PCR設計引物時酶切位點的保護

PCRS計引物時酶切位點的保護1酶寡核甘酸序列切割率%2hr20hrGGTCGACC00AccICGGTCGACCG00CCGGTCGACCGG00CACATGTG00AflIIICCACATGTGG>90>90CCCACATGTGGG>90>90GGCGCGCC>90>90AscIAGGCGCGCCT>90>90TTGGCGCGCCAA>90>90CCCCGGGG50>90AvaICCCCCGGGGG>90>90TCCCCCGGGGGA>90>90CGGATCCG1025BamHICGGGATCCCG>90>90CGCGGATCCGCG>90>90CAGATCTG00BglIIGAAGATCTTC75>90GGAAGATCTTCC25>90GGCGCGCC00BssHIIAGGCGCGCCT00TTGGCGCGCCAA50>90BstEIIGGGT(A/T)ACCC010AACTGCAGAACCAATGCATTGG00BstXIAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA2550CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT25>90CATCGATG00ClaIGATCGATC00CCATCGATGG>90>90CCCATCGATGGG5050GGAATTCC>90>90EcoRICGGAATTCCG>90>90CCGGAATTCCGG>90>90GGGGCCCC>90>90HaeIIIAGCGGCCGCT>90>90TTGCGGCCGCAA>90>90

酶寡核甘酸序列切割率%2hr20hrCAAGCTTG00HindIIICCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG1075GGGTACCC00KpnIGGGGTACCCC>90>90CGGGGTACCCCG>90>90MluIGACGCGTC00CGACGCGTCG2550NcoICCCATGGG00CATGCCATGGCATG5075CCATATGG00CCCATATGGG00NdeICGCCATATGGCG00GGGIIICAIAIGAAACCC00GGAATTCCAIAIGGAAIICC75>90GGGAAIICCAIAIGGAAIICCC75>90GGCIAGCC00NheICGGCIAGCCG1025CIAGCIAGCIAG1050IIGCGGCCGCAA00AIIIGCGGCCGCIIIA1010NotIAAAIAIGCGGCCGCIAIAAA1010AIAAGAAIGCGGCCGCIAAACIAI2590AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA25>90NsiIIGCAIGCAIGCA10>90CCAAIGCAIIGGIICIGCAGII>90>90IIAAIIAA00PacIGIIAAIIAAC025CCIIAAIIAAGG0>9000GIIIAAACPmeIGGIIIAAACC025GGGIIIAAACCC050AGCIIIGIIIAAACGGCGCGCCGG75>90

酶寡核甘酸序列切割率%2hr20hrGCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010PstIAACTGCAGAACCAATGCATTGG>90>90AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA>90>90CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT00CCGATCGG00PvuIATCGATCGAT1025TCGCGATCGCGA010SacICGAGCTCG1010SacIIGCCGCGGC00TCCCCGCGGGGA50>90GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC00GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGSalIACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCG1050GAA1075ScaIGAGTACTC1025AAAAGTACTIII75751CCCGGG010SmaICCCCGGGCCCCCGGGGGG0101050TCCCCCGGGGGA>90>90GACTAGTC10>90SpeIGGACTAGTCC10>90CGGACTAGTCCG050CTAGACTAGTCTAG050GGCATGCC00SphICATGCATGCATG025ACATGCATGCATGT1050AAGGCCTT>90>90StuIGAAGGCCTTC>90>90AAAAGGCCT\W>90>90CTCTAGAG00XbaIGCTCTAGATGCTCTAGAGCGCA>9075>90>90CTAGTCTAGACTAG75>90酶寡核甘酸序列切割率%2hr20hrCCTCGAGG00XhoICCCTCGAGGG1025CCGCTCGAGCGG1075CCCCGGGG00XmaICCCCCGGGGG2575CCCCCCGGGGGG50>90TCCCCCCGGGGGGA>90>90注釋：.如果要加在序列的5'端,就在酶切位點識別堿基序列（紅色）的5'端加上相應的堿基（黑色），相同如果要在3'端加保護堿基，就在酶切位點識別堿基序列（紅色）的3'端加上相應的堿基（黑色）。.切割率：正確識別并酶切的效率3。加保護堿基時最好選用切割率高時加的相應堿基。為什么要添加保護堿基？在分子克隆實驗中，有時我們會在待擴增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點，用于后續(xù)的酶切和連接反應。由于直接暴露在末端的酶切位點不容易直接被限制性核酸內切酶切開，因此在設計PCFgl物時，人為的在酶切位點序列的5'端外側添加額外的堿基序列，即保護堿基，用來提高將來酶切時的活性。其次，在分子克隆實驗中選擇載體的酶切位點時，相臨的兩個酶切位點往往不能同時使用，因為一個位點切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點切割。該如何添加保護堿基？添加保護堿基時，最關心的應該是保護堿基的數(shù)目，而不是種類。什么樣的酶切位點，添加幾個保護堿基，是有數(shù)據(jù)可以參考的。添加什么保護堿基，如果嚴格點，是根據(jù)兩條引物的Tm值和各引物的堿基分布及GC含量。如果某條引物Tm值偏小，GC販低，添加時多加G或C,反之亦反,為了解不同內切酶對識別位點以外最少保護堿基數(shù)目的要求，NE琳用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核甘酸作為酶切底物進行實驗。實驗結果對于確定雙酶切順序將會有幫助（比如在多接頭上切割位點很接近時），或者當切割位點靠近DNAC端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識別位點兩端至少加上6個保護堿基，以確保酶切反應的進行。實驗方法：用丫-[32巳ATP在T4多聚核甘酸激酶的作用下標記0.1A260單位的寡核甘酸。取1?g已標記了的寡核甘酸與20單位的內切酶，在20。C條件下分別反應2小時和20小時。反應緩