組織培養(yǎng)

組織培養(yǎng)的基本概念和發(fā)展簡(jiǎn)史

早期培養(yǎng)2體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型

貼壁型細(xì)胞上皮細(xì)胞型

成纖維細(xì)胞型

游走細(xì)胞型懸浮型細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型

貼壁型細(xì)胞3培養(yǎng)細(xì)胞的生命期

原代培養(yǎng)期

原代培養(yǎng)與體內(nèi)原組織很相似，具異質(zhì)性，相互依存性強(qiáng)，細(xì)胞克隆形成率低。此期一般持續(xù)1～4周。傳代期

持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，其特點(diǎn)是細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。衰退期

培養(yǎng)細(xì)胞的生命期

原代培養(yǎng)期

原代培養(yǎng)與體內(nèi)原組織很相似4細(xì)胞培養(yǎng)一代的生長(zhǎng)過程

傳代是將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶皿轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)瓶皿內(nèi)生長(zhǎng)培養(yǎng)一代單個(gè)細(xì)胞可倍增3－6倍

游離期指數(shù)增殖期停止期細(xì)胞培養(yǎng)一代的生長(zhǎng)過程

傳代是將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶皿轉(zhuǎn)移到另一5細(xì)胞分裂數(shù)量

作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的一個(gè)重要指標(biāo)，以細(xì)胞分裂指數(shù)（mitoticindex,MI）來表示。MI是指100個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)。一般細(xì)胞的MI為0.2％－0.5％，無限傳代細(xì)胞系或腫瘤細(xì)胞的MI可高達(dá)3％－5％。細(xì)胞分裂數(shù)量

作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的一個(gè)重要指標(biāo)，以細(xì)胞6在傳代期培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意的問題為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在傳代后早期凍存（10代內(nèi)凍存）。少數(shù)細(xì)胞系在此期可能發(fā)生自發(fā)或誘發(fā)轉(zhuǎn)化，獲得不死性而成為無限細(xì)胞系，此時(shí)細(xì)胞核型多變成異倍體。在傳代期培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意的問題7建立細(xì)胞系（株）的要求

用選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。建立細(xì)胞系（株）的要求8

一般在原代或2－3代后即大量?jī)龃?，作為原種（stockcells），取一支細(xì)胞進(jìn)行傳代繁殖，用畢再凍存，這樣可保證長(zhǎng)期使用和延緩衰老。

當(dāng)連續(xù)傳10代左右時(shí)，可按建系、建株要求進(jìn)行檢測(cè)或鑒定。

一般在原代或2－3代后即大量?jī)龃妫鳛樵N（stockc9國(guó)際上知名的細(xì)胞庫(kù)

ATCC（AmericanTypeCultureCollectionIMR（InstituteforMedicalResearch）

TheHumanGeneticMutantCellRepository，InstituteforMedicalResearchCopewoodandDavisStreets，Camden，NJ08103USAJCRB細(xì)胞庫(kù)（JapaneseCancerResearchResourcesBank－CellBank）ECACC（EuropeanCollectionofAnimalCellCultures）國(guó)際上知名的細(xì)胞庫(kù)

ATCC（AmericanTypeC10ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

組織來源和已傳代數(shù)：應(yīng)說明細(xì)胞供體所屬物種，來自人或動(dòng)物，個(gè)體性別、年齡、取材的器官和組織。腫瘤組織應(yīng)說明臨床和病理診斷及病歷號(hào)等。細(xì)胞培養(yǎng)傳代情況。培養(yǎng)條件及方法：說明使用培養(yǎng)基、血清種類及用量、抗生素、適宜pH等。細(xì)胞活力、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、分裂指數(shù)、倍增時(shí)間等。凍存液ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

組織來源和已傳代數(shù)：應(yīng)說明細(xì)胞供體所11ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性。接種存活率細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞形態(tài)、特異結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核型物種檢測(cè)

檢測(cè)同工酶譜，主要為G6PD和LDH，以證明細(xì)胞有否交叉污染。ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性。12ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

無菌檢測(cè)

包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等反轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)細(xì)胞建立者檢測(cè)者鑒定組織ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

無菌檢測(cè)

包括細(xì)菌、真菌、支原體、病13培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境、條件無菌環(huán)境、溫度、氣體環(huán)境和氫離子濃度基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)細(xì)胞量和培養(yǎng)器皿的清潔度培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境、條件無菌環(huán)境、14

組織培養(yǎng)設(shè)施和基本條件

實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

應(yīng)保證無微生物污染和不受其他有害因素的影響.具體工作包括無菌操作、無菌處理、洗刷、制備細(xì)胞、孵育、傳代、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇等。準(zhǔn)備工作

組織培養(yǎng)設(shè)施和基本條件

實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)準(zhǔn)備工作15功能區(qū)無菌室凈化工作臺(tái)無菌箱功能區(qū)16設(shè)備器材

大型工具類無菌室、實(shí)驗(yàn)室、超凈工作臺(tái)等；CO2培養(yǎng)箱、恒溫箱、培養(yǎng)盤等；顯微鏡：倒置、普通、照相系統(tǒng)；普通離心機(jī)、冷凍離心機(jī)冰箱：普通、（超）低溫、液氮罐；藥品柜、器具柜、實(shí)驗(yàn)臺(tái)等。設(shè)備器材

大型工具類17

配液用具

蒸餾水制作系統(tǒng)天平稱量系統(tǒng)pH儀、pH試紙（廣泛、精密）量筒、漏斗、容量瓶等。

配液用具

蒸餾水制作系統(tǒng)18消毒滅菌類

高壓蒸氣滅菌器;干熱滅菌器;濾過器（蔡氏濾器EKS，玻璃濾器）、濾過瓶和抽濾泵、微量超濾膜濾器等;紫外燈，離子發(fā)生器;

消毒滅菌類

高壓蒸氣滅菌器;19制備細(xì)胞用具

解剖用具、尼龍或不銹鋼網(wǎng)、血球計(jì)數(shù)器等。培養(yǎng)器皿、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板等。，刻度吸管、滴管、試管等。溶液瓶（不同規(guī)格）恒溫磁力攪拌器、恒溫震蕩水浴箱、渦流混懸器等。細(xì)胞凍存管、真空低溫干燥器等。制備細(xì)胞用具

解剖用具、尼龍或不銹鋼網(wǎng)、血球計(jì)數(shù)器等。20實(shí)驗(yàn)器材的處理一器具洗刷玻璃器皿的清洗要求：干凈透明、無油跡、無殘留有害物資或化學(xué)品。步驟：浸泡→刷洗→浸酸→沖洗浸泡：自來水浸泡過夜，水洗；再用2-5%鹽酸浸泡過夜或煮沸30分，水洗；刷洗：用軟毛刷、優(yōu)質(zhì)洗滌劑刷洗雜質(zhì)，沖洗晾干；浸酸：4小時(shí)以上。（重鉻酸鉀+濃硫酸）沖洗：自來水10次以上→蒸餾水3次以上。實(shí)驗(yàn)器材的處理21

塑料器皿的清洗

自來水充分浸泡、沖洗→2％NaOH浸泡過夜→自來水沖洗→2％－5％鹽酸浸泡30min→自來水沖洗→蒸餾水漂洗3次→晾干→紫外線照射30min(或先用75％酒精浸泡、擦拭，再用紫外線照射30min）。凡能耐熱的塑料器皿，最好經(jīng)121.3℃高壓滅菌。

塑料器皿的清洗

自來水充分浸泡、沖洗→2％NaOH浸泡過22

膠塞等橡膠類器材的處理新購(gòu)置者先經(jīng)自來水沖洗→2％NaOH煮沸15min→自來水沖洗2％－5％HCl煮沸15min→自來水沖洗5次以上→蒸餾水沖洗5次以上→蒸餾水煮沸10min，倒掉沸水讓余熱烘干瓶塞等?；蛘麴s水沖洗晾干，整齊擺放于小型金屬盒內(nèi)經(jīng)121.3℃高壓滅菌。

膠塞等橡膠類器材的處理新購(gòu)置者先經(jīng)自來水沖洗→2％Na23金屬器械的清洗新購(gòu)進(jìn)的金屬器械常涂有防銹油，先用沾有汽油的紗布擦去油脂，再用水洗凈，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用過的金屬器械應(yīng)先以清水煮沸消毒，再擦拭干凈。使用前以蒸餾水煮沸10min，或包裝好以121．3℃高壓15min。金屬器械的清洗24除菌濾器的處理蔡（Seit）氏濾器：玻璃濾器：注射器薄膜濾器除菌濾器的處理25清潔液配制的使用注意事項(xiàng)選用耐酸塑料桶或不銹鋼桶配制為宜。

先將重鉻酸鉀溶于水中（用玻棒攪拌助溶，有時(shí)不能完全溶解）。緩緩加入濃硫酸，切忌過急，否則將產(chǎn)熱而發(fā)生危險(xiǎn)（絕不可將重鉻酸鉀液倒入濃硫酸中）。

清潔液配制的使用注意事項(xiàng)26

清潔液配好呈棕紅色，待變綠色時(shí)表明失效。由于清潔液的腐蝕性極強(qiáng)，配制與應(yīng)用時(shí)必須小心，并做好防護(hù)。

清潔液配好呈棕紅色，待變綠色時(shí)表明失效。由于清潔液27包裝小瓶皿、膠塞、刀剪等器械可裝入飯盒，再以牛皮紙包好，繩扎好。吸管、滴管口用脫脂棉塞上（不要太緊或太松）裝入消毒筒內(nèi)，濾器、濾瓶、橡皮管等都要用牛皮紙包好瓶口等，外罩一層牛皮紙包好，再用包布包好。無菌衣、帽、口罩均以牛皮紙或包布包好，繩扎好。瓶類：硫酸紙罩以瓶口，外罩二層牛皮紙用繩扎緊。包裝28消毒滅菌

嚴(yán)格的消毒滅菌對(duì)保證細(xì)胞培養(yǎng)的成功是極為重要的，其方法分為物理法和化學(xué)法兩類。物理法：干熱、濕熱、濾過、紫外線及射線等?；瘜W(xué)法：指使用化學(xué)消毒劑等。消毒滅菌

嚴(yán)格的消毒滅菌對(duì)保證細(xì)胞培養(yǎng)的成功是極為重要的，其29干烤:170℃高壓蒸氣滅菌：用于玻璃器皿、濾器橡膠塞、解剖用具、耐熱塑料器具、受熱不變性的溶液等，不同物品其有效滅菌壓力和時(shí)間不同，如培養(yǎng)用液、橡膠制品、塑料器皿等用115℃高壓滅菌10min；布類、玻璃制品、金屬器械等用121.3℃）高壓滅菌15－20min。干烤:170℃30濾過除菌：適于含有不耐熱成分的培養(yǎng)基和試劑的除菌，用孔徑為20－45nm大小的濾板可除去細(xì)菌和霉菌等；濾器分為抽濾（負(fù)壓）和加壓式，前者濾器連接抽濾瓶，用真空抽氣泵抽氣使液體濾過；后者為密閉容器，加入需濾過液體后，給以氮?dú)庠斐扇萜鲀?nèi)壓力，使溶液濾過，氮?dú)鈮毫Σ荒艹^20kPa。

濾過除菌：適于含有不耐熱成分的培養(yǎng)基和試劑的除菌，用孔徑為231紫外線：用于消毒實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣及操作臺(tái)表面，也可用于對(duì)不耐熱的塑料微孔反應(yīng)板的處理。照射物距燈約0.5－lm，直射30－120min。

一般進(jìn)無菌室前或做完試驗(yàn)后，照射30min進(jìn)行消毒。射線：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件32熏蒸消毒：實(shí)驗(yàn)室、無菌室的消毒可用甲醛熏蒸，遇有無菌室出現(xiàn)污染致細(xì)胞多次污染時(shí)，或?qū)嶒?yàn)室兩個(gè)月一次的常規(guī)消毒，均可用高錳酸鉀5－7.5g，加甲醛（40%）10－15ml，混合放入一開放容器內(nèi)，立即可見白色甲醛煙霧，消毒房間需封閉24h，至少要封閉4h以上。熏蒸消毒：33化學(xué)消毒劑：常用碘酒、酒精擦手及擦拭培養(yǎng)瓶蓋和外壁等；來蘇、新潔爾滅、過氧乙酸等用于實(shí)驗(yàn)室、無菌室的桌面、物體表面的消毒，或放消毒缸內(nèi)使用?；瘜W(xué)消毒劑：34培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長(zhǎng)及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過程中所需的基本溶液。主要包括平衡鹽溶液、常用試劑及培養(yǎng)基三大類，培養(yǎng)基又分為天然培養(yǎng)基與合成培養(yǎng)基.

培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長(zhǎng)及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)35平衡鹽溶液（balancedsaltsolution，BSS）具有維持滲透壓，調(diào)控酸、堿平衡的作用，并可供細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分，另外尚可用作洗滌組織、細(xì)胞以及配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液。常用試劑是制備細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞及檢查細(xì)胞所必需的。平衡鹽溶液（balancedsaltsolution，36水水不僅是細(xì)胞的主要成分，也是細(xì)胞賴以生存的主要環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物都必須溶解在水中，才能被細(xì)胞吸收和排泄。體外培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)水的質(zhì)量非常敏感，要求很高。水的純度不夠,即使有害元素含量極少對(duì)細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生不利的影響，有時(shí)引起細(xì)胞中毒死亡。水水不僅是細(xì)胞的主要成分，也是細(xì)胞賴以生存的主要環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)物37因此配制所有的培養(yǎng)液和各種溶液應(yīng)使用純化水。組織培養(yǎng)必須使用玻璃蒸餾器制備的三次蒸餾水。二次蒸餾水或一次蒸餾水可用以清洗器皿或配制一般洗液。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件38離子交換水裝置

此裝置用離子交換樹脂可有效地去除離子，所制得的水稱為去離子水。制取去離子水不用燃料、成本低、水質(zhì)好、操作簡(jiǎn)便，但不能去除非離子物質(zhì)或有機(jī)物質(zhì)，因此組織培養(yǎng)中很少使用，僅用于沖洗玻璃器皿等。離子交換水裝置

此裝置用離子交換樹脂可有效地去除離子，所制得39蒸餾水裝置

玻璃蒸餾器制取的蒸餾水符合組織培養(yǎng)的要求，因用金屬蒸餾器不能完全排除金屬離子，故不符合要求。有時(shí)為制取大量高質(zhì)純化水，可用去離子水經(jīng)玻璃蒸餾器重蒸,組織培養(yǎng)用液需用三蒸水配制。蒸餾水裝置

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蒸餾水一般是現(xiàn)用現(xiàn)制，存放時(shí)間不宜太長(zhǎng)，最好不要超過兩周。因空氣中的雜質(zhì)和有毒氣體能污染水質(zhì)，CO2也會(huì)溶解于水，故存放時(shí)要將蒸餾水裝滿貯存容器，密封瓶口防止空氣混入。蒸餾水一般是現(xiàn)用現(xiàn)制，存放時(shí)間不宜太長(zhǎng)，最好不要超過兩41

細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑主要包括分離組織和分散細(xì)胞用的細(xì)胞分離液（消化液）、調(diào)整培養(yǎng)液酸堿度的pH調(diào)整液、防止培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的抗生素溶液、指示酸堿度（pH）的酚紅溶液、檢查細(xì)胞和觀察研究細(xì)胞用的各種染液等。

細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑42胰蛋白酶

主要來自?；蜇i的胰臟，淡黃色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷暗干燥處保存。主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。其活性是用水解酪蛋白的能力表示，常使用1：125和1：250，即1份胰酶分別能解離125份和250份酪蛋白,胰酶的離散作用與細(xì)胞的種類和特性密切相關(guān)。不同細(xì)胞系對(duì)胰酶溶液的作用濃度、溫度和時(shí)間等的要求也不一樣。胰蛋白酶

主要來自?；蜇i的胰臟，淡黃色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷43濃度大、溫度高、作用時(shí)間長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞的分離能力也越大，但超過一定限度也會(huì)損傷細(xì)胞、胰酶在pH8．0，溫度37℃時(shí)，作用力最強(qiáng)。Ca++、Mg++血清、蛋白質(zhì)的存在會(huì)降低其活力，可用無Ca++、M++的溶液配制，需要終止消化作用時(shí)，可加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液或胰酶抑制劑來終止胰酶對(duì)細(xì)胞的繼續(xù)作用。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件44

NaHCO3溶液:常用的濃度有7.4％、5.6％、3.7％。配制時(shí)用三蒸水溶解后，濾過除菌，分裝小瓶，蓋緊瓶塞，于4℃或室溫保存。有的實(shí)驗(yàn)室用高壓滅菌，雖有部分NaHCO3被破壞，但操作簡(jiǎn)單方便。調(diào)節(jié)pH時(shí)，NaHCO3要逐滴加入，并不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)液，以防止加入過量。當(dāng)pH值過高后，可用滅菌的10％醋酸溶液或通入CO2氣體調(diào)節(jié)。pH調(diào)整液

NaHCO3溶液:常用的濃度有7.4％、5.6％、3.45

為了較長(zhǎng)時(shí)間恒定pH，可使用緩沖能力較強(qiáng)HEPES（N－2－oxyethylpiperazineN’-2-ethanesulfonicacid，N-2-羥乙基派嗪-N’-2-乙磺酸），使用的終濃度為10－50mmol/L，可以根據(jù)緩沖能力的要求而定。HEPES

HEPES46

抗生素液

在離散細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞過程中，試液中加入適量抗生素，可預(yù)防操作不慎而產(chǎn)生的污染。常用的有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、二性霉素等。常配成100x或200x于使用濃度的鹽溶液內(nèi)，分裝小瓶，冷凍保存。使用前加入到培養(yǎng)液內(nèi)，每小瓶最好一次用完。

抗生素液

在離散細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞過程中，試液中加入適量抗生素47

L-Glutamin溶液

制備：L－Glutamin6g（分子量146．15）三蒸水200ml（1）濾過除菌；（2）分裝；（3）一20℃保存；（4）使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液加lml。

L-Glutamin溶液

制備：48

培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)液

培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基常用培養(yǎng)液49天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基（naturalmedia）包括：血清、組織提取液等。血清是細(xì)胞培養(yǎng)中最常使用的天然培養(yǎng)基。血清中含有許多能維持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖不可缺少的成分，如蛋白質(zhì)、多肽、激素及各種氨基酸、葡萄糖、酮酸等營(yíng)養(yǎng)成分。天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基（naturalmedia）包括：血50種類：分人血清和動(dòng)物血清兩大類。細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的是動(dòng)物血清，來自牛、馬、兔等動(dòng)物，其中牛血清比馬血清用得更廣泛。牛血清分為胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS）和小牛血清（calfserum，CS）兩種。種類：51FBS是經(jīng)剖腹從母牛子宮中取出的胎牛中分離到的血清，價(jià)格貴；CS是從剛出生但尚未哺乳的小牛中分離到的血清。目前市售的牛血清質(zhì)量不一，購(gòu)買之前應(yīng)通過細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行選擇試驗(yàn)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖與否。也可以用克隆形成率和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線作為指標(biāo)加以鑒定，而且要選擇經(jīng)過支原體試驗(yàn)合格的牛血清。FBS是經(jīng)剖腹從母牛子宮中取出的胎牛中分離到的血清，價(jià)格貴；52合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基（Syntheticmedia）是根據(jù)研究和了解細(xì)胞所需成分的基礎(chǔ)上配制而成的，現(xiàn)已成為普遍應(yīng)用的商品化的培養(yǎng)基。但合成培養(yǎng)基尚未成為十分完全的培養(yǎng)基，它只能維持細(xì)胞不死，而不能促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，使用時(shí)尚需添加天然培養(yǎng)基，主要是牛血清。目前常用的合成培養(yǎng)基主要是MEM、Eagle、RPMl-l640、199培養(yǎng)液等。合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基（Syntheticmedia）是53MEM培養(yǎng)液

常用的是MEM（MinimumEagleMedium，低限量培養(yǎng)基），僅含12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素，成分簡(jiǎn)單，適合各種已建成細(xì)胞系的培養(yǎng)，同時(shí)宜于添加或減少某些成分，也特別適于特殊研究的細(xì)胞培養(yǎng)工作。在它的基礎(chǔ)上改良的DMEM（Dulbecco’sModifiedEagleMedium，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基）應(yīng)用也十分廣泛。MEM培養(yǎng)液

常用的是MEM（MinimumEagle54RPMl-l640RPMl-l640是一種常用的培養(yǎng)液，最初是針對(duì)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，問世后發(fā)現(xiàn)能廣泛適應(yīng)許多種類的細(xì)胞，包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，而且成分簡(jiǎn)單，和MEM一樣應(yīng)用十分廣泛。配制方法RPMl-l64055

生長(zhǎng)液與維持液

血清含有多種促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、貼附的活性物質(zhì)。合成培養(yǎng)基中不加血清或低濃度（如2％）血清，僅能維持細(xì)胞生存，細(xì)胞不能很好生長(zhǎng)，這種培養(yǎng)基稱為維持液。加入5％的血清，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來說，能維持不死和緩慢生長(zhǎng)。一般需加入10％－20％血清，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，稱為生長(zhǎng)液。添加血清，雖利于細(xì)胞生長(zhǎng)，但不明成分也增多了，對(duì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加了困難。

生長(zhǎng)液與維持液

血清含有多種促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、貼附的活性物質(zhì)。56［附］RPMI—1640生長(zhǎng)液和維持液配法；

生長(zhǎng)液：RPMI-164087％小牛血清10％谷氨酸胺（100X）1％雙抗（100X）1％用5.6％NaHCO3調(diào)pH至7.0-7.2。維持液：RPMI-164095％小牛血清2％谷氨酸胺（100X）1％雙抗（100x）1％用5．6％NaHCO3調(diào)pH至7.0-7.2。

［附］RPMI—1640生長(zhǎng)液和維持液配法；

生長(zhǎng)液：57

無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基主要由基礎(chǔ)培養(yǎng)液和附加成分兩部分組成，前者大多數(shù)仍采用合成培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)溶液，常用的是F12和DMEM培基，二者按1:1混合補(bǔ)加15mmol/LHEPES等；后者是根據(jù)不同細(xì)胞的要求，附加特異性生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞附著蛋白、金屬離子轉(zhuǎn)移蛋白、細(xì)胞結(jié)合蛋白、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制劑和微量元素等。

無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基主要由基礎(chǔ)培養(yǎng)液和附加成分兩部分58

激素類：胰島素三碘甲狀腺原氨酸生長(zhǎng)激素（G）氫化可的松維生素A酸生長(zhǎng)因子：上皮生長(zhǎng)因子（EGF）成纖維生長(zhǎng)因子（FGF）神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）激素類：胰島素59

金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin）微量元素：硒酸鈉（Na2SeO3）酶抑制劑：大豆胰酶抑制劑（soybeantrypsininbibitor）抑蛋白酶肽（aprotinin）金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白60基本技術(shù)培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求無菌操作、前準(zhǔn)備、消毒等

基本培養(yǎng)操作技術(shù)

基本技術(shù)培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求61取材

一般說來，各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織均可用于培養(yǎng)。但實(shí)際上，只有幼年組織尤其是胚胎組織以及腫瘤組織和其他分化程度低的組織比較容易培養(yǎng)。從體內(nèi)取材時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，防止污染。對(duì)其他暴露于外界的組織，應(yīng)將所取的組織放入含二性霉素（2μg／ml），青霉素（500u／ml），鏈霉素（500μg／ml）的培養(yǎng)液中浸泡10－20min。取材之后，應(yīng)立即培養(yǎng)，否則應(yīng)把組織切成1mm3左右的小塊，放入培養(yǎng)液內(nèi)，置4℃貯存，存放時(shí)間不宜超過24小時(shí)。取材

一般說來，各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織均可用于培養(yǎng)。但62

細(xì)胞分散

機(jī)械分散法對(duì)某些軟組織如腦、胚胎以及某些腫瘤等，可采用機(jī)械法進(jìn)行分散。較為常用的方法是用組織勻漿器研碎組織，然后通過不銹鋼紗網(wǎng)獲得單細(xì)胞懸液。此法簡(jiǎn)便省時(shí)，但對(duì)組織有一定損失。

細(xì)胞分散

機(jī)械分散法63

酶消化法

胰蛋白酶消化法胰蛋白酶適用于消化間質(zhì)較少的軟組織，對(duì)傳代細(xì)胞的消化也比較好。使用胰蛋白酶的消化程序如下：將組織剪成lmm3的大小，置于三角燒瓶中，加入比細(xì)胞多30－50倍的0．25％胰蛋白酶液。置電磁攪拌器上攪拌（30－100r／min），消化30－60min；或放入37℃水浴中消化，但中間要不時(shí)搖動(dòng)；

酶消化法

胰蛋白酶消化法胰蛋白酶適用于消化間質(zhì)較少的軟組織64消化完畢后，吸取2／3上清液于離心管中，1000rpm5min，然后用Hanks液離心漂洗兩次；加入一定量的營(yíng)養(yǎng)液，通過200目的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)濾過，即可用于培養(yǎng)。上述方法亦稱為熱消化，有時(shí)可將組織加入胰蛋白酶后，置于4℃，進(jìn)行緩慢消化，消化時(shí)間可延長(zhǎng)12－24h，此法稱冷消化法。消化完畢后，吸取2／3上清液于離心管中，1000rpm565膠原酶消化法此法對(duì)膠原有較強(qiáng)的消化作用，適用消化纖維組織，上皮組織及瘤組織等。膠原酶常用劑量終濃度200u／ml或0.l－0.3μg／ml。此法消化作用緩和消化過程與胰蛋白消化法基本相同?？陕?lián)合應(yīng)用胰蛋白酶和膠原酶消化某些硬組織，其消化效果更佳。膠原酶消化法此法對(duì)膠原有較強(qiáng)的消化作用，適用消化纖維組織，上66

實(shí)驗(yàn)中常用EDTA作為化學(xué)螯合劑，其溶液又稱Versen液。使用濃度一般為0.02％。螯合劑分散法常用于消化傳代細(xì)胞，此法作用溫和，毒性較小。

螯合劑分散法

實(shí)驗(yàn)中常用EDTA作為化學(xué)螯合劑，其溶液又稱Versen67細(xì)胞的分裝、培養(yǎng)及傳代

根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)，用生長(zhǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋成（3-5）x105個(gè)／ml，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)分裝一定量。一般接種細(xì)胞數(shù)應(yīng)視細(xì)胞種類不同而定，如類上皮細(xì)胞應(yīng)為（1－3）x105／ml，成纖維細(xì)胞應(yīng)加倍（2-6）x105／ml。若為胚胎組織細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量可低些，而成體組織細(xì)胞數(shù)量則應(yīng)高些；細(xì)胞活力好的接種數(shù)可少些，年老組織接種的量就應(yīng)多些。細(xì)胞的分裝、培養(yǎng)及傳代68已鋪滿瓶底面的單層細(xì)胞，如繼續(xù)培養(yǎng)則易老化，甚至脫落。感染病毒等影響特異性CPE的判斷，因此成片細(xì)胞不能當(dāng)天使用，應(yīng)換成維持液（含2％以下血清的培養(yǎng)基），以后每隔5－7天換維持液一次，一般可維持1－3周。已鋪滿瓶底面的單層細(xì)胞，如繼續(xù)培養(yǎng)則易老化，甚至脫落。69單層的原代細(xì)胞可進(jìn)行傳代培養(yǎng)用細(xì)胞分散劑（胰酶、EDTA或胰酶+EDTA等）處理，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿底脫離，加生長(zhǎng)液充分吹打，制成單個(gè)細(xì)胞懸液分裝。加入生長(zhǎng)液的量可按原量的2倍，即一瓶傳成二瓶，置37℃培養(yǎng)3－5天可形成單層，成片后換維持液即可進(jìn)行試驗(yàn)。單層的原代細(xì)胞可進(jìn)行傳代培養(yǎng)用細(xì)胞分散劑（胰酶、EDTA或70

細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件71細(xì)胞的凍存培養(yǎng)細(xì)胞維持傳代以供實(shí)驗(yàn)用常遇到某些困難。細(xì)胞株在傳代中性質(zhì)易發(fā)生改變;在傳代中有支原體污染的危險(xiǎn);對(duì)有限增殖細(xì)胞株，傳代應(yīng)維持在限內(nèi)期間傳代，解決這些困難的辦法就是將細(xì)胞凍存。細(xì)胞凍存在液氮中，貯存時(shí)間幾乎是無限的。細(xì)胞的凍存培養(yǎng)細(xì)胞維持傳代以供實(shí)驗(yàn)用常遇到某些困難。細(xì)胞株在72凍存細(xì)胞的原理與要求原理：在不加保護(hù)條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列變化，如機(jī)械損傷、電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白質(zhì)變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使冰點(diǎn)降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。貯存在-130℃以下低溫中能減少冰晶的形成。凍存細(xì)胞的原理與要求原理：在不加保護(hù)條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)73融解細(xì)胞時(shí)，速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的-5℃－0℃后，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力不受任何損害。當(dāng)前使用的保護(hù)劑為DMSO和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，使用濃度范圍在5％－15％之間，常用10％。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件74

要求：為保持細(xì)胞最大存活率，一般采用慢凍快融的方法。標(biāo)準(zhǔn)的冷凍速度為l-2℃／min，當(dāng)溫度達(dá)-25℃時(shí)，下降率可增至5—10℃／min,到一100℃時(shí)則可迅速浸入液氮中。要適當(dāng)掌握下降速度，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。但各種細(xì)胞對(duì)凍結(jié)速度要求不一樣，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的耐受性能大些，骨髓干細(xì)胞1-3℃／min合適，胚胎細(xì)胞耐性較小。要求：為保持細(xì)胞最大存活率，一般采用慢凍快融的方法。標(biāo)準(zhǔn)的75

開始時(shí)下降速度不能超10℃／min。另外用什么保護(hù)劑合適和用量多大，要依細(xì)胞而定，初代培養(yǎng)用DMSO較好，一般細(xì)胞可用甘油。用量以較小為好，有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在20％－30％甘油中很好。原則上細(xì)胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見，凍存一年后，應(yīng)再?gòu)?fù)蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件76

選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在收集細(xì)胞24小時(shí)前換液一次。常規(guī)方法消化細(xì)胞，按l－5xl06／ml細(xì)胞濃度，懸浮于含10％二甲基亞砜（DMSO）的小牛血清或生長(zhǎng)液中。凍存的細(xì)胞數(shù)量要充分，因復(fù)蘇時(shí)接種的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)比平常多一些。用吸管吸取細(xì)胞懸液，分裝于無菌凍存管（每?jī)龃婀躭ml），嚴(yán)密封口，放入三層紗布小袋（內(nèi)放鉛塊以防止漂?。┲校⑾狄跃€繩，末端扎有小牌，注明細(xì)胞名稱和凍存日期，便于以后查找。凍存細(xì)胞的方法

凍存細(xì)胞的方法77凍存當(dāng)前已有專用細(xì)胞凍存器，能精確地控制冷凍速度。在無凍存器的情況下，可用手工方法。從把凍存管懸在液氮容器口開始，在30－40min時(shí)間內(nèi)，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中?；蛳葘龃婀芤迫胍旱蘅陬i部氣相中過夜，次日將紗布袋緩慢下降至液氮中，歷時(shí)3min。在液氮中可長(zhǎng)期保存。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件78【附】?jī)龃姹Ｗo(hù)液（10ml）

生長(zhǎng)液6.8ml小牛血清2.0ml二甲基亞砜1.0ml雙抗0.lml5．6％NaHCO30.lml

【附】?jī)龃姹Ｗo(hù)液（10ml）

生長(zhǎng)液79細(xì)胞的復(fù)蘇將凍存于液氮中的凍存管取出（取出時(shí)應(yīng)戴好手套和防護(hù)眼鏡），迅速放入37-40℃水浴中使其在lmin內(nèi)融化?；蛉〕黾?xì)胞懸液至離心管中，補(bǔ)加10ml培養(yǎng)液，500－1000rpm5min，去上清，用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后裝入培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)，次日后更換一次培養(yǎng)液。細(xì)胞的復(fù)蘇80無菌操作下打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸取到培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足生長(zhǎng)液后，置37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁（約4h）后，換生長(zhǎng)液一次。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后即可傳代。無菌操作下打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸取到培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足生長(zhǎng)液后81細(xì)胞的運(yùn)輸當(dāng)前培養(yǎng)細(xì)胞既在國(guó)內(nèi)進(jìn)行寄贈(zèng)、交換和購(gòu)買，也在國(guó)際交流，為此要有裝運(yùn)細(xì)胞的方法。裝運(yùn)方法有兩種，一種是用液氮或干冰貯存運(yùn)輸，需要用特殊容器，保存效果較好，但較麻煩，且液氮和干冰蒸發(fā)都較快，不適于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行，需要空運(yùn)。另一種充液法，比較簡(jiǎn)便易行。細(xì)胞的運(yùn)輸當(dāng)前培養(yǎng)細(xì)胞既在國(guó)內(nèi)進(jìn)行寄贈(zèng)、交換和購(gòu)買，82

選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，待接近或剛剛連接成片后，去掉培養(yǎng)液，充滿新培養(yǎng)液，液量要達(dá)到培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞以膠塞，保留微量空氣?？諝饬袅窟^多，運(yùn)輸時(shí)大氣泡來回流動(dòng)對(duì)細(xì)胞有干擾作用。選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，待接近或剛剛連接成片后，去掉培83妥善包裝、運(yùn)輸。一般在四五天內(nèi)到達(dá)目的地，對(duì)細(xì)胞活力無多大影響，時(shí)間過長(zhǎng)，則細(xì)胞活力下降。

到達(dá)目的地后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需的液量，置37℃培養(yǎng)，次日傳代。妥善包裝、運(yùn)輸。一般在四五天內(nèi)到達(dá)目的地，對(duì)細(xì)胞活力無多大影84組織培養(yǎng)污染的檢測(cè)與排除

組織培養(yǎng)細(xì)胞被有害物污染是組織培養(yǎng)工作的大敵。應(yīng)用組織培養(yǎng)進(jìn)行研究工作，除需完善的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和技術(shù)方法外，成敗的關(guān)鍵還在于能否避免污染。組織培養(yǎng)污染的檢測(cè)與排除組織培養(yǎng)細(xì)胞被有害物污染是組織85細(xì)菌與霉菌的污染

常見污染的細(xì)菌有大腸埃希菌、枯草桿菌、假單胞菌、葡萄球菌等;常可發(fā)生真菌污染，尤其炎熱、潮濕的季節(jié)十分常見，如煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌等。霉菌和細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，能在短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，或產(chǎn)生有毒物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鏡下可見大量顆粒，細(xì)胞變圓或崩潰從瓶壁脫落。霉菌污染容易發(fā)現(xiàn)，大多形成肉眼可見的白色或淺黃色菌團(tuán)漂浮于培養(yǎng)液表面，鏡下可見絲狀菌絲，縱橫交錯(cuò)于細(xì)胞之間。細(xì)菌與霉菌的污染

常見污染的細(xì)菌有大腸埃希菌、枯草桿菌、假86

細(xì)菌污染如較嚴(yán)重培養(yǎng)基上清混濁，較輕時(shí)鏡下可見小的菌體在細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)，同時(shí)可涂片染色鏡檢或進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，加以確定。抗生素及抗霉菌制劑對(duì)預(yù)防或排除細(xì)菌、霉菌污染有效。工作中要特別注意和防止所用培養(yǎng)液和血清的污染，用前應(yīng)仔細(xì)檢查有無混濁和菌絲存在，以防止在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)造成污染。細(xì)菌污染如較嚴(yán)重培養(yǎng)基上清混濁，較輕時(shí)鏡下可見小的菌體在87支原體污染和檢測(cè)

支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的，又是干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種污染。但由于不易被察覺，這些污染的細(xì)胞仍在繼續(xù)使用。據(jù)查目前各實(shí)驗(yàn)室使用的二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞中約有11％的細(xì)胞受到支原體污染。因此，對(duì)支原體的污染必須嚴(yán)加防范，并應(yīng)熟悉支原體基本特性。支原體污染和檢測(cè)88

支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間，并能獨(dú)立生活的最小微生物，它無細(xì)胞壁，形態(tài)呈多形性，最小的直徑0.2um，可通過濾菌器。常在購(gòu)進(jìn)的各種血清中就有支原體存在。細(xì)胞污染后，因支原體無細(xì)胞致死毒性并可與細(xì)胞長(zhǎng)期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生混濁，細(xì)胞無明顯變化，外觀上往往給人以“正?！钡母杏X，實(shí)則細(xì)胞能受到多方面的潛在影響，如引起細(xì)胞變形，影響DNA的合成，以致抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間，并能獨(dú)立生活的最小微89支原體檢測(cè)的方法培養(yǎng)法熒光法電子顯微鏡法聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法支原體檢測(cè)的方法培養(yǎng)法90微生物污染的排除

培養(yǎng)的細(xì)胞一旦被微生物污染，應(yīng)及時(shí)處理，防止造成本實(shí)驗(yàn)室中其他細(xì)胞的污染。一般細(xì)胞被污染最好高壓滅菌后棄掉。如果是有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染的程度比較輕，可及時(shí)排除污染物，細(xì)胞可能恢復(fù)正常。

微生物污染的排除91抗生素排除法

用抗生素是殺滅微生物的主要手段。各種抗生素性質(zhì)不同，對(duì)各種微生物的作用也不同，聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防應(yīng)用比污染后使用好；當(dāng)已發(fā)生微生物污染后再使用抗生素，常難以根除。有的抗生素對(duì)細(xì)菌僅有抑制作用，而無殺菌效應(yīng)。反復(fù)使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)細(xì)胞本身也有一定影響，有人主張盡量不用抗生素處理，當(dāng)然在一些有價(jià)值的細(xì)胞被污染仍需用抗生素挽救，在這種情況下，可采用5－10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24－48小時(shí)，再換入常規(guī)培養(yǎng)液中，有時(shí)可能奏效?？股嘏懦?/p>

92加溫除菌根據(jù)支原體對(duì)熱耐受性差的特點(diǎn)?？蓪⑹苤гw污染的細(xì)胞置于41℃中作用5－10h，最長(zhǎng)可達(dá)18h，以殺滅支原體。但41℃對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞本身也有較大影響，放在處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定出最大限度殺傷支原體而對(duì)細(xì)胞影響較小的最佳處理時(shí)間。加溫除菌根據(jù)支原體對(duì)熱耐受性差的特點(diǎn)?？蓪⑹苤гw污染的細(xì)胞93動(dòng)物體內(nèi)接種

受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可接種在同種動(dòng)物皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅污染的微生物，腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)，待一定時(shí)間后，從體內(nèi)取出再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。

各種消除污染細(xì)胞的微生物方法都比較麻煩，僅對(duì)重要的有保存價(jià)值的細(xì)胞有用。很易重新培養(yǎng)的細(xì)胞受污染后，最好棄之。動(dòng)物體內(nèi)接種

受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可接種在同種動(dòng)物皮下或腹94

謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝95細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室

鄧惠華細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室96

組織培養(yǎng)的基本概念和發(fā)展簡(jiǎn)史

早期培養(yǎng)組織培養(yǎng)的建立與發(fā)展現(xiàn)代組織培養(yǎng)

組織培養(yǎng)的基本概念和發(fā)展簡(jiǎn)史

早期培養(yǎng)97體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型

貼壁型細(xì)胞上皮細(xì)胞型

成纖維細(xì)胞型

游走細(xì)胞型懸浮型細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型

貼壁型細(xì)胞98培養(yǎng)細(xì)胞的生命期

原代培養(yǎng)期

原代培養(yǎng)與體內(nèi)原組織很相似，具異質(zhì)性，相互依存性強(qiáng)，細(xì)胞克隆形成率低。此期一般持續(xù)1～4周。傳代期

持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，其特點(diǎn)是細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。衰退期

培養(yǎng)細(xì)胞的生命期

原代培養(yǎng)期

原代培養(yǎng)與體內(nèi)原組織很相似99細(xì)胞培養(yǎng)一代的生長(zhǎng)過程

傳代是將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶皿轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)瓶皿內(nèi)生長(zhǎng)培養(yǎng)一代單個(gè)細(xì)胞可倍增3－6倍

游離期指數(shù)增殖期停止期細(xì)胞培養(yǎng)一代的生長(zhǎng)過程

傳代是將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶皿轉(zhuǎn)移到另一100細(xì)胞分裂數(shù)量

作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的一個(gè)重要指標(biāo)，以細(xì)胞分裂指數(shù)（mitoticindex,MI）來表示。MI是指100個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)。一般細(xì)胞的MI為0.2％－0.5％，無限傳代細(xì)胞系或腫瘤細(xì)胞的MI可高達(dá)3％－5％。細(xì)胞分裂數(shù)量

作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的一個(gè)重要指標(biāo)，以細(xì)胞101在傳代期培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意的問題為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在傳代后早期凍存（10代內(nèi)凍存）。少數(shù)細(xì)胞系在此期可能發(fā)生自發(fā)或誘發(fā)轉(zhuǎn)化，獲得不死性而成為無限細(xì)胞系，此時(shí)細(xì)胞核型多變成異倍體。在傳代期培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意的問題102建立細(xì)胞系（株）的要求

用選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。建立細(xì)胞系（株）的要求103

一般在原代或2－3代后即大量?jī)龃?，作為原種（stockcells），取一支細(xì)胞進(jìn)行傳代繁殖，用畢再凍存，這樣可保證長(zhǎng)期使用和延緩衰老。

當(dāng)連續(xù)傳10代左右時(shí)，可按建系、建株要求進(jìn)行檢測(cè)或鑒定。

一般在原代或2－3代后即大量?jī)龃妫鳛樵N（stockc104國(guó)際上知名的細(xì)胞庫(kù)

ATCC（AmericanTypeCultureCollectionIMR（InstituteforMedicalResearch）

TheHumanGeneticMutantCellRepository，InstituteforMedicalResearchCopewoodandDavisStreets，Camden，NJ08103USAJCRB細(xì)胞庫(kù)（JapaneseCancerResearchResourcesBank－CellBank）ECACC（EuropeanCollectionofAnimalCellCultures）國(guó)際上知名的細(xì)胞庫(kù)

ATCC（AmericanTypeC105ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

組織來源和已傳代數(shù)：應(yīng)說明細(xì)胞供體所屬物種，來自人或動(dòng)物，個(gè)體性別、年齡、取材的器官和組織。腫瘤組織應(yīng)說明臨床和病理診斷及病歷號(hào)等。細(xì)胞培養(yǎng)傳代情況。培養(yǎng)條件及方法：說明使用培養(yǎng)基、血清種類及用量、抗生素、適宜pH等。細(xì)胞活力、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、分裂指數(shù)、倍增時(shí)間等。凍存液ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

組織來源和已傳代數(shù)：應(yīng)說明細(xì)胞供體所106ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性。接種存活率細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞形態(tài)、特異結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核型物種檢測(cè)

檢測(cè)同工酶譜，主要為G6PD和LDH，以證明細(xì)胞有否交叉污染。ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性。107ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

無菌檢測(cè)

包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等反轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)細(xì)胞建立者檢測(cè)者鑒定組織ATCC入庫(kù)檢測(cè)項(xiàng)目

無菌檢測(cè)

包括細(xì)菌、真菌、支原體、病108培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境、條件無菌環(huán)境、溫度、氣體環(huán)境和氫離子濃度基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)細(xì)胞量和培養(yǎng)器皿的清潔度培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境、條件無菌環(huán)境、109

組織培養(yǎng)設(shè)施和基本條件

實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

應(yīng)保證無微生物污染和不受其他有害因素的影響.具體工作包括無菌操作、無菌處理、洗刷、制備細(xì)胞、孵育、傳代、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇等。準(zhǔn)備工作

組織培養(yǎng)設(shè)施和基本條件

實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)準(zhǔn)備工作110功能區(qū)無菌室凈化工作臺(tái)無菌箱功能區(qū)111設(shè)備器材

大型工具類無菌室、實(shí)驗(yàn)室、超凈工作臺(tái)等；CO2培養(yǎng)箱、恒溫箱、培養(yǎng)盤等；顯微鏡：倒置、普通、照相系統(tǒng)；普通離心機(jī)、冷凍離心機(jī)冰箱：普通、（超）低溫、液氮罐；藥品柜、器具柜、實(shí)驗(yàn)臺(tái)等。設(shè)備器材

大型工具類112

配液用具

蒸餾水制作系統(tǒng)天平稱量系統(tǒng)pH儀、pH試紙（廣泛、精密）量筒、漏斗、容量瓶等。

配液用具

蒸餾水制作系統(tǒng)113消毒滅菌類

高壓蒸氣滅菌器;干熱滅菌器;濾過器（蔡氏濾器EKS，玻璃濾器）、濾過瓶和抽濾泵、微量超濾膜濾器等;紫外燈，離子發(fā)生器;

消毒滅菌類

高壓蒸氣滅菌器;114制備細(xì)胞用具

解剖用具、尼龍或不銹鋼網(wǎng)、血球計(jì)數(shù)器等。培養(yǎng)器皿、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板等。，刻度吸管、滴管、試管等。溶液瓶（不同規(guī)格）恒溫磁力攪拌器、恒溫震蕩水浴箱、渦流混懸器等。細(xì)胞凍存管、真空低溫干燥器等。制備細(xì)胞用具

解剖用具、尼龍或不銹鋼網(wǎng)、血球計(jì)數(shù)器等。115實(shí)驗(yàn)器材的處理一器具洗刷玻璃器皿的清洗要求：干凈透明、無油跡、無殘留有害物資或化學(xué)品。步驟：浸泡→刷洗→浸酸→沖洗浸泡：自來水浸泡過夜，水洗；再用2-5%鹽酸浸泡過夜或煮沸30分，水洗；刷洗：用軟毛刷、優(yōu)質(zhì)洗滌劑刷洗雜質(zhì)，沖洗晾干；浸酸：4小時(shí)以上。（重鉻酸鉀+濃硫酸）沖洗：自來水10次以上→蒸餾水3次以上。實(shí)驗(yàn)器材的處理116

塑料器皿的清洗

自來水充分浸泡、沖洗→2％NaOH浸泡過夜→自來水沖洗→2％－5％鹽酸浸泡30min→自來水沖洗→蒸餾水漂洗3次→晾干→紫外線照射30min(或先用75％酒精浸泡、擦拭，再用紫外線照射30min）。凡能耐熱的塑料器皿，最好經(jīng)121.3℃高壓滅菌。

塑料器皿的清洗

自來水充分浸泡、沖洗→2％NaOH浸泡過117

膠塞等橡膠類器材的處理新購(gòu)置者先經(jīng)自來水沖洗→2％NaOH煮沸15min→自來水沖洗2％－5％HCl煮沸15min→自來水沖洗5次以上→蒸餾水沖洗5次以上→蒸餾水煮沸10min，倒掉沸水讓余熱烘干瓶塞等?；蛘麴s水沖洗晾干，整齊擺放于小型金屬盒內(nèi)經(jīng)121.3℃高壓滅菌。

膠塞等橡膠類器材的處理新購(gòu)置者先經(jīng)自來水沖洗→2％Na118金屬器械的清洗新購(gòu)進(jìn)的金屬器械常涂有防銹油，先用沾有汽油的紗布擦去油脂，再用水洗凈，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用過的金屬器械應(yīng)先以清水煮沸消毒，再擦拭干凈。使用前以蒸餾水煮沸10min，或包裝好以121．3℃高壓15min。金屬器械的清洗119除菌濾器的處理蔡（Seit）氏濾器：玻璃濾器：注射器薄膜濾器除菌濾器的處理120清潔液配制的使用注意事項(xiàng)選用耐酸塑料桶或不銹鋼桶配制為宜。

先將重鉻酸鉀溶于水中（用玻棒攪拌助溶，有時(shí)不能完全溶解）。緩緩加入濃硫酸，切忌過急，否則將產(chǎn)熱而發(fā)生危險(xiǎn)（絕不可將重鉻酸鉀液倒入濃硫酸中）。

清潔液配制的使用注意事項(xiàng)121

清潔液配好呈棕紅色，待變綠色時(shí)表明失效。由于清潔液的腐蝕性極強(qiáng)，配制與應(yīng)用時(shí)必須小心，并做好防護(hù)。

清潔液配好呈棕紅色，待變綠色時(shí)表明失效。由于清潔液122包裝小瓶皿、膠塞、刀剪等器械可裝入飯盒，再以牛皮紙包好，繩扎好。吸管、滴管口用脫脂棉塞上（不要太緊或太松）裝入消毒筒內(nèi)，濾器、濾瓶、橡皮管等都要用牛皮紙包好瓶口等，外罩一層牛皮紙包好，再用包布包好。無菌衣、帽、口罩均以牛皮紙或包布包好，繩扎好。瓶類：硫酸紙罩以瓶口，外罩二層牛皮紙用繩扎緊。包裝123消毒滅菌

嚴(yán)格的消毒滅菌對(duì)保證細(xì)胞培養(yǎng)的成功是極為重要的，其方法分為物理法和化學(xué)法兩類。物理法：干熱、濕熱、濾過、紫外線及射線等?；瘜W(xué)法：指使用化學(xué)消毒劑等。消毒滅菌

嚴(yán)格的消毒滅菌對(duì)保證細(xì)胞培養(yǎng)的成功是極為重要的，其124干烤:170℃高壓蒸氣滅菌：用于玻璃器皿、濾器橡膠塞、解剖用具、耐熱塑料器具、受熱不變性的溶液等，不同物品其有效滅菌壓力和時(shí)間不同，如培養(yǎng)用液、橡膠制品、塑料器皿等用115℃高壓滅菌10min；布類、玻璃制品、金屬器械等用121.3℃）高壓滅菌15－20min。干烤:170℃125濾過除菌：適于含有不耐熱成分的培養(yǎng)基和試劑的除菌，用孔徑為20－45nm大小的濾板可除去細(xì)菌和霉菌等；濾器分為抽濾（負(fù)壓）和加壓式，前者濾器連接抽濾瓶，用真空抽氣泵抽氣使液體濾過；后者為密閉容器，加入需濾過液體后，給以氮?dú)庠斐扇萜鲀?nèi)壓力，使溶液濾過，氮?dú)鈮毫Σ荒艹^20kPa。

濾過除菌：適于含有不耐熱成分的培養(yǎng)基和試劑的除菌，用孔徑為2126紫外線：用于消毒實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣及操作臺(tái)表面，也可用于對(duì)不耐熱的塑料微孔反應(yīng)板的處理。照射物距燈約0.5－lm，直射30－120min。

一般進(jìn)無菌室前或做完試驗(yàn)后，照射30min進(jìn)行消毒。射線：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件127熏蒸消毒：實(shí)驗(yàn)室、無菌室的消毒可用甲醛熏蒸，遇有無菌室出現(xiàn)污染致細(xì)胞多次污染時(shí)，或?qū)嶒?yàn)室兩個(gè)月一次的常規(guī)消毒，均可用高錳酸鉀5－7.5g，加甲醛（40%）10－15ml，混合放入一開放容器內(nèi)，立即可見白色甲醛煙霧，消毒房間需封閉24h，至少要封閉4h以上。熏蒸消毒：128化學(xué)消毒劑：常用碘酒、酒精擦手及擦拭培養(yǎng)瓶蓋和外壁等；來蘇、新潔爾滅、過氧乙酸等用于實(shí)驗(yàn)室、無菌室的桌面、物體表面的消毒，或放消毒缸內(nèi)使用。化學(xué)消毒劑：129培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長(zhǎng)及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過程中所需的基本溶液。主要包括平衡鹽溶液、常用試劑及培養(yǎng)基三大類，培養(yǎng)基又分為天然培養(yǎng)基與合成培養(yǎng)基.

培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長(zhǎng)及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)130平衡鹽溶液（balancedsaltsolution，BSS）具有維持滲透壓，調(diào)控酸、堿平衡的作用，并可供細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分，另外尚可用作洗滌組織、細(xì)胞以及配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液。常用試劑是制備細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞及檢查細(xì)胞所必需的。平衡鹽溶液（balancedsaltsolution，131水水不僅是細(xì)胞的主要成分，也是細(xì)胞賴以生存的主要環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物都必須溶解在水中，才能被細(xì)胞吸收和排泄。體外培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)水的質(zhì)量非常敏感，要求很高。水的純度不夠,即使有害元素含量極少對(duì)細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生不利的影響，有時(shí)引起細(xì)胞中毒死亡。水水不僅是細(xì)胞的主要成分，也是細(xì)胞賴以生存的主要環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)物132因此配制所有的培養(yǎng)液和各種溶液應(yīng)使用純化水。組織培養(yǎng)必須使用玻璃蒸餾器制備的三次蒸餾水。二次蒸餾水或一次蒸餾水可用以清洗器皿或配制一般洗液。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件133離子交換水裝置

此裝置用離子交換樹脂可有效地去除離子，所制得的水稱為去離子水。制取去離子水不用燃料、成本低、水質(zhì)好、操作簡(jiǎn)便，但不能去除非離子物質(zhì)或有機(jī)物質(zhì)，因此組織培養(yǎng)中很少使用，僅用于沖洗玻璃器皿等。離子交換水裝置

此裝置用離子交換樹脂可有效地去除離子，所制得134蒸餾水裝置

玻璃蒸餾器制取的蒸餾水符合組織培養(yǎng)的要求，因用金屬蒸餾器不能完全排除金屬離子，故不符合要求。有時(shí)為制取大量高質(zhì)純化水，可用去離子水經(jīng)玻璃蒸餾器重蒸,組織培養(yǎng)用液需用三蒸水配制。蒸餾水裝置

135

蒸餾水一般是現(xiàn)用現(xiàn)制，存放時(shí)間不宜太長(zhǎng)，最好不要超過兩周。因空氣中的雜質(zhì)和有毒氣體能污染水質(zhì)，CO2也會(huì)溶解于水，故存放時(shí)要將蒸餾水裝滿貯存容器，密封瓶口防止空氣混入。蒸餾水一般是現(xiàn)用現(xiàn)制，存放時(shí)間不宜太長(zhǎng)，最好不要超過兩136

細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑主要包括分離組織和分散細(xì)胞用的細(xì)胞分離液（消化液）、調(diào)整培養(yǎng)液酸堿度的pH調(diào)整液、防止培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的抗生素溶液、指示酸堿度（pH）的酚紅溶液、檢查細(xì)胞和觀察研究細(xì)胞用的各種染液等。

細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑137胰蛋白酶

主要來自?；蜇i的胰臟，淡黃色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷暗干燥處保存。主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。其活性是用水解酪蛋白的能力表示，常使用1：125和1：250，即1份胰酶分別能解離125份和250份酪蛋白,胰酶的離散作用與細(xì)胞的種類和特性密切相關(guān)。不同細(xì)胞系對(duì)胰酶溶液的作用濃度、溫度和時(shí)間等的要求也不一樣。胰蛋白酶

主要來自?；蜇i的胰臟，淡黃色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷138濃度大、溫度高、作用時(shí)間長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞的分離能力也越大，但超過一定限度也會(huì)損傷細(xì)胞、胰酶在pH8．0，溫度37℃時(shí)，作用力最強(qiáng)。Ca++、Mg++血清、蛋白質(zhì)的存在會(huì)降低其活力，可用無Ca++、M++的溶液配制，需要終止消化作用時(shí)，可加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液或胰酶抑制劑來終止胰酶對(duì)細(xì)胞的繼續(xù)作用。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件139

NaHCO3溶液:常用的濃度有7.4％、5.6％、3.7％。配制時(shí)用三蒸水溶解后，濾過除菌，分裝小瓶，蓋緊瓶塞，于4℃或室溫保存。有的實(shí)驗(yàn)室用高壓滅菌，雖有部分NaHCO3被破壞，但操作簡(jiǎn)單方便。調(diào)節(jié)pH時(shí)，NaHCO3要逐滴加入，并不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)液，以防止加入過量。當(dāng)pH值過高后，可用滅菌的10％醋酸溶液或通入CO2氣體調(diào)節(jié)。pH調(diào)整液

NaHCO3溶液:常用的濃度有7.4％、5.6％、3.140

為了較長(zhǎng)時(shí)間恒定pH，可使用緩沖能力較強(qiáng)HEPES（N－2－oxyethylpiperazineN’-2-ethanesulfonicacid，N-2-羥乙基派嗪-N’-2-乙磺酸），使用的終濃度為10－50mmol/L，可以根據(jù)緩沖能力的要求而定。HEPES

HEPES141

抗生素液

在離散細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞過程中，試液中加入適量抗生素，可預(yù)防操作不慎而產(chǎn)生的污染。常用的有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、二性霉素等。常配成100x或200x于使用濃度的鹽溶液內(nèi)，分裝小瓶，冷凍保存。使用前加入到培養(yǎng)液內(nèi)，每小瓶最好一次用完。

抗生素液

在離散細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞過程中，試液中加入適量抗生素142

L-Glutamin溶液

制備：L－Glutamin6g（分子量146．15）三蒸水200ml（1）濾過除菌；（2）分裝；（3）一20℃保存；（4）使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液加lml。

L-Glutamin溶液

制備：143

培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)液

培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基常用培養(yǎng)液144天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基（naturalmedia）包括：血清、組織提取液等。血清是細(xì)胞培養(yǎng)中最常使用的天然培養(yǎng)基。血清中含有許多能維持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖不可缺少的成分，如蛋白質(zhì)、多肽、激素及各種氨基酸、葡萄糖、酮酸等營(yíng)養(yǎng)成分。天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基（naturalmedia）包括：血145種類：分人血清和動(dòng)物血清兩大類。細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的是動(dòng)物血清，來自牛、馬、兔等動(dòng)物，其中牛血清比馬血清用得更廣泛。牛血清分為胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS）和小牛血清（calfserum，CS）兩種。種類：146FBS是經(jīng)剖腹從母牛子宮中取出的胎牛中分離到的血清，價(jià)格貴；CS是從剛出生但尚未哺乳的小牛中分離到的血清。目前市售的牛血清質(zhì)量不一，購(gòu)買之前應(yīng)通過細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行選擇試驗(yàn)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖與否。也可以用克隆形成率和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線作為指標(biāo)加以鑒定，而且要選擇經(jīng)過支原體試驗(yàn)合格的牛血清。FBS是經(jīng)剖腹從母牛子宮中取出的胎牛中分離到的血清，價(jià)格貴；147合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基（Syntheticmedia）是根據(jù)研究和了解細(xì)胞所需成分的基礎(chǔ)上配制而成的，現(xiàn)已成為普遍應(yīng)用的商品化的培養(yǎng)基。但合成培養(yǎng)基尚未成為十分完全的培養(yǎng)基，它只能維持細(xì)胞不死，而不能促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，使用時(shí)尚需添加天然培養(yǎng)基，主要是牛血清。目前常用的合成培養(yǎng)基主要是MEM、Eagle、RPMl-l640、199培養(yǎng)液等。合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基（Syntheticmedia）是148MEM培養(yǎng)液

常用的是MEM（MinimumEagleMedium，低限量培養(yǎng)基），僅含12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素，成分簡(jiǎn)單，適合各種已建成細(xì)胞系的培養(yǎng)，同時(shí)宜于添加或減少某些成分，也特別適于特殊研究的細(xì)胞培養(yǎng)工作。在它的基礎(chǔ)上改良的DMEM（Dulbecco’sModifiedEagleMedium，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基）應(yīng)用也十分廣泛。MEM培養(yǎng)液

常用的是MEM（MinimumEagle149RPMl-l640RPMl-l640是一種常用的培養(yǎng)液，最初是針對(duì)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，問世后發(fā)現(xiàn)能廣泛適應(yīng)許多種類的細(xì)胞，包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，而且成分簡(jiǎn)單，和MEM一樣應(yīng)用十分廣泛。配制方法RPMl-l640150

生長(zhǎng)液與維持液

血清含有多種促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、貼附的活性物質(zhì)。合成培養(yǎng)基中不加血清或低濃度（如2％）血清，僅能維持細(xì)胞生存，細(xì)胞不能很好生長(zhǎng)，這種培養(yǎng)基稱為維持液。加入5％的血清，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來說，能維持不死和緩慢生長(zhǎng)。一般需加入10％－20％血清，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，稱為生長(zhǎng)液。添加血清，雖利于細(xì)胞生長(zhǎng)，但不明成分也增多了，對(duì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加了困難。

生長(zhǎng)液與維持液

血清含有多種促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、貼附的活性物質(zhì)。151［附］RPMI—1640生長(zhǎng)液和維持液配法；

生長(zhǎng)液：RPMI-164087％小牛血清10％谷氨酸胺（100X）1％雙抗（100X）1％用5.6％NaHCO3調(diào)pH至7.0-7.2。維持液：RPMI-164095％小牛血清2％谷氨酸胺（100X）1％雙抗（100x）1％用5．6％NaHCO3調(diào)pH至7.0-7.2。

［附］RPMI—1640生長(zhǎng)液和維持液配法；

生長(zhǎng)液：152

無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基主要由基礎(chǔ)培養(yǎng)液和附加成分兩部分組成，前者大多數(shù)仍采用合成培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)溶液，常用的是F12和DMEM培基，二者按1:1混合補(bǔ)加15mmol/LHEPES等；后者是根據(jù)不同細(xì)胞的要求，附加特異性生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞附著蛋白、金屬離子轉(zhuǎn)移蛋白、細(xì)胞結(jié)合蛋白、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制劑和微量元素等。

無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基主要由基礎(chǔ)培養(yǎng)液和附加成分兩部分153

激素類：胰島素三碘甲狀腺原氨酸生長(zhǎng)激素（G）氫化可的松維生素A酸生長(zhǎng)因子：上皮生長(zhǎng)因子（EGF）成纖維生長(zhǎng)因子（FGF）神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）激素類：胰島素154

金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin）微量元素：硒酸鈉（Na2SeO3）酶抑制劑：大豆胰酶抑制劑（soybeantrypsininbibitor）抑蛋白酶肽（aprotinin）金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白155基本技術(shù)培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求無菌操作、前準(zhǔn)備、消毒等

基本培養(yǎng)操作技術(shù)

基本技術(shù)培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求156取材

一般說來，各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織均可用于培養(yǎng)。但實(shí)際上，只有幼年組織尤其是胚胎組織以及腫瘤組織和其他分化程度低的組織比較容易培養(yǎng)。從體內(nèi)取材時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，防止污染。對(duì)其他暴露于外界的組織，應(yīng)將所取的組織放入含二性霉素（2μg／ml），青霉素（500u／ml），鏈霉素（500μg／ml）的培養(yǎng)液中浸泡10－20min。取材之后，應(yīng)立即培養(yǎng)，否則應(yīng)把組織切成1mm3左右的小塊，放入培養(yǎng)液內(nèi)，置4℃貯存，存放時(shí)間不宜超過24小時(shí)。取材

一般說來，各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織均可用于培養(yǎng)。但157

細(xì)胞分散

機(jī)械分散法對(duì)某些軟組織如腦、胚胎以及某些腫瘤等，可采用機(jī)械法進(jìn)行分散。較為常用的方法是用組織勻漿器研碎組織，然后通過不銹鋼紗網(wǎng)獲得單細(xì)胞懸液。此法簡(jiǎn)便省時(shí)，但對(duì)組織有一定損失。

細(xì)胞分散

機(jī)械分散法158

酶消化法

胰蛋白酶消化法胰蛋白酶適用于消化間質(zhì)較少的軟組織，對(duì)傳代細(xì)胞的消化也比較好。使用胰蛋白酶的消化程序如下：將組織剪成lmm3的大小，置于三角燒瓶中，加入比細(xì)胞多30－50倍的0．25％胰蛋白酶液。置電磁攪拌器上攪拌（30－100r／min），消化30－60min；或放入37℃水浴中消化，但中間要不時(shí)搖動(dòng)；

酶消化法

胰蛋白酶消化法胰蛋白酶適用于消化間質(zhì)較少的軟組織159消化完畢后，吸取2／3上清液于離心管中，1000rpm5min，然后用Hanks液離心漂洗兩次；加入一定量的營(yíng)養(yǎng)液，通過200目的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)濾過，即可用于培養(yǎng)。上述方法亦稱為熱消化，有時(shí)可將組織加入胰蛋白酶后，置于4℃，進(jìn)行緩慢消化，消化時(shí)間可延長(zhǎng)12－24h，此法稱冷消化法。消化完畢后，吸取2／3上清液于離心管中，1000rpm5160膠原酶消化法此法對(duì)膠原有較強(qiáng)的消化作用，適用消化纖維組織，上皮組織及瘤組織等。膠原酶常用劑量終濃度200u／ml或0.l－0.3μg／ml。此法消化作用緩和消化過程與胰蛋白消化法基本相同?？陕?lián)合應(yīng)用胰蛋白酶和膠原酶消化某些硬組織，其消化效果更佳。膠原酶消化法此法對(duì)膠原有較強(qiáng)的消化作用，適用消化纖維組織，上161

實(shí)驗(yàn)中常用EDTA作為化學(xué)螯合劑，其溶液又稱Versen液。使用濃度一般為0.02％。螯合劑分散法常用于消化傳代細(xì)胞，此法作用溫和，毒性較小。

螯合劑分散法

實(shí)驗(yàn)中常用EDTA作為化學(xué)螯合劑，其溶液又稱Versen162細(xì)胞的分裝、培養(yǎng)及傳代

根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)，用生長(zhǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋成（3-5）x105個(gè)／ml，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)分裝一定量。一般接種細(xì)胞數(shù)應(yīng)視細(xì)胞種類不同而定，如類上皮細(xì)胞應(yīng)為（1－3）x105／ml，成纖維細(xì)胞應(yīng)加倍（2-6）x105／ml。若為胚胎組織細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量可低些，而成體組織細(xì)胞數(shù)量則應(yīng)高些；細(xì)胞活力好的接種數(shù)可少些，年老組織接種的量就應(yīng)多些。細(xì)胞的分裝、培養(yǎng)及傳代163已鋪滿瓶底面的單層細(xì)胞，如繼續(xù)培養(yǎng)則易老化，甚至脫落。感染病毒等影響特異性CPE的判斷，因此成片細(xì)胞不能當(dāng)天使用，應(yīng)換成維持液（含2％以下血清的培養(yǎng)基），以后每隔5－7天換維持液一次，一般可維持1－3周。已鋪滿瓶底面的單層細(xì)胞，如繼續(xù)培養(yǎng)則易老化，甚至脫落。164單層的原代細(xì)胞可進(jìn)行傳代培養(yǎng)用細(xì)胞分散劑（胰酶、EDTA或胰酶+EDTA等）處理，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿底脫離，加生長(zhǎng)液充分吹打，制成單個(gè)細(xì)胞懸液分裝。加入生長(zhǎng)液的量可按原量的2倍，即一瓶傳成二瓶，置37℃培養(yǎng)3－5天可形成單層，成片后換維持液即可進(jìn)行試驗(yàn)。單層的原代細(xì)胞可進(jìn)行傳代培養(yǎng)用細(xì)胞分散劑（胰酶、EDTA或165

細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件166細(xì)胞的凍存培養(yǎng)細(xì)胞維持傳代以供實(shí)驗(yàn)用常遇到某些困難。細(xì)胞株在傳代中性質(zhì)易發(fā)生改變;在傳代中有支原體污染的危險(xiǎn);對(duì)有限增殖細(xì)胞株，傳代應(yīng)維持在限內(nèi)期間傳代，解決這些困難的辦法就是將細(xì)胞凍存。細(xì)胞凍存在液氮中，貯存時(shí)間幾乎是無限的。細(xì)胞的凍存培養(yǎng)細(xì)胞維持傳代以供實(shí)驗(yàn)用常遇到某些困難。細(xì)胞株在167凍存細(xì)胞的原理與要求原理：在不加保護(hù)條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列變化，如機(jī)械損傷、電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白質(zhì)變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使冰點(diǎn)降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。貯存在-130℃以下低溫中能減少冰晶的形成。凍存細(xì)胞的原理與要求原理：在不加保護(hù)條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)168融解細(xì)胞時(shí)，速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的-5℃－0℃后，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力不受任何損害。當(dāng)前使用的保護(hù)劑為DMSO和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，使用濃度范圍在5％－15％之間，常用10％。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件169

要求：為保持細(xì)胞最大存活率，一般采用慢凍快融的方法。標(biāo)準(zhǔn)的冷凍速度為l-2℃／min，當(dāng)溫度達(dá)-25℃時(shí)，下降率可增至5—10℃／min,到一100℃時(shí)則可迅速浸入液氮中。要適當(dāng)掌握下降速度，過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。但各種細(xì)胞對(duì)凍結(jié)速度要求不一樣，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的耐受性能大些，骨髓干細(xì)胞1-3℃／min合適，胚胎細(xì)胞耐性較小。要求：為保持細(xì)胞最大存活率，一般采用慢凍快融的方法。標(biāo)準(zhǔn)的170

開始時(shí)下降速度不能超10℃／min。另外用什么保護(hù)劑合適和用量多大，要依細(xì)胞而定，初代培養(yǎng)用DMSO較好，一般細(xì)胞可用甘油。用量以較小為好，有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在20％－30％甘油中很好。原則上細(xì)胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見，凍存一年后，應(yīng)再?gòu)?fù)蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣東醫(yī)學(xué)院課件171

選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在收集細(xì)胞24小時(shí)前換液一次。常規(guī)方法消化細(xì)胞，按l－5xl06／ml細(xì)胞濃度，懸浮于含10％二甲基亞砜（DMSO）的小牛血清或生長(zhǎng)液中。凍存的細(xì)胞數(shù)量要充分，因復(fù)蘇時(shí)接種的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)比平常多一些。用吸管吸取細(xì)胞懸液，分裝于無菌凍存管（每?jī)龃婀躭ml），嚴(yán)密封口，放入三層紗布小袋（內(nèi)放鉛塊以防止漂