《單克隆抗體技術(shù)》課件_第1頁(yè)
《單克隆抗體技術(shù)》課件_第2頁(yè)
《單克隆抗體技術(shù)》課件_第3頁(yè)
《單克隆抗體技術(shù)》課件_第4頁(yè)
《單克隆抗體技術(shù)》課件_第5頁(yè)
已閱讀5頁(yè),還剩137頁(yè)未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)1疫苗和抗體的研制,是生物技術(shù)發(fā)展的永恒主題。目前在美國(guó)單克隆抗體類藥物已占FDA所批生物藥的3/4。疫苗和抗體的研制,是生物技術(shù)發(fā)展的永恒主題2美國(guó)已上市16種單克隆抗體藥物2002年銷售額29億美元2005年90億美元我國(guó)的單克隆抗體藥物市場(chǎng)還處于起步階段,更談不上抗體組藥物的發(fā)展。凝集細(xì)菌抗體攻擊病毒美國(guó)已上市16種單克隆抗體藥物凝集細(xì)菌抗體攻擊病毒3抗體是對(duì)其抗原有極強(qiáng)專一性的魔彈或巡弋飛彈研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測(cè)

特定抗原醫(yī)療 以毒素連結(jié)抗體攻擊

病變細(xì)胞檢驗(yàn) 以ELISA偵測(cè)特定

病原體抗體是對(duì)其抗原有極強(qiáng)專一性的研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測(cè)特4抗體藥物銷售趨勢(shì)圖抗體藥物銷售趨勢(shì)圖5生物技術(shù)生物技術(shù)制藥基因工程藥物(蛋白類藥物)人源化治療性單克隆抗體藥物基因治療技術(shù)現(xiàn)代中藥生物技術(shù)生物技術(shù)制藥基因工程藥物(蛋白類藥物)人源化治療性單6●至2000年底,在美國(guó)藥品市場(chǎng)上生物技術(shù)藥物有76種,其中抗體藥物有15種?!?003年治療用單抗銷售總額已超過(guò)52億美元?!?006年預(yù)計(jì)50-60個(gè)治療性單抗上市?!?010年預(yù)計(jì)單抗銷售額200億美元。●美國(guó)已占全球單抗市場(chǎng)90%—一支獨(dú)秀。●完全人源化單抗現(xiàn)有多個(gè)處于臨床前階段●至2000年底,在美國(guó)藥品市場(chǎng)上生物技術(shù)藥物有76種,7多克隆抗體多克隆抗體8Epitope,Antigenicdeterminant抗原決定基●

一個(gè)抗原分子上可能有數(shù)個(gè)抗原決定基●

每個(gè)

抗原決定基

至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性

抗原決定基

含有六個(gè)以上氨基酸Epitope,Antigenicdeterminant9整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體(抗血清)單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”(單鏈抗體)組合抗體庫(kù)技術(shù)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技10多克隆抗體(polyclonalantibody)指由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清(含多種特異性抗體)。

實(shí)際意義:(1)預(yù)防、治療感染性疾病,如:破傷風(fēng)抗毒素血清抗破傷風(fēng),胎盤(pán)球蛋白抗病毒感染等副作用:超敏反應(yīng)(2)臨床診斷,如:肥達(dá)氏反應(yīng)--傷寒、副傷寒缺點(diǎn):特異性差。多克隆抗體(polyclonalantibody)11抗體體內(nèi)生成的理論

抗原刺激前,機(jī)體具有抗體初級(jí)庫(kù)抗原刺激后,抗體生成的細(xì)胞群體被選擇,并發(fā)生克隆性增殖。在抗原的反復(fù)刺激下,抗體的V區(qū)發(fā)生高頻率突變,產(chǎn)生高親和力抗體的細(xì)胞被選擇,抗體進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換,最終抗體成熟。抗體體內(nèi)生成的理論12傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾13

傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒(méi)有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’123123123傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒(méi)有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?114單克隆抗體單克隆抗體15雜交瘤技術(shù)的理論基礎(chǔ)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說(shuō),即一種克隆只產(chǎn)生一種抗體細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方親代細(xì)胞的特性利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選雜交瘤細(xì)胞,并克隆化,制備McAb雜交瘤技術(shù)的理論基礎(chǔ)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說(shuō),即一種克16可生產(chǎn)有用抗體的

淋巴細(xì)胞

若與

癌細(xì)胞融合,則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細(xì)胞株。癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長(zhǎng)漿細(xì)胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長(zhǎng)產(chǎn)生專一性抗體一個(gè)Bcell只產(chǎn)生一種抗體可生產(chǎn)有用抗體的淋巴細(xì)胞若與癌細(xì)胞融合,則形成穩(wěn)定而可17細(xì)胞DNA合成途經(jīng)1.替代途徑:次黃嘌呤(H)HGPRT2.主要途徑:氨基酸鳥(niǎo)嘌呤核苷酸谷氨酰胺(A-)尿核苷單磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途徑:胸腺嘧啶核苷(T)細(xì)胞DNA合成途經(jīng)1.替代途徑:次黃嘌呤(H)18m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤19HAT選擇培養(yǎng)基的原理HAT選擇培養(yǎng)基組分次黃嘌呤(hypoxanthine,H)氨甲喋呤(aminopterin,A):葉酸拮抗劑胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)HAT選擇培養(yǎng)基的原理HAT選擇培養(yǎng)基組分20

抗原免疫的脾細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞(B細(xì)胞)(B細(xì)胞惡性腫瘤)1.抗體分泌(Ig+)1.具永生性2.HGPRT+在HAT生長(zhǎng)2.8-AG篩選出

HGPRT-株

PEG融合HAT篩選

脾-骨髓瘤細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞)

(HGPRT+、Ig+)

抗原免疫的脾細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)21融合的結(jié)果及命運(yùn)雜交瘤細(xì)胞未融合的脾細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞脾-脾雜交細(xì)胞骨髓瘤-骨髓瘤雜交細(xì)胞融合的結(jié)果及命運(yùn)雜交瘤細(xì)胞未融合的脾細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞脾22免疫動(dòng)物培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞

收集致敏的B淋巴細(xì)胞收集骨髓瘤細(xì)胞

細(xì)胞融合HAT選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞檢測(cè)篩選陽(yáng)性細(xì)胞

克隆化培養(yǎng)(反復(fù)3-5次)

獲得穩(wěn)定分泌McAb的雜交瘤細(xì)胞株

McAb的制備(雜交瘤培養(yǎng)上清或誘生腹水)

McAb純化及鑒定免疫動(dòng)物23制備單克隆抗體的基本技術(shù)1抗原提純與動(dòng)物免疫2骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備3細(xì)胞融合4抗體檢測(cè)5雜交瘤的克隆化和凍存6McAB的制備7單克隆抗體的純化制備單克隆抗體的基本技術(shù)1抗原提純與動(dòng)物免疫24

抗體-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體(抗血清)是所有抗體的混和

脾臟產(chǎn)生各種

B細(xì)胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫

抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已建立之小鼠骨髓癌細(xì)胞株由脾臟收集B細(xì)胞抗原通常有多個(gè)抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次AgX抗體-a-b-c-d-a-b-25免疫成功的標(biāo)志是在融合時(shí)脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特異性B細(xì)胞,此時(shí)血清中抗體效價(jià)不一定最高??扇苄钥乖?0-15ug/100ul+等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔2-4周后加強(qiáng)免疫(量減半,改用不完全佐劑,可反復(fù)多次)沖擊免疫(融合前3天進(jìn)行)選用6-12周齡Balb/c小鼠免疫成功的標(biāo)志是在融合時(shí)脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特異性B細(xì)26顆粒性抗原免疫性較強(qiáng),不加佐劑就可獲得很好的免疫效果可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐劑目前,用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新,如①將可溶性抗原顆?;蚬滔嗷?,一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑,基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑,提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平,促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)抗原反應(yīng)性。

顆粒性抗原免疫性較強(qiáng),不加佐劑就可獲得很好的免疫效果271234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開(kāi)1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+各抗28骨髓瘤細(xì)胞系選擇要點(diǎn):穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤細(xì)胞系有:NS1、SP2/0、X63等。保存:防止突變、定期篩選(8-氮鳥(niǎo)嘌呤)防止支原體污染(胎牛血清)融合時(shí)保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,良好的形態(tài),活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95%融合比例脾細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞=3:1許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞,如:在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有:小鼠腹腔巨噬細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞一般在融合前一天制備

骨髓瘤細(xì)胞系選擇要點(diǎn):29免疫脾細(xì)胞:處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞-漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天后的脾臟。融合比例:骨髓瘤細(xì)胞:脾細(xì)胞=1:5或1:10融合劑:40%PEG(分子量1000-2000)融合24小時(shí)后加HAT培養(yǎng)液2周后改用HT培養(yǎng)液2周后改用一般培養(yǎng)液免疫脾細(xì)胞:處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞-漿母細(xì)胞。一般取30-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤細(xì)胞(Subcloning)

(確定只有一種細(xì)胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌細(xì)胞Bcell脾細(xì)胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體(抗血清)試驗(yàn)專一性對(duì)抗原的反應(yīng)無(wú)法分辨完全不同d舊有抗原d’新的抗原-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgAgELISAHATPEG31一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10時(shí),開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體,篩選出所需雜交瘤細(xì)胞系??煽康暮Y選方法須在融合前建立,避免由于方法不當(dāng)貽誤篩選時(shí)機(jī)。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10時(shí),開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體,篩選32克隆化:指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開(kāi)??寺』脑瓌t:盡早進(jìn)行,反復(fù)4-5次克隆化方法:有限稀釋法、軟瓊脂平板法、顯微克隆法陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時(shí)凍存,防染色體丟失、變異及污染克隆化:指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體33

一個(gè)

B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體,對(duì)付某一

抗原決定基。●

若有許多抗原決定基,則需許多株

B細(xì)胞分別生產(chǎn)許多抗體。BBBYYYY抗原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基●一個(gè)B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體,對(duì)付某一抗原決定基341234mmmm1234YYYYYYYYY1234mmmm1234YYYYYYYYY35單抗生產(chǎn)的方法:動(dòng)物體內(nèi)誘生法:小鼠腹腔注射降植丸或液體石蠟,1周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞,7-10天后出現(xiàn)腹水,無(wú)菌采集。單抗生產(chǎn)的方法:36基因工程抗體基因工程抗體37《單克隆抗體技術(shù)》課件381人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)39

構(gòu)建嵌合抗體的大致過(guò)程是,將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來(lái),連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。構(gòu)建重組表達(dá)載體構(gòu)建嵌合抗體的大致過(guò)程是,將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆40克隆鼠單抗的可變區(qū)基因,可從基因組文庫(kù)中分離,也可用PCR技術(shù)分離。人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇,不同的恒定區(qū)會(huì)帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用,可通過(guò)點(diǎn)突變來(lái)修飾調(diào)整其效應(yīng)。

人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比,免疫原性大大降低,利于在人體內(nèi)應(yīng)用,所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體。克隆鼠單抗的可變區(qū)基因,可從基因組文庫(kù)中分離,也可用PC412鼠單抗可變區(qū)的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多,但有時(shí)它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分,發(fā)展出CDR移植技術(shù)。CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi),所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體,也就是人源化抗體。

2鼠單抗可變區(qū)的人源化盡管嵌合抗體的免疫42《單克隆抗體技術(shù)》課件43經(jīng)過(guò)CDR移植,抗體的免疫原性極低,而其抗原結(jié)合能力保持不變,結(jié)合半抗原及全抗原(如細(xì)胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報(bào)道,到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。(美國(guó)正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體)經(jīng)過(guò)CDR移植,抗體的免疫原性極低,而其抗原結(jié)合能力44人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架,以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR,將整個(gè)可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段,并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。合成所有DNA片段,每組片段分別退火,然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因,插入質(zhì)粒中,進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。

人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。45

定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆,根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物,用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列,然后表達(dá)出改型抗體。

研究表明,在構(gòu)建改形抗體時(shí),簡(jiǎn)單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力,因此在構(gòu)建時(shí)還必需包括對(duì)影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進(jìn)行操作。定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆,根據(jù)鼠抗體的CDR序46小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識(shí)別單位等幾種。小分子抗體有很多優(yōu)點(diǎn):

可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn),成本低;分子小,穿透力強(qiáng);不含F(xiàn)c,沒(méi)有Fc帶來(lái)的效應(yīng);在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短,易清除,利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接,便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。

3小分子抗體小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識(shí)別47FvScFv單區(qū)抗體最小識(shí)別單位FabFvScFv單區(qū)抗體最小識(shí)別單位Fab48由完整的輕鏈和Fd組成,大小為完整分子的1/3。

把Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連,在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔,裝配折疊后,它具有結(jié)合抗原的活性。(1)Fab由完整的輕鏈和Fd組成,大小為完整分子的1/3。(149

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(250

Fv由VH與VL構(gòu)成,由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合,故Fv不穩(wěn)定。在VH與VL之間加上一段連接肽,把VH與VL連成一條單鏈,得到ScFv,即單鏈抗體。

連接肽的長(zhǎng)度在10-15個(gè)氨基酸左右,不宜太長(zhǎng)或太短,它應(yīng)具有柔軟性,側(cè)鏈少,抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是(GGGGS)3。

Fv由VH與VL構(gòu)成,由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合,故Fv不穩(wěn)51

單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時(shí),可用定點(diǎn)突變法在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點(diǎn),與人工合成的連接肽編碼序列連接,組裝到表達(dá)載體中;如果從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體,可用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因,再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;52

單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌,有2種方式:一是表達(dá)為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高,可達(dá)細(xì)菌蛋白總量的5%-20%,但需進(jìn)行變性復(fù)性,使其形成正確的立體結(jié)構(gòu),恢復(fù)抗體活性;二是分泌型表達(dá),將細(xì)菌的信號(hào)肽序列與單鏈抗體的氨基端相連,單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細(xì)菌體外,進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者,一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下每升細(xì)菌的產(chǎn)量?jī)H在數(shù)毫克左右。單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌,有2種方式:53即為VH,約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低,但仍保持著原單抗的特異性。(3)單域抗體VH即為VH,約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,54約為完整分子的1/80-1/70大小,一般由一個(gè)CDR構(gòu)成,它也保持著抗體的特異性。(4)最小識(shí)別單位CDR約為完整分子的1/80-1/70大小,一般由一個(gè)CDR構(gòu)554雙特異抗體和多價(jià)抗體

雙鏈抗體(Diabody)一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價(jià)雙特異性抗體片段。

4雙特異抗體和多價(jià)抗體雙鏈抗體(Diabody)56

雙特異性抗體(bispecificantibody,BSAb)是指能同時(shí)識(shí)別2種抗原的抗體。1種為對(duì)應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另1種為對(duì)應(yīng)效應(yīng)成分。

即能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。雙特異性抗體(bispecificantibody57

Hollinger等巧妙地將A抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗B抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過(guò)短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順?lè)醋拥谋磉_(dá)質(zhì)粒中,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒,目前報(bào)道的表達(dá)質(zhì)粒均為雙順?lè)醋?。表達(dá)后,VLAVHB與VHAVLB交叉連結(jié),形成雙特異性抗體。Hollinger等巧妙地將A抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基58《單克隆抗體技術(shù)》課件59所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細(xì)胞再導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞處,從而使效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性增強(qiáng),發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用,這是腫瘤治療的新突破。所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性60《單克隆抗體技術(shù)》課件61

抗體庫(kù)技術(shù)是用基因工程方法把人或其他動(dòng)物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來(lái),在原核載體上表達(dá),然后篩選出所需的特異基因和抗體。

PCR技術(shù);免疫球蛋白Fab片段在大腸桿菌中的成功表達(dá);噬菌體表面展示文庫(kù)技術(shù)。5抗體庫(kù)技術(shù)5抗體庫(kù)技術(shù)62

初期的抗體庫(kù)技術(shù)是從淋巴細(xì)胞中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA或直接用總DNA為模板,用PCR技術(shù)建立輕、重鏈文庫(kù),在大腸桿菌中表達(dá)后篩選。

初期的抗體庫(kù)技術(shù)是從淋巴細(xì)胞中提取總RNA,反轉(zhuǎn)63它是在PCR技術(shù)和PhageDisplay的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。其過(guò)程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA,與噬菌體外殼蛋白的基因相連,在輔助噬菌體的幫助下,噬菌粒包裝成絲狀噬菌體,抗體分子通過(guò)與PⅢ或PⅧ相連,在噬菌體表面的一端或分散分布,然后可直接對(duì)噬菌體表面的抗體分子進(jìn)行篩選。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)它是在PCR技術(shù)和PhageDisplay的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)64

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng),通過(guò)將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游,使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面,利用親和層析,兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來(lái)了革命性的變革。噬菌體表面展示系統(tǒng)(phagesurfacedisplaysystem)1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面65《單克隆抗體技術(shù)》課件66

噬菌體表面展示文庫(kù)技術(shù)的要點(diǎn):外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫(kù)插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導(dǎo)系列的緊靠下游隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫(kù)從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段噬菌體表面展示文庫(kù)技術(shù)的要點(diǎn):67用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡(jiǎn)捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫(kù)。使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的周質(zhì)腔內(nèi),形成游離的抗體片段,經(jīng)過(guò)純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后,轉(zhuǎn)入大腸桿菌,用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡(jiǎn)68該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):

將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來(lái);可繞過(guò)雜交瘤技術(shù),不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù);抗體基因篩選的范圍廣;技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)?;a(chǎn);適用范圍廣,既可用于抗體制備,也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機(jī)多肽等的生產(chǎn)。該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):69噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡(jiǎn)單易行,篩選容量大,效率高,繞過(guò)了細(xì)胞融合及免疫等步驟,而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識(shí)別一增殖過(guò)程上模擬了B細(xì)胞的成熟過(guò)程,從而在實(shí)際應(yīng)用上具有很大意義。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡(jiǎn)單易行,篩選容70《單克隆抗體技術(shù)》課件71單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)72疫苗和抗體的研制,是生物技術(shù)發(fā)展的永恒主題。目前在美國(guó)單克隆抗體類藥物已占FDA所批生物藥的3/4。疫苗和抗體的研制,是生物技術(shù)發(fā)展的永恒主題73美國(guó)已上市16種單克隆抗體藥物2002年銷售額29億美元2005年90億美元我國(guó)的單克隆抗體藥物市場(chǎng)還處于起步階段,更談不上抗體組藥物的發(fā)展。凝集細(xì)菌抗體攻擊病毒美國(guó)已上市16種單克隆抗體藥物凝集細(xì)菌抗體攻擊病毒74抗體是對(duì)其抗原有極強(qiáng)專一性的魔彈或巡弋飛彈研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測(cè)

特定抗原醫(yī)療 以毒素連結(jié)抗體攻擊

病變細(xì)胞檢驗(yàn) 以ELISA偵測(cè)特定

病原體抗體是對(duì)其抗原有極強(qiáng)專一性的研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測(cè)特75抗體藥物銷售趨勢(shì)圖抗體藥物銷售趨勢(shì)圖76生物技術(shù)生物技術(shù)制藥基因工程藥物(蛋白類藥物)人源化治療性單克隆抗體藥物基因治療技術(shù)現(xiàn)代中藥生物技術(shù)生物技術(shù)制藥基因工程藥物(蛋白類藥物)人源化治療性單77●至2000年底,在美國(guó)藥品市場(chǎng)上生物技術(shù)藥物有76種,其中抗體藥物有15種?!?003年治療用單抗銷售總額已超過(guò)52億美元?!?006年預(yù)計(jì)50-60個(gè)治療性單抗上市?!?010年預(yù)計(jì)單抗銷售額200億美元?!衩绹?guó)已占全球單抗市場(chǎng)90%—一支獨(dú)秀。●完全人源化單抗現(xiàn)有多個(gè)處于臨床前階段●至2000年底,在美國(guó)藥品市場(chǎng)上生物技術(shù)藥物有76種,78多克隆抗體多克隆抗體79Epitope,Antigenicdeterminant抗原決定基●

一個(gè)抗原分子上可能有數(shù)個(gè)抗原決定基●

每個(gè)

抗原決定基

至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性

抗原決定基

含有六個(gè)以上氨基酸Epitope,Antigenicdeterminant80整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體(抗血清)單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”(單鏈抗體)組合抗體庫(kù)技術(shù)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技81多克隆抗體(polyclonalantibody)指由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清(含多種特異性抗體)。

實(shí)際意義:(1)預(yù)防、治療感染性疾病,如:破傷風(fēng)抗毒素血清抗破傷風(fēng),胎盤(pán)球蛋白抗病毒感染等副作用:超敏反應(yīng)(2)臨床診斷,如:肥達(dá)氏反應(yīng)--傷寒、副傷寒缺點(diǎn):特異性差。多克隆抗體(polyclonalantibody)82抗體體內(nèi)生成的理論

抗原刺激前,機(jī)體具有抗體初級(jí)庫(kù)抗原刺激后,抗體生成的細(xì)胞群體被選擇,并發(fā)生克隆性增殖。在抗原的反復(fù)刺激下,抗體的V區(qū)發(fā)生高頻率突變,產(chǎn)生高親和力抗體的細(xì)胞被選擇,抗體進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換,最終抗體成熟??贵w體內(nèi)生成的理論83傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾84

傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒(méi)有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’123123123傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒(méi)有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?185單克隆抗體單克隆抗體86雜交瘤技術(shù)的理論基礎(chǔ)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說(shuō),即一種克隆只產(chǎn)生一種抗體細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方親代細(xì)胞的特性利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選雜交瘤細(xì)胞,并克隆化,制備McAb雜交瘤技術(shù)的理論基礎(chǔ)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說(shuō),即一種克87可生產(chǎn)有用抗體的

淋巴細(xì)胞

若與

癌細(xì)胞融合,則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細(xì)胞株。癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長(zhǎng)漿細(xì)胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長(zhǎng)產(chǎn)生專一性抗體一個(gè)Bcell只產(chǎn)生一種抗體可生產(chǎn)有用抗體的淋巴細(xì)胞若與癌細(xì)胞融合,則形成穩(wěn)定而可88細(xì)胞DNA合成途經(jīng)1.替代途徑:次黃嘌呤(H)HGPRT2.主要途徑:氨基酸鳥(niǎo)嘌呤核苷酸谷氨酰胺(A-)尿核苷單磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途徑:胸腺嘧啶核苷(T)細(xì)胞DNA合成途經(jīng)1.替代途徑:次黃嘌呤(H)89m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤90HAT選擇培養(yǎng)基的原理HAT選擇培養(yǎng)基組分次黃嘌呤(hypoxanthine,H)氨甲喋呤(aminopterin,A):葉酸拮抗劑胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)HAT選擇培養(yǎng)基的原理HAT選擇培養(yǎng)基組分91

抗原免疫的脾細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞(B細(xì)胞)(B細(xì)胞惡性腫瘤)1.抗體分泌(Ig+)1.具永生性2.HGPRT+在HAT生長(zhǎng)2.8-AG篩選出

HGPRT-株

PEG融合HAT篩選

脾-骨髓瘤細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞)

(HGPRT+、Ig+)

抗原免疫的脾細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)92融合的結(jié)果及命運(yùn)雜交瘤細(xì)胞未融合的脾細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞脾-脾雜交細(xì)胞骨髓瘤-骨髓瘤雜交細(xì)胞融合的結(jié)果及命運(yùn)雜交瘤細(xì)胞未融合的脾細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞脾93免疫動(dòng)物培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞

收集致敏的B淋巴細(xì)胞收集骨髓瘤細(xì)胞

細(xì)胞融合HAT選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞檢測(cè)篩選陽(yáng)性細(xì)胞

克隆化培養(yǎng)(反復(fù)3-5次)

獲得穩(wěn)定分泌McAb的雜交瘤細(xì)胞株

McAb的制備(雜交瘤培養(yǎng)上清或誘生腹水)

McAb純化及鑒定免疫動(dòng)物94制備單克隆抗體的基本技術(shù)1抗原提純與動(dòng)物免疫2骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備3細(xì)胞融合4抗體檢測(cè)5雜交瘤的克隆化和凍存6McAB的制備7單克隆抗體的純化制備單克隆抗體的基本技術(shù)1抗原提純與動(dòng)物免疫95

抗體-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體(抗血清)是所有抗體的混和

脾臟產(chǎn)生各種

B細(xì)胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫

抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已建立之小鼠骨髓癌細(xì)胞株由脾臟收集B細(xì)胞抗原通常有多個(gè)抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次AgX抗體-a-b-c-d-a-b-96免疫成功的標(biāo)志是在融合時(shí)脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特異性B細(xì)胞,此時(shí)血清中抗體效價(jià)不一定最高??扇苄钥乖?0-15ug/100ul+等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔2-4周后加強(qiáng)免疫(量減半,改用不完全佐劑,可反復(fù)多次)沖擊免疫(融合前3天進(jìn)行)選用6-12周齡Balb/c小鼠免疫成功的標(biāo)志是在融合時(shí)脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特異性B細(xì)97顆粒性抗原免疫性較強(qiáng),不加佐劑就可獲得很好的免疫效果可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐劑目前,用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新,如①將可溶性抗原顆?;蚬滔嗷?,一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑,基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑,提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平,促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)抗原反應(yīng)性。

顆粒性抗原免疫性較強(qiáng),不加佐劑就可獲得很好的免疫效果981234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開(kāi)1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+各抗99骨髓瘤細(xì)胞系選擇要點(diǎn):穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤細(xì)胞系有:NS1、SP2/0、X63等。保存:防止突變、定期篩選(8-氮鳥(niǎo)嘌呤)防止支原體污染(胎牛血清)融合時(shí)保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,良好的形態(tài),活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95%融合比例脾細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞=3:1許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞,如:在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有:小鼠腹腔巨噬細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞一般在融合前一天制備

骨髓瘤細(xì)胞系選擇要點(diǎn):100免疫脾細(xì)胞:處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞-漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天后的脾臟。融合比例:骨髓瘤細(xì)胞:脾細(xì)胞=1:5或1:10融合劑:40%PEG(分子量1000-2000)融合24小時(shí)后加HAT培養(yǎng)液2周后改用HT培養(yǎng)液2周后改用一般培養(yǎng)液免疫脾細(xì)胞:處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞-漿母細(xì)胞。一般取101-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤細(xì)胞(Subcloning)

(確定只有一種細(xì)胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌細(xì)胞Bcell脾細(xì)胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體(抗血清)試驗(yàn)專一性對(duì)抗原的反應(yīng)無(wú)法分辨完全不同d舊有抗原d’新的抗原-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgAgELISAHATPEG102一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10時(shí),開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體,篩選出所需雜交瘤細(xì)胞系??煽康暮Y選方法須在融合前建立,避免由于方法不當(dāng)貽誤篩選時(shí)機(jī)。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10時(shí),開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體,篩選103克隆化:指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開(kāi)??寺』脑瓌t:盡早進(jìn)行,反復(fù)4-5次克隆化方法:有限稀釋法、軟瓊脂平板法、顯微克隆法陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時(shí)凍存,防染色體丟失、變異及污染克隆化:指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體104

一個(gè)

B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體,對(duì)付某一

抗原決定基。●

若有許多抗原決定基,則需許多株

B細(xì)胞分別生產(chǎn)許多抗體。BBBYYYY抗原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基●一個(gè)B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體,對(duì)付某一抗原決定基1051234mmmm1234YYYYYYYYY1234mmmm1234YYYYYYYYY106單抗生產(chǎn)的方法:動(dòng)物體內(nèi)誘生法:小鼠腹腔注射降植丸或液體石蠟,1周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞,7-10天后出現(xiàn)腹水,無(wú)菌采集。單抗生產(chǎn)的方法:107基因工程抗體基因工程抗體108《單克隆抗體技術(shù)》課件1091人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)110

構(gòu)建嵌合抗體的大致過(guò)程是,將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來(lái),連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。構(gòu)建重組表達(dá)載體構(gòu)建嵌合抗體的大致過(guò)程是,將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆111克隆鼠單抗的可變區(qū)基因,可從基因組文庫(kù)中分離,也可用PCR技術(shù)分離。人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇,不同的恒定區(qū)會(huì)帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用,可通過(guò)點(diǎn)突變來(lái)修飾調(diào)整其效應(yīng)。

人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比,免疫原性大大降低,利于在人體內(nèi)應(yīng)用,所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體。克隆鼠單抗的可變區(qū)基因,可從基因組文庫(kù)中分離,也可用PC1122鼠單抗可變區(qū)的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多,但有時(shí)它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分,發(fā)展出CDR移植技術(shù)。CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi),所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體,也就是人源化抗體。

2鼠單抗可變區(qū)的人源化盡管嵌合抗體的免疫113《單克隆抗體技術(shù)》課件114經(jīng)過(guò)CDR移植,抗體的免疫原性極低,而其抗原結(jié)合能力保持不變,結(jié)合半抗原及全抗原(如細(xì)胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報(bào)道,到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。(美國(guó)正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體)經(jīng)過(guò)CDR移植,抗體的免疫原性極低,而其抗原結(jié)合能力115人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架,以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR,將整個(gè)可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段,并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。合成所有DNA片段,每組片段分別退火,然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因,插入質(zhì)粒中,進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。

人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。116

定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆,根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物,用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列,然后表達(dá)出改型抗體。

研究表明,在構(gòu)建改形抗體時(shí),簡(jiǎn)單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力,因此在構(gòu)建時(shí)還必需包括對(duì)影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進(jìn)行操作。定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆,根據(jù)鼠抗體的CDR序117小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識(shí)別單位等幾種。小分子抗體有很多優(yōu)點(diǎn):

可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn),成本低;分子小,穿透力強(qiáng);不含F(xiàn)c,沒(méi)有Fc帶來(lái)的效應(yīng);在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短,易清除,利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接,便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。

3小分子抗體小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識(shí)別118FvScFv單區(qū)抗體最小識(shí)別單位FabFvScFv單區(qū)抗體最小識(shí)別單位Fab119由完整的輕鏈和Fd組成,大小為完整分子的1/3。

把Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連,在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔,裝配折疊后,它具有結(jié)合抗原的活性。(1)Fab由完整的輕鏈和Fd組成,大小為完整分子的1/3。(1120

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2121

Fv由VH與VL構(gòu)成,由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合,故Fv不穩(wěn)定。在VH與VL之間加上一段連接肽,把VH與VL連成一條單鏈,得到ScFv,即單鏈抗體。

連接肽的長(zhǎng)度在10-15個(gè)氨基酸左右,不宜太長(zhǎng)或太短,它應(yīng)具有柔軟性,側(cè)鏈少,抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是(GGGGS)3。

Fv由VH與VL構(gòu)成,由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合,故Fv不穩(wěn)122

單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時(shí),可用定點(diǎn)突變法在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點(diǎn),與人工合成的連接肽編碼序列連接,組裝到表達(dá)載體中;如果從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體,可用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因,再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;123

單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌,有2種方式:一是表達(dá)為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高,可達(dá)細(xì)菌蛋白總量的5%-20%,但需進(jìn)行變性復(fù)性,使其形成正確的立體結(jié)構(gòu),恢復(fù)抗體活性;二是分泌型表達(dá),將細(xì)菌的信號(hào)肽序列與單鏈抗體的氨基端相連,單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細(xì)菌體外,進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者,一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下每升細(xì)菌的產(chǎn)量?jī)H在數(shù)毫克左右。單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌,有2種方式:124即為VH,約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低,但仍保持著原單抗的特異性。(3)單域抗體VH即為VH,

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論