分子熒光分析法課件

第五章分子熒光分析法第一節(jié)基本原理第二節(jié)儀器第三節(jié)定性定量分析第四節(jié)熒光新技術(shù)和應(yīng)用實例第五章分子熒光分析法第一節(jié)基本原理1第一節(jié)基本原理一、分子熒光的發(fā)生過程分子的激發(fā)態(tài)熒光的產(chǎn)生激發(fā)光譜和熒光光譜激發(fā)光譜和熒光光譜的關(guān)系二、分子結(jié)構(gòu)與熒光關(guān)系熒光效率分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系影響熒光強度的外界因素?zé)晒鈴姸扰c熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系第一節(jié)基本原理一、分子熒光的發(fā)生過程2第五章分子熒光分析法

第五章分子熒光分析法(MolecularFluorescencespectrophotometry)

概述1.熒光：當(dāng)分子吸收一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài)。由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)各振動能級，以光的形式放出能量，產(chǎn)生熒光。2.熒光分析法：通過測定所發(fā)射熒光的特性和強度，對物質(zhì)定性、定量分析的方法。3.熒光分析法的優(yōu)點：靈敏度高，最低檢測濃度可達

10-7～10-9g/ml，選擇性好，需樣量少，方法簡便。第五章分子熒光分析法第五章分子熒光分析法3第五章分子熒光分析法

第一節(jié)基本原理一、分子熒光的發(fā)生過程1.分子的激發(fā)態(tài)

（1）去活化過程：當(dāng)分子吸收一定能量后，處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，其電子以輻射躍遷或無輻射躍遷釋放出多余的能量回到基態(tài)，這個過程為分子去活化過程。（2）單線態(tài)：分子受輻射激發(fā)時，電子從最高占有軌道躍遷到較高空軌道，受激電子自旋仍保持方向相反，稱激發(fā)單線態(tài)。（3）三線態(tài)：受激電子自旋方向反轉(zhuǎn)，電子自旋為平行時是激發(fā)三線態(tài)。第五章分子熒光分析法第一節(jié)基本原理42．熒光的產(chǎn)生：分子躍遷到較高能級后，以無輻射躍遷的形式下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，以光的形式放出所吸收的能量，由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)各振動能級，這種光稱為熒光。3．激發(fā)光譜和熒光光譜：是定性和定量分析的基礎(chǔ)（1）激發(fā)光譜：固定入熒以λ激為橫坐標(biāo)，E熒縱坐標(biāo)作圖E熒-λ激（2）熒光光譜：固定入激以λ熒為橫坐標(biāo)，E熒縱坐標(biāo)作圖E熒-λ熒第五章分子熒光分析法

第五章分子熒光分析法54．激發(fā)光譜和熒光光譜的關(guān)系：（1）熒光發(fā)射光譜不隨激發(fā)波長而改變。只強度改變。因此熒光光譜只有一個譜帶。（2）激發(fā)光譜和熒光光譜呈現(xiàn)鏡像對稱關(guān)系。第五章分子熒光分析法

第五章分子熒光分析法6二、分子結(jié)構(gòu)與熒光關(guān)系1.熒光效率

能發(fā)射熒光物質(zhì)條件：①物質(zhì)分子在紫外-可見光區(qū)有較強吸收的特定結(jié)構(gòu)。②分子必須有較高的熒光效率。③Фf=發(fā)射熒光的量子數(shù)/吸收激發(fā)光的量子數(shù)第五章分子熒光分析法

二、分子結(jié)構(gòu)與熒光關(guān)系第五章分子熒光分析法72.分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（1）共軛雙鍵結(jié)構(gòu)：芳環(huán)雜環(huán)化合物，含共軛雙鍵脂肪烴π-π激（2）分子的剛性平面：效應(yīng)增加，可使熒光效率增大。（3）取代基效應(yīng)：

①給電子基：熒光效率提高。

②吸電子基：熒光減弱熄滅。③對π電子共軛體系作用小，對F無影響。第五章分子熒光分析法

第五章分子熒光分析法83.影響熒光強度的外界因素（1）溫度：溫度升高，碰撞增多，熒光效率降低。（2）溶劑：不同溶劑中熒光光譜和熒光強度會有顯著變化。溶劑極性增加，熒光強度增大。雜質(zhì)可使熒光增強或減少。（3）pH值：熒光物質(zhì)為弱酸或弱堿，不同pH值，平衡改變，使分子型體和離子型體的濃度及比例不同，熒光強度有差異。（4）散射光：因碰撞使運動方向改變而向不同角度散射的光為散射光。瑞利散射光只方向改變而波長不變的散射光。萊曼散射光是方向和量都改變的散射光。第五章分子熒光分析法

3.影響熒光強度的外界因素第五章分子熒光分析法9（5）熒光熄滅的影響熒光熄滅：熒光物質(zhì)，溶劑，溶質(zhì)分子間相互作用使熒光強度降低或與濃度不呈線性關(guān)系的現(xiàn)象為熒光熄滅。1）熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)。2）熒光熄滅產(chǎn)生原因：①熒光物質(zhì)與熄滅劑碰撞，能量損失。②兩者作用生成不發(fā)光的配合物。③向熒光物質(zhì)中加入溴或碘后易發(fā)生無輻射去活化過程。④熒光物質(zhì)超過1g/L時，發(fā)生自吸收或聚合。⑤有溶解氧存在已發(fā)生氧化或促進無輻射去活化過程。第五章分子熒光分析法

（5）熒光熄滅的影響第五章分子熒光分析法104．熒光強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系（1）熒光方向：熒光可在各方向觀察到，因激發(fā)光可部分透過溶液，為減小干擾，在與透射垂直方向觀測。（2）選兩個不同波長光：λ激、λ熒（3）定量關(guān)系：

F=K’C(abc≤0.05)定量分析基礎(chǔ)第五章分子熒光分析法

第五章分子熒光分析法11第二節(jié)儀器一、儀器的主要部件構(gòu)造：激發(fā)光源——單色器——樣品池——單色器——檢測器等四部分1.激發(fā)光源：能發(fā)出強度較大，連續(xù)穩(wěn)定的光源。

主要有：溴鎢燈、氫燈、高壓汞燈、氙弧燈2.分光系統(tǒng)：第一單色器（激發(fā)單色器）：位于光源與液槽間，濾去非選擇波長的激發(fā)光。第二單色器（發(fā)射單色器）：位于液槽與檢測器之間，濾去反色光，散色光和雜質(zhì)產(chǎn)生的熒光。第五章分子熒光分析法

第二節(jié)儀器第五章分子熒光分析法123.樣品池：石英材質(zhì)，四面透光。玻璃吸收323nm以下紫外光。4.檢測器：熒光弱，檢測器靈敏度要高。光二極管陣列檢測器。二、儀器的類型1.光電熒光計：濾光片熒光計。溴鎢燈，濾光片，光電管。2.熒光分光光度計：氙燈，光柵，狹縫，光電倍增管。第五章分子熒光分析法

3.樣品池：石英材質(zhì)，四面透光。玻璃吸收323nm第五章分13第三節(jié)定性定量分析一、定性分析由兩個特征光譜（熒光光譜，激發(fā)光譜）定性，可靠性強。但一定有標(biāo)準(zhǔn)品作對照。二、定量分析方法

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

2、直接比較法，空白熒光為F0時，

Cs/Cx=(Fs-F0)/(Fx-F0)第五章分子熒光分析法

第三節(jié)定性定量分析第五章分子熒光分析法14第四節(jié)光新技術(shù)和應(yīng)用實例一、新技術(shù)1.激光熒光分析：用波長更長，強度更大的激光作光源，提高熒光法的靈敏度和專一性?？蓞f(xié)調(diào)激光器作光源，熒光單色器省略。2.同步熒光分析：激發(fā)光譜和熒光光譜中選擇一適宜的波長差值。3.時間分辨熒光分析：二、應(yīng)用1、無機物的熒光分析：8羥基喹啉及其衍生物，黃酮類試劑，二氨基化合物2、有機物的熒光分析：油脂苯并芘測定，尿中N-甲基尼克酰胺。3、核酸分子熒光探針第五章分子熒光分析法

第四節(jié)光新技術(shù)和應(yīng)用實例第五章分子熒光分析法15第五章分子熒光分析法第一節(jié)基本原理第二節(jié)儀器第三節(jié)定性定量分析第四節(jié)熒光新技術(shù)和應(yīng)用實例第五章分子熒光分析法第一節(jié)基本原理16第一節(jié)基本原理一、分子熒光的發(fā)生過程分子的激發(fā)態(tài)熒光的產(chǎn)生激發(fā)光譜和熒光光譜激發(fā)光譜和熒光光譜的關(guān)系二、分子結(jié)構(gòu)與熒光關(guān)系熒光效率分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系影響熒光強度的外界因素?zé)晒鈴姸扰c熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系第一節(jié)基本原理一、分子熒光的發(fā)生過程17第五章分子熒光分析法

第五章分子熒光分析法(MolecularFluorescencespectrophotometry)

概述1.熒光：當(dāng)分子吸收一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài)。由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)各振動能級，以光的形式放出能量，產(chǎn)生熒光。2.熒光分析法：通過測定所發(fā)射熒光的特性和強度，對物質(zhì)定性、定量分析的方法。3.熒光分析法的優(yōu)點：靈敏度高，最低檢測濃度可達

10-7～10-9g/ml，選擇性好，需樣量少，方法簡便。第五章分子熒光分析法第五章分子熒光分析法18第五章分子熒光分析法

第一節(jié)基本原理一、分子熒光的發(fā)生過程1.分子的激發(fā)態(tài)

（1）去活化過程：當(dāng)分子吸收一定能量后，處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，其電子以輻射躍遷或無輻射躍遷釋放出多余的能量回到基態(tài)，這個過程為分子去活化過程。（2）單線態(tài)：分子受輻射激發(fā)時，電子從最高占有軌道躍遷到較高空軌道，受激電子自旋仍保持方向相反，稱激發(fā)單線態(tài)。（3）三線態(tài)：受激電子自旋方向反轉(zhuǎn)，電子自旋為平行時是激發(fā)三線態(tài)。第五章分子熒光分析法第一節(jié)基本原理192．熒光的產(chǎn)生：分子躍遷到較高能級后，以無輻射躍遷的形式下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，以光的形式放出所吸收的能量，由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)各振動能級，這種光稱為熒光。3．激發(fā)光譜和熒光光譜：是定性和定量分析的基礎(chǔ)（1）激發(fā)光譜：固定入熒以λ激為橫坐標(biāo)，E熒縱坐標(biāo)作圖E熒-λ激（2）熒光光譜：固定入激以λ熒為橫坐標(biāo)，E熒縱坐標(biāo)作圖E熒-λ熒第五章分子熒光分析法

第五章分子熒光分析法204．激發(fā)光譜和熒光光譜的關(guān)系：（1）熒光發(fā)射光譜不隨激發(fā)波長而改變。只強度改變。因此熒光光譜只有一個譜帶。（2）激發(fā)光譜和熒光光譜呈現(xiàn)鏡像對稱關(guān)系。第五章分子熒光分析法

第五章分子熒光分析法21二、分子結(jié)構(gòu)與熒光關(guān)系1.熒光效率

能發(fā)射熒光物質(zhì)條件：①物質(zhì)分子在紫外-可見光區(qū)有較強吸收的特定結(jié)構(gòu)。②分子必須有較高的熒光效率。③Фf=發(fā)射熒光的量子數(shù)/吸收激發(fā)光的量子數(shù)第五章分子熒光分析法

二、分子結(jié)構(gòu)與熒光關(guān)系第五章分子熒光分析法222.分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（1）共軛雙鍵結(jié)構(gòu)：芳環(huán)雜環(huán)化合物，含共軛雙鍵脂肪烴π-π激（2）分子的剛性平面：效應(yīng)增加，可使熒光效率增大。（3）取代基效應(yīng)：

①給電子基：熒光效率提高。

②吸電子基：熒光減弱熄滅。③對π電子共軛體系作用小，對F無影響。第五章分子熒光分析法

第五章分子熒光分析法233.影響熒光強度的外界因素（1）溫度：溫度升高，碰撞增多，熒光效率降低。（2）溶劑：不同溶劑中熒光光譜和熒光強度會有顯著變化。溶劑極性增加，熒光強度增大。雜質(zhì)可使熒光增強或減少。（3）pH值：熒光物質(zhì)為弱酸或弱堿，不同pH值，平衡改變，使分子型體和離子型體的濃度及比例不同，熒光強度有差異。（4）散射光：因碰撞使運動方向改變而向不同角度散射的光為散射光。瑞利散射光只方向改變而波長不變的散射光。萊曼散射光是方向和量都改變的散射光。第五章分子熒光分析法

3.影響熒光強度的外界因素第五章分子熒光分析法24（5）熒光熄滅的影響熒光熄滅：熒光物質(zhì)，溶劑，溶質(zhì)分子間相互作用使熒光強度降低或與濃度不呈線性關(guān)系的現(xiàn)象為熒光熄滅。1）熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)。2）熒光熄滅產(chǎn)生原因：①熒光物質(zhì)與熄滅劑碰撞，能量損失。②兩者作用生成不發(fā)光的配合物。③向熒光物質(zhì)中加入溴或碘后易發(fā)生無輻射去活化過程。④熒光物質(zhì)超過1g/L時，發(fā)生自吸收或聚合。⑤有溶解氧存在已發(fā)生氧化或促進無輻射去活化過程。第五章分子熒光分析法

（5）熒光熄滅的影響第五章分子熒光分析法254．熒光強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系（1）熒光方向：熒光可在各方向觀察到，因激發(fā)光可部分透過溶液，為減小干擾，在與透射垂直方向觀測。（2）選兩個不同波長光：λ激、λ熒（3）定量關(guān)系：

F=K’C(abc≤0.05)定量分析基礎(chǔ)第五章分子熒光分析法

第五章分子熒光分析法26第二節(jié)儀器一、儀器的主要部件構(gòu)造：激發(fā)光源——單色器——樣品池——單色器——檢測器等四部分1.激發(fā)光源：能發(fā)出強度較大，連續(xù)穩(wěn)定的光源。

主要有：溴鎢燈、氫燈、高壓汞燈、氙弧燈2.分光系統(tǒng)：第一單色器（激發(fā)單色器）：位于光源與液槽間，濾去非選擇波長的激發(fā)光。第二單色器（發(fā)射單色器）：位于液槽與檢測器之間，濾去反色光，散色光和雜質(zhì)產(chǎn)生的熒光。第五章分子熒光分析法

第二節(jié)儀器第五章分子熒光分析法273.樣品池：石英材質(zhì)，四面透光。玻璃吸收323nm以下紫外光。4.檢測器：熒光弱，檢測器靈敏度要高。光二極管陣列檢測器。二、儀器的類型1.光電熒光計：濾光片熒光計。溴鎢