基因功能分析策略ben課件

基因功能分析（AnimalGeneticEngineering）第十二章基因功能分析第十二章1主要內(nèi)容第一節(jié)轉(zhuǎn)基因第二節(jié)基因敲除第三節(jié)動物克隆技術(shù)第四節(jié)RNAi技術(shù)主要內(nèi)容第一節(jié)轉(zhuǎn)基因2第一節(jié)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenictechnology）第一節(jié)31轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因超級鼠1982年，英國的《自然》雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實(shí)驗(yàn)小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將大鼠生長激素重組基因?qū)氲叫∈笫芫阎?培育出具快速生長效應(yīng)的“轉(zhuǎn)基因超級鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快2～3倍，體積大一倍。1轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因動物4概念轉(zhuǎn)基因：1）將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是指利用分子生物學(xué)技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其它物種中，改造生物的遺傳物質(zhì)，使遺傳物質(zhì)得到改造的生物在性狀、營養(yǎng)和消費(fèi)品質(zhì)等方面向人類需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)基因動物：所謂轉(zhuǎn)基因動物就是指以實(shí)驗(yàn)方法將外源基因?qū)雱游锶旧w基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。概念5ProducingtransgenicanimalsDirecttransfectionorretroviralinfectionofembryonicstemcellsfollowedbyintroductionofthesecellsintoanembryoattheblastocyststageofdevelopmentRetrovialinfectionofearlyembryoDirectmicroinjectionofDNAintooocytes,zygotesorearlyembryocellsSperm-mediatedtransferTransferintounfertilisedovaPhysicaltechniquessuchasbiolisticsorelectrofusionNucleartransferProducingtransgenicanimalsDi6基因功能分析策略ben課件7轉(zhuǎn)基因動物由于“外源DNA〞導(dǎo)入而產(chǎn)生了可以遺傳的改變。這些可遺傳的改變包括：外源DNA片段至少整合到一條染色體的一個位點(diǎn)上；外源DNA的插入使基因組中任何一個基因的構(gòu)造發(fā)生改變；外源DNA的插入使染色體發(fā)生重排；導(dǎo)入可以持久存在的遺傳實(shí)體，例如，一條人工染色體或者可以自我復(fù)制并傳遞給子細(xì)胞的非染色體元件。轉(zhuǎn)基因動物由于“外源DNA〞導(dǎo)入而產(chǎn)生了可以遺傳的改變。這些8IntroducingClonedGenesintoCulturedMammalianCellsIntroductionofmethodsIntroducingClonedGenesinto9DNATransfectionMediatedbyLipofectionCalcium-phosphate-mediatedTransfectionofEukaryoticCellswithPlasmidDNAsCalcium-phosphate-mediatedTransfectionofCellswithHigh-molecularweightGenomicDNATransfectionMediatedbyDEAE-Dextran:High-efficiencyMethodDNATransfectionUsingPolybreneDNATransfectionbyElectroporationDNATransfectionMediatedbyL10轉(zhuǎn)基因的方法

1、顯微注射法：將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。

2、體細(xì)胞核移植方法：先在體外培養(yǎng)的體細(xì)胞中進(jìn)行基因?qū)氩⒑Y選。然后將帶轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞移植到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，生產(chǎn)重構(gòu)胚胎。轉(zhuǎn)基因的方法

11Microinjection用顯微注射針將外源基因直接注入實(shí)驗(yàn)動物受精卵的原核，使外源基因基因整合入動物基因組中，從而得到轉(zhuǎn)基因動物。是目前常用的轉(zhuǎn)基因方法。導(dǎo)入基因的速度快，操作簡單，對DNA大小無限制。Microinjection用顯微注射針將外源基因直接注入實(shí)12基因功能分析策略ben課件13基因功能分析策略ben課件14基因功能分析策略ben課件15PronuclearmicroinjectionPronuclearmicroinjection16基因功能分析策略ben課件17基因功能分析策略ben課件183．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：最早用來得到轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，利用逆轉(zhuǎn)錄載體將遺傳信息以RNA分子的形式，在逆轉(zhuǎn)錄整合酶和逆轉(zhuǎn)錄基因組末端的特異性核酸序列的作用下，反轉(zhuǎn)錄并整合到宿主基因組中去，最終得到轉(zhuǎn)基因小鼠。4．胚胎干細(xì)胞法：將轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞注射入受體囊胚腔，可參與嵌合體的形成，將來出生的動物的生殖系統(tǒng)就有可能整合上外源基因，通過雜交繁育得到純合目的基因的個體，即為轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因的方法3．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：最早用來得到轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，利用逆轉(zhuǎn)19轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景

1、研究基因的結(jié)構(gòu)與功能，了解動物生命現(xiàn)象的內(nèi)在本質(zhì)。2、建立多種疾病的動物模型，研究發(fā)病機(jī)理及治療方法。3、改善動物生產(chǎn)性能，提高動物育種效率。4、作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器?？梢酝ㄟ^家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價的人體藥用蛋白。轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景20四個主要國家轉(zhuǎn)基因作物種植面積占全球９９％。美國占６６％，達(dá)３９００萬公頃，轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)量也居世界第一，美國種植的７５％的大豆、３４％的棉花和７１％的玉米都是轉(zhuǎn)基因作物。阿根廷占２３％，達(dá)１３５０萬公頃。加拿大占６％，達(dá)３５０萬公頃。中國第四位，占４％，達(dá)２１０萬公頃。歐盟國家總面積不到２０萬公頃，０.３％左右。

四個轉(zhuǎn)基因作物種植大國2002年數(shù)據(jù)四個主要國家轉(zhuǎn)基因作物種植面積占全球９９％。四個轉(zhuǎn)基因作物種21基因功能分析策略ben課件22

各國GMO作物栽培面積的變遷

(藍(lán)色者為全球統(tǒng)計)百萬公頃各國GMO作物栽培面積的變遷

(藍(lán)色者為全球統(tǒng)計)百23ResearchonTransgenicCorn

轉(zhuǎn)基因玉米研究改進(jìn)玉米的質(zhì)量 保爾斯科特博士，美國農(nóng)科院和州立大學(xué)農(nóng)學(xué)系教授在玉米上生產(chǎn)動物疫苗 植物科學(xué)研究所生物藥用研究所植物轉(zhuǎn)化主任王侃博士基因限界,花粉散布的模擬 農(nóng)學(xué)系教授馬克.維斯蓋特博士非限制花粉流動〔漂移〕造成的經(jīng)濟(jì)損失 商學(xué)院教授德莫特海斯博士遺傳修飾農(nóng)業(yè)產(chǎn)品生物平安研究所種子科學(xué)中心主任滿基特密斯瑞博士Improvingmaizequalitytraits: Dr.PaulScott,USDA-ARSandDepartmentofAgronomyAnimalvaccinesincorn:

PlantSciencesInstituteBiopharmaceuticalInitiative:

Dr.KanWang,DirectorPlantTransformationFacilityGeneConfinement: ModelingPollenDispersal,Dr.MarkWestgate,DepartmentofAgronomyEconomicCostofUncontrolledPollenFlow: Dr.DermotHayes,PioneerChairofAgribusinessBIGMAP: BiosafetyInstituteforGeneticallyModifiedAgriculturalProducts,Dr.ManjitMisra,DirectorSeedScienceCenterResearchonTransgenicCorn

轉(zhuǎn)基24Dr.Scott’slabisusingacombinationofbiochemistry,molecularbiologyandtraditionalplantbreedingtoaddvaluetocorn斯科特博士的實(shí)驗(yàn)室綜和利用生物化學(xué)，分子生物學(xué)和傳統(tǒng)植物育種方法為玉米增加價值。Maizequalitytraits

玉米質(zhì)量性狀Dr.Scott’slabisusingacomb25Sow’smilkcontainsalphalactalbuminAlphalactalbuminproteinisanidealcornfeedadditiveDr.ScottevelopedtransgeniccorntoproducethisproteinintheseedLinesarebeingdevelopedforfeedingtrials

母豬的牛奶含ａ-乳清白蛋白ａ-乳清白蛋白是理想的玉米飼料添加劑斯科特博士的轉(zhuǎn)基因玉米在種子中生產(chǎn)該蛋白含該基因的品系目前在飼喂試驗(yàn)中alphalactalbuminImprovingswinenutrition

改良豬肉營養(yǎng)Sow’smilkcontainsalphalact26Animalvaccinesincorn

玉米中的動物疫苗王博士的研究小組研究轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)生有活性功能的抗大腸桿菌毒素的疫苗抗體該研究是州立大學(xué)植物研究所工程之一喂養(yǎng)老鼠含抗體的玉米使老鼠不受抗大腸桿菌葡萄球菌毒素和霍亂弧菌毒素危害Dr.Wang’sgroupdevelopedtransgeniccornplantsthatproduceafullyfunctionalvaccineantigenagainstanE.colitoxin.PartofthePlantScienceInstituteBio-pharmaceuticalInitiativeFeedingantigen-containingcorntomiceprotectedthemagainstE.colienterotoxinandcholeratoxinE.coliAnimalvaccinesincorn

玉米中的動物27Scientificissues: Proofofconcept,GeneticstabilityRegulatoryrequirements:Productcomparability,puritySafetyconcerns:Environmentalimpact,Productprotection,GeneflowCommercialization:EconomicandLegalissues科學(xué)領(lǐng)域:證明概念,保證遺傳穩(wěn)定性管理要求:產(chǎn)品的可比性,純度平安性考慮:環(huán)境效應(yīng),產(chǎn)品保護(hù)和基因漂移商品化:經(jīng)濟(jì)和法律問題StewardshipofPlant-MadePharmaceuticalsandIndustrials

為植物產(chǎn)藥用工業(yè)效勞

Scientificissues:科學(xué)領(lǐng)域28基因功能分析策略ben課件29目前世界上已經(jīng)上市並商品化的轉(zhuǎn)基因植物有：黃豆、玉米、棉花、木瓜、甜菜、油菜、水稻、小麥、馬鈴薯、鳳梨等。由外觀無法判斷木瓜是否基因改造目前世界上已經(jīng)上市並商品化的轉(zhuǎn)基因植物有：黃豆、玉米、棉花、30世界上第一種基因移植作物是一種含有抗生素藥類抗體的煙草，1983年得以培植出來。世界上第一種基因移植作物是一種含有抗生素藥類抗體的煙草，1931轉(zhuǎn)基因番茄

1994年，美國政府批準(zhǔn)了他們研制成功抗干旱、早熟、保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品化之后，我國也相繼成功培育出優(yōu)良品種的轉(zhuǎn)基因番茄，以滿足人們的需求。

轉(zhuǎn)基因番茄

32基因功能分析策略ben課件33轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄34轉(zhuǎn)基因甜椒

甜椒在栽培的過程中，容易受病毒的感染。我國科學(xué)工作者，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出抗病毒的甜椒。轉(zhuǎn)基因甜椒甜椒在栽培的過程中，容易受病毒的感染。我35轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒36轉(zhuǎn)基因油菜

油菜是人們食用油的主要來源之一。一般油菜籽的含油量約為40％左右。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出來的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的純度質(zhì)量更好。轉(zhuǎn)基因油菜37

玉米是主要糧食之一，又可以提煉油脂，也可以用作食品和工業(yè)的原料以及作飼料，渾身是寶。人們稱它是含金的植物。如今培育出轉(zhuǎn)基因玉米，品質(zhì)更好，產(chǎn)量更高。轉(zhuǎn)基因玉米

抗蟲害的玉米

玉米是主要糧食之一，又可以提煉油脂，也可以用作食品38轉(zhuǎn)基因小麥

從植物體中分離出合成賴氨酸的基因，把這基因轉(zhuǎn)入小麥植株中，培育出轉(zhuǎn)基因小麥。用這種轉(zhuǎn)基因小麥制造出來的面粉，更適合用來烤面包，而且面粉中賴氨酸含量高，這種面包的營養(yǎng)價值高。

轉(zhuǎn)基因小麥39基因改造蘭花臺灣的蘭花經(jīng)基因重組技術(shù)而延長開花時間?；蚋脑焯m花臺灣的蘭花經(jīng)基因重組技術(shù)而延長開花時間。40利用基因重組技術(shù)培育新顏色的海芋，引起爭議較小。利用基因重組技術(shù)培育新顏色的海芋，引起爭議較小。41轉(zhuǎn)基因牽?；?/p>

我國科學(xué)工作者，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以轉(zhuǎn)變矮牽牛花的花色，使矮牽牛花的花色更加豐富多彩。轉(zhuǎn)基因牽?；?/p>

我國科學(xué)工作者，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以轉(zhuǎn)變矮牽牛42基因功能分析策略ben課件43基因功能分析策略ben課件44存在問題

1、食品安全問題：1）未知的可能副作用？2）外源基因在人體內(nèi)表達(dá)？2、技術(shù)問題：1）成本；2）成功率；3）基因組的有效整合、穩(wěn)定遺傳；存在問題45什么是生物反應(yīng)器？生物反應(yīng)器是指利用轉(zhuǎn)基因活體動物的某種能夠高效表達(dá)外源蛋白的器官或組織來進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)活性功能蛋白的技術(shù)，這些蛋白一般是藥用蛋白或營養(yǎng)保健蛋白。什么是生物反應(yīng)器？46用于表達(dá)的生物反應(yīng)器包括動物血液、泌尿系統(tǒng)、精囊腺、乳腺等，還包括禽蛋和昆蟲（例如家蠶）個體等。其中動物乳腺生物反應(yīng)器是目前國際上唯一證明可以達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)水平的生物反應(yīng)器。據(jù)預(yù)測，2010年世界上動物乳腺生物反應(yīng)器的年產(chǎn)值將達(dá)到500億美元以上。生物反應(yīng)器的種類及應(yīng)用用于表達(dá)的生物反應(yīng)器包括動物血液、泌尿系統(tǒng)、精囊腺、乳腺等，47第二節(jié)

基因敲除(GeneKnockout)第二節(jié)48什么是基因敲除技術(shù)？基因敲除（geneknockout）是80年代初出現(xiàn)的一項(xiàng)新的基因工程技術(shù)。采用同源重組的方法,用體外合成的無效基因或突變基因取代相應(yīng)正常基因,再應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法孵育出轉(zhuǎn)基因動物,即為基因敲除動物。什么是基因敲除技術(shù)？49基因打靶基因打靶(genetargeting)通過DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究該基因的功能?；虼虬械奶卣鳎褐苯有浴?zhǔn)確性。有效性基因敲除(geneknockout)：定向敲除某個基因的方法?；蚯萌?geneknockin)：定向?qū)⒁欢位蛐蛄刑娲硪欢位蛐蛄械姆椒ā；虼虬谢虼虬?genetargeting)50基因打靶的必備條件胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)取自胚胎早期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。ES細(xì)胞能在體外培養(yǎng)，并保存發(fā)育的全能性。打靶載體Neo〔新霉素〕陽性篩選標(biāo)志HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)基因打靶的必備條件胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)51基因打靶策略完全基因剔除基于Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)的條件基因打靶用基因打靶技術(shù)引入精細(xì)突變大片段染色體的重排和刪除隨機(jī)基因刪除ENU誘導(dǎo)點(diǎn)突變與大規(guī)?；蛲蛔兒凸δ苎芯坷没蚯萌爰夹g(shù)制備轉(zhuǎn)基因動物基因打靶策略完全基因剔除52基因敲除的根本程序打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種基因敲除的根本程序打靶載體的構(gòu)建53基因功能分析策略ben課件54示例示例55基因功能分析策略ben課件56基因敲除技術(shù)的應(yīng)用1、研究基因調(diào)控和基因功能；2、建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供材料；3、改造動物基因型，鑒定新基因和/或其新功能，研究發(fā)育生物學(xué)；4、治療遺傳病，即基因治療。5、改造生物、培育新的生物品種?；蚯贸夹g(shù)的應(yīng)用57用基因治療血友病用基因治療血友病58第三節(jié)

動物克隆技術(shù)(AnimalCloningTechnology)第三節(jié)59

CreatingDolly！1997年2月22日，英國“Nature”刊登了愛丁堡羅斯林研究所維爾穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，從此震驚了世界。

601998年4月與威爾士山羊戴維產(chǎn)下邦尼，證明了克隆動物也能生育。2003.2.14日蘇格蘭向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫實(shí)施了安樂死。由于早衰問題，人們懷疑“多莉是穿著羔羊服裝的老羊”。多莉的生命歷程1998年4月與威爾士山羊戴維產(chǎn)下邦尼，證明了克隆動物也能生61羅斯林研究所科學(xué)家取一頭普通白綿羊的乳腺細(xì)胞，將細(xì)胞核移植到一個剔除了細(xì)胞核的卵子中，使之融合、分裂、發(fā)育成胚胎，然后移植到第三頭羊的體內(nèi)?？茖W(xué)家共培育277個胚胎，只有多莉成功出生。1996年7月5日，多莉降臨人世。直到1997年2月23日才公布于眾。羅斯林研究所科學(xué)家取一頭普通白綿羊的乳腺細(xì)胞，將細(xì)胞核移植到62克隆豬Culturedpigembryosfollowingthenucleartransfercloningprocedure.克隆豬Culturedpig63ANDi–第一只轉(zhuǎn)基因靈長類TransgenicbutnotfluorescentCarriesandexpressestheGFPtransgeneFluorescenceisnotdetectedShowsgenemodificationinprimatesispossibleANDi–第一只轉(zhuǎn)基因靈長類Transgenicbut64克隆靈長類〔CloningPrimates〕ClonedandaloneNeti(nuclearembryotransferindividual)Dittoarestilltheonlyclonedprimates,despiteyearsofeffortbyseveralgroups.克隆靈長類〔CloningPrimates〕Cloned65能發(fā)熒光的熱帶斑馬魚普通熱帶斑馬魚是不發(fā)熒光的能發(fā)熒光的熱帶斑馬魚普通熱帶斑馬魚是不發(fā)熒光的66生長快、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國)乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)生長快、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國)乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因67中科院水生生物研究所培育的轉(zhuǎn)基因鯉魚，表現(xiàn)出快速生長效應(yīng)。中科院水生生物研究所培育的轉(zhuǎn)基因鯉魚，表現(xiàn)出快速生長效應(yīng)。68我國培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因兔，轉(zhuǎn)入的乙型肝炎表面抗原基因已在基因兔體內(nèi)整合并表達(dá)。兔研人員將乙型肝炎表面抗原基因注入兔受精卵的情形。我國培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因兔，轉(zhuǎn)入的乙型肝炎表面抗原基因已在基69美國通過基因工程將人的基因植入牛的體內(nèi)，由轉(zhuǎn)基因公牛授精的母牛產(chǎn)下5頭健壯的牛犢，每頭都含有一個人類的基因。美國通過基因工程將人的基因植入牛的體內(nèi)，由轉(zhuǎn)基因公牛70轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物71不同轉(zhuǎn)基因動物研究水平綠色=常規(guī)黃色=開展中紅色=還不可行不同轉(zhuǎn)基因動物研究水平綠色=常規(guī)72什么叫克隆？細(xì)胞核移植得到的個體都叫做克隆。

核移植是指利用顯微外科手術(shù)的方法將胚胎細(xì)胞或成體細(xì)胞的細(xì)胞核移人去核的卵母細(xì)胞中，構(gòu)建成重組胚，通過體內(nèi)或體外培養(yǎng)、胚胎移植，產(chǎn)生與供體細(xì)胞基因型相同的后代的技術(shù)過程，又稱為動物克隆技術(shù)。根據(jù)核供體的來源不同，可將其分為胚胎細(xì)胞克隆動物和體細(xì)胞克隆動物技術(shù)。

通常所說的動物克隆指體細(xì)胞克隆，即動物的無性繁殖。什么叫克??？73動物克隆的意義1、體細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的相互轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞體細(xì)胞動物克隆的意義1、體細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的相互轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞體細(xì)74動物克隆的意義2、對傳統(tǒng)動物繁殖模式的挑戰(zhàn)；（AI、Clone）3、對社會倫理的挑戰(zhàn)；4、保存物種、延續(xù)生命、提高人口素質(zhì)？動物克隆的意義2、對傳統(tǒng)動物繁殖模式的挑戰(zhàn)；4、保存物種、延75第四節(jié)

siRNA技術(shù)(siRNATechnology)第四節(jié)76什么是RNAi？RNAi〔RNAinterference〕是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，dsRNA引起同源mRNA的特異性降解，因而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過程。一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默生物體內(nèi)普遍存在抵御外在感染的重要保護(hù)機(jī)制什么是RNAi？RNAi〔RNAinterference〕77RNAi的開展歷程大事記1995，RNAi現(xiàn)象首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)。Cell，1995，81：611-6201998，RNAi概念的首次提出。Nature,1998,391〔6669〕：8061999，RNAi作用機(jī)制模型的提出。Cell，2000，101〔1〕：25-33在線蟲、果蠅、擬南芥及斑馬魚等多種生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象。2001，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。Nature，2001，411〔6836〕：494－498RNAi技術(shù)被?Science?評為2001年度的十大科技進(jìn)展之一。2002至今，有關(guān)RNAi的研究蓬勃開展，是分子生物學(xué)領(lǐng)域最為熱門的方向之一。RNAi的開展歷程大事記1995，RNAi現(xiàn)象首次在線蟲中發(fā)78預(yù)備知識dsRNA：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈Dicer：屬于RNaseⅢ家族，是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶siRNA：smallinterferingRNA，RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子，21-23個nt大小的雙鏈RNARISC：RNA-inducingsilencingcomplex，具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性RdRP：RNA-dependentRNApolymerases，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞預(yù)備知識dsRNA：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈79RNAi引發(fā)的基因沉默機(jī)制GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.RNAi引發(fā)的基因沉默機(jī)制GiselaStorz,Sci80RNAi的分子生物學(xué)特性RNAi是siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默RNAi作用針對的是靶基因的外顯子序列高特異性，只針對同源靶向mRNA高效性，極低濃度的siRNA就能完全抑制基因表達(dá)RNAi作用具有可傳遞性RNAi的分子生物學(xué)特性RNAi是siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平81RNAi研究的一般技術(shù)路線RNAi研究的一般技術(shù)路線82RNAi的研究方法siRNA的設(shè)計根據(jù)靶向mRNA進(jìn)展設(shè)計目前已證實(shí)的siRNA序列://ambion/techlib/tb/tb_502.html:///mmcmanus/www/siRNADB.html互聯(lián)網(wǎng)上的幫助://ambion/

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RNAi的研究方法siRNA的設(shè)計83RNAi的研究方法siRNA的制備方法體外制備---化學(xué)合成siRNA---體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA---用RNaseⅢ消化長片段dsRNA得到siRNA體內(nèi)表達(dá)---利用質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)siRNA---PCR方法制備siRNA的表達(dá)框架RNAi的研究方法siRNA的制備方法84siRNA制備方法比較合成方法特點(diǎn)適用不適用化學(xué)合成價格高已找到最有效siRNA，大量篩選體外轉(zhuǎn)錄毒性小，穩(wěn)定性好，效率高篩選大量需要，特定的，長期用RNaseⅢ消化長片段節(jié)省快速而經(jīng)濟(jì)的研究某基因缺失表型不宜長期，特定的siRNA研究及基因治療siRNA表達(dá)載體價格較高，常用特定siRNA，穩(wěn)定篩選siRNA表達(dá)框架表達(dá)穩(wěn)定，測序困難篩選長期研究siRNA制備方法比較合成方法特點(diǎn)適用不適用化學(xué)合成價格高已85應(yīng)用基因功能研究基因治療---基因缺陷---病毒感染---腫瘤疾病其它應(yīng)用---植物代謝---細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路

應(yīng)用基因功能研究86〔1〕在功能基因組中的應(yīng)用在功能基因組研究中，需要對特定基因進(jìn)展功能喪失或降低突變，以確定其功能。由于RNAi具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此RNAi可以作為一種強(qiáng)有力的研究工具，用于功能基因組的研究。將功能未知的基因的編碼區(qū)〔外顯子〕或啟動子區(qū)，以反向重復(fù)的方式由同一啟動子控制表達(dá)。這樣在轉(zhuǎn)基因個體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的RNA可形成dsRNA，產(chǎn)生RNA干預(yù)，使目的基因沉默，從而進(jìn)一步研究目的基因的功能，這種技術(shù)即為RNAi技術(shù)。根據(jù)所選用序列的不同，可將其分為編碼區(qū)RNAi和啟動子區(qū)RNAi技術(shù)?！?〕在功能基因組中的應(yīng)用在功能基因組研究中，需要對特定基87〔2〕在基因治療中的應(yīng)用治療HIV感染由于RNAi是機(jī)體中古老而天然的抗病毒機(jī)制，HIV病毒感染是我們亟待解決的問題，將RNAi技術(shù)應(yīng)用于艾滋病治療是順理成章之事。針對HIV病毒研究有Jacque等設(shè)計的抑制HIV1長末端重復(fù)序列、附件基因vif和nef表達(dá)的siRNA，Lee等針對rev轉(zhuǎn)錄子設(shè)計的siRNA及Novina等]針對HIV病毒gag基因設(shè)計的siRNA，其根本策略都是選擇HIV病毒或宿主細(xì)胞基因?yàn)榘悬c(diǎn)?！?〕在基因治療中的應(yīng)用治療HIV感染88治療HIV感染然而，RNAi治療HIV，應(yīng)用于臨床，有幾個重要問題必須解決：Ａ、作用靶點(diǎn)的選擇，siRNA對序列要求非常嚴(yán)格，1個堿基的錯配，將大大降低siRNA基因表達(dá)抑制作用。如果HIV逆轉(zhuǎn)錄酶有較高的錯配率(1/1000個核苷酸每個復(fù)制循環(huán))，就可能迅速導(dǎo)致所謂siRNA逃逸突變的出現(xiàn)。感染個體中HIV序列的多樣性，為siRNA的設(shè)計和合成增加了難度。Ｂ、如何有效導(dǎo)入siRNA.DNA質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和脂質(zhì)體等在培養(yǎng)細(xì)胞株中有良好的導(dǎo)入效果，但在原代細(xì)胞中效果較差。Ｃ、增強(qiáng)siRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性.為了防止細(xì)胞內(nèi)RNA酶對siRNA的降解，可以用DNA質(zhì)粒和病毒載體將siRNA以發(fā)夾(hairpins)的形式導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。

治療HIV感染然而，RNAi治療HIV，應(yīng)用于臨床，有幾個89治療肝炎病毒感染JudeLieberman等已經(jīng)成功地利用RNAi技術(shù)治愈了實(shí)驗(yàn)鼠的肝炎。他們干擾的目標(biāo)是“凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)〔FAs〕基因〞。FAs存在于細(xì)胞外表，它能夠啟動細(xì)胞的自殺程序。據(jù)認(rèn)為，許多肝病是由于病毒、免疫系統(tǒng)失常或慢性酒精中毒激活了FAs基因所導(dǎo)致的。JudeLieberman等給實(shí)驗(yàn)鼠尾部血管注入旨在“沉默〞FAs基因的siRNA，發(fā)現(xiàn)有90％的肝細(xì)胞接收到了這種RNA分子，F(xiàn)As蛋白質(zhì)的產(chǎn)量變成原先的十分之一。結(jié)果，未承受RNAi治療的實(shí)驗(yàn)鼠有40％在３天內(nèi)死亡。而40只承受過治療的實(shí)驗(yàn)鼠有33只活了下來，10天后研究人員檢查這些實(shí)驗(yàn)鼠的肝部，發(fā)現(xiàn)完全正常。治療肝炎病毒感染JudeLieberman等已經(jīng)成功地利用90治療肝炎病毒感染McCaffreA及其導(dǎo)師KayM結(jié)果那么證明RNAi可以直接治療肝炎并病毒。他們首先將HBV的基因組插入到小鼠肝臟細(xì)胞中，模擬HBV感染，然后合成靶向HBV基因組不同局部的2種siRNA并分別與表達(dá)載體連接后導(dǎo)入感染小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組小鼠體內(nèi)肝炎病毒RNA的數(shù)量與對照組相比減少了92%。治療組小鼠沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的副作用。但Kay指出，這種運(yùn)送siRNA方法不能用于人類。他們正在實(shí)驗(yàn)更溫和的途徑將siRNA運(yùn)送到細(xì)胞中。對于人來說，身體比老鼠大得多，血液循環(huán)系統(tǒng)也龐大。如果解決了將siRNA有效而又充足地運(yùn)送到細(xì)胞的問題，將為許多疾病和感染提供新療法。治療肝炎病毒感染McCaffreA及其導(dǎo)師KayM結(jié)果那91治療腫瘤

多種癌基因可以作為靶點(diǎn)設(shè)計相對應(yīng)的siRNA

。Brummelkamp等用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將siRNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中,特異性抑制了癌基因kras(v12)的表達(dá)。對急性髓性白血病的研究已經(jīng)取得了樂觀的結(jié)果。Scher等以引起慢性髓性白血病和bcrab1陽性急性成淋巴細(xì)胞白血病的bcrab1癌基因?yàn)榘谢?設(shè)計了對應(yīng)的siRNA,并獲得了87%的有效抑制率。Wilda等用siRNA抑制白血病bcr/abl融合基因表達(dá)也取得了成功。因此基于RNAi技術(shù)的抗腫瘤治療藥物開發(fā)潛力巨大。

治療腫瘤多種癌基因可以作為靶點(diǎn)設(shè)計相對應(yīng)的siRNA。92基因調(diào)控目前在人、蠕蟲，果蠅和植物等生物體中都發(fā)現(xiàn)了小RNA，有的通過結(jié)合3‘非翻譯區(qū)〔UTR〕和靶mRNA抑制mRNA翻譯，有的作為siRNA通過RNAi機(jī)制破壞靶基因轉(zhuǎn)錄本。基因調(diào)控目前在人、蠕蟲，果蠅和植物等生物體中都發(fā)現(xiàn)了小RNA93基因功能分析（AnimalGeneticEngineering）第十二章基因功能分析第十二章94主要內(nèi)容第一節(jié)轉(zhuǎn)基因第二節(jié)基因敲除第三節(jié)動物克隆技術(shù)第四節(jié)RNAi技術(shù)主要內(nèi)容第一節(jié)轉(zhuǎn)基因95第一節(jié)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenictechnology）第一節(jié)961轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因超級鼠1982年，英國的《自然》雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實(shí)驗(yàn)小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將大鼠生長激素重組基因?qū)氲叫∈笫芫阎?培育出具快速生長效應(yīng)的“轉(zhuǎn)基因超級鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快2～3倍，體積大一倍。1轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因動物97概念轉(zhuǎn)基因：1）將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是指利用分子生物學(xué)技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其它物種中，改造生物的遺傳物質(zhì)，使遺傳物質(zhì)得到改造的生物在性狀、營養(yǎng)和消費(fèi)品質(zhì)等方面向人類需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)基因動物：所謂轉(zhuǎn)基因動物就是指以實(shí)驗(yàn)方法將外源基因?qū)雱游锶旧w基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。概念98ProducingtransgenicanimalsDirecttransfectionorretroviralinfectionofembryonicstemcellsfollowedbyintroductionofthesecellsintoanembryoattheblastocyststageofdevelopmentRetrovialinfectionofearlyembryoDirectmicroinjectionofDNAintooocytes,zygotesorearlyembryocellsSperm-mediatedtransferTransferintounfertilisedovaPhysicaltechniquessuchasbiolisticsorelectrofusionNucleartransferProducingtransgenicanimalsDi99基因功能分析策略ben課件100轉(zhuǎn)基因動物由于“外源DNA〞導(dǎo)入而產(chǎn)生了可以遺傳的改變。這些可遺傳的改變包括：外源DNA片段至少整合到一條染色體的一個位點(diǎn)上；外源DNA的插入使基因組中任何一個基因的構(gòu)造發(fā)生改變；外源DNA的插入使染色體發(fā)生重排；導(dǎo)入可以持久存在的遺傳實(shí)體，例如，一條人工染色體或者可以自我復(fù)制并傳遞給子細(xì)胞的非染色體元件。轉(zhuǎn)基因動物由于“外源DNA〞導(dǎo)入而產(chǎn)生了可以遺傳的改變。這些101IntroducingClonedGenesintoCulturedMammalianCellsIntroductionofmethodsIntroducingClonedGenesinto102DNATransfectionMediatedbyLipofectionCalcium-phosphate-mediatedTransfectionofEukaryoticCellswithPlasmidDNAsCalcium-phosphate-mediatedTransfectionofCellswithHigh-molecularweightGenomicDNATransfectionMediatedbyDEAE-Dextran:High-efficiencyMethodDNATransfectionUsingPolybreneDNATransfectionbyElectroporationDNATransfectionMediatedbyL103轉(zhuǎn)基因的方法

1、顯微注射法：將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。

2、體細(xì)胞核移植方法：先在體外培養(yǎng)的體細(xì)胞中進(jìn)行基因?qū)氩⒑Y選。然后將帶轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞移植到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，生產(chǎn)重構(gòu)胚胎。轉(zhuǎn)基因的方法

104Microinjection用顯微注射針將外源基因直接注入實(shí)驗(yàn)動物受精卵的原核，使外源基因基因整合入動物基因組中，從而得到轉(zhuǎn)基因動物。是目前常用的轉(zhuǎn)基因方法。導(dǎo)入基因的速度快，操作簡單，對DNA大小無限制。Microinjection用顯微注射針將外源基因直接注入實(shí)105基因功能分析策略ben課件106基因功能分析策略ben課件107基因功能分析策略ben課件108PronuclearmicroinjectionPronuclearmicroinjection109基因功能分析策略ben課件110基因功能分析策略ben課件1113．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：最早用來得到轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，利用逆轉(zhuǎn)錄載體將遺傳信息以RNA分子的形式，在逆轉(zhuǎn)錄整合酶和逆轉(zhuǎn)錄基因組末端的特異性核酸序列的作用下，反轉(zhuǎn)錄并整合到宿主基因組中去，最終得到轉(zhuǎn)基因小鼠。4．胚胎干細(xì)胞法：將轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞注射入受體囊胚腔，可參與嵌合體的形成，將來出生的動物的生殖系統(tǒng)就有可能整合上外源基因，通過雜交繁育得到純合目的基因的個體，即為轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因的方法3．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：最早用來得到轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，利用逆轉(zhuǎn)112轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景

1、研究基因的結(jié)構(gòu)與功能，了解動物生命現(xiàn)象的內(nèi)在本質(zhì)。2、建立多種疾病的動物模型，研究發(fā)病機(jī)理及治療方法。3、改善動物生產(chǎn)性能，提高動物育種效率。4、作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器?？梢酝ㄟ^家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價的人體藥用蛋白。轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景113四個主要國家轉(zhuǎn)基因作物種植面積占全球９９％。美國占６６％，達(dá)３９００萬公頃，轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)量也居世界第一，美國種植的７５％的大豆、３４％的棉花和７１％的玉米都是轉(zhuǎn)基因作物。阿根廷占２３％，達(dá)１３５０萬公頃。加拿大占６％，達(dá)３５０萬公頃。中國第四位，占４％，達(dá)２１０萬公頃。歐盟國家總面積不到２０萬公頃，０.３％左右。

四個轉(zhuǎn)基因作物種植大國2002年數(shù)據(jù)四個主要國家轉(zhuǎn)基因作物種植面積占全球９９％。四個轉(zhuǎn)基因作物種114基因功能分析策略ben課件115

各國GMO作物栽培面積的變遷

(藍(lán)色者為全球統(tǒng)計)百萬公頃各國GMO作物栽培面積的變遷

(藍(lán)色者為全球統(tǒng)計)百116ResearchonTransgenicCorn

轉(zhuǎn)基因玉米研究改進(jìn)玉米的質(zhì)量 保爾斯科特博士，美國農(nóng)科院和州立大學(xué)農(nóng)學(xué)系教授在玉米上生產(chǎn)動物疫苗 植物科學(xué)研究所生物藥用研究所植物轉(zhuǎn)化主任王侃博士基因限界,花粉散布的模擬 農(nóng)學(xué)系教授馬克.維斯蓋特博士非限制花粉流動〔漂移〕造成的經(jīng)濟(jì)損失 商學(xué)院教授德莫特海斯博士遺傳修飾農(nóng)業(yè)產(chǎn)品生物平安研究所種子科學(xué)中心主任滿基特密斯瑞博士Improvingmaizequalitytraits: Dr.PaulScott,USDA-ARSandDepartmentofAgronomyAnimalvaccinesincorn:

PlantSciencesInstituteBiopharmaceuticalInitiative:

Dr.KanWang,DirectorPlantTransformationFacilityGeneConfinement: ModelingPollenDispersal,Dr.MarkWestgate,DepartmentofAgronomyEconomicCostofUncontrolledPollenFlow: Dr.DermotHayes,PioneerChairofAgribusinessBIGMAP: BiosafetyInstituteforGeneticallyModifiedAgriculturalProducts,Dr.ManjitMisra,DirectorSeedScienceCenterResearchonTransgenicCorn

轉(zhuǎn)基117Dr.Scott’slabisusingacombinationofbiochemistry,molecularbiologyandtraditionalplantbreedingtoaddvaluetocorn斯科特博士的實(shí)驗(yàn)室綜和利用生物化學(xué)，分子生物學(xué)和傳統(tǒng)植物育種方法為玉米增加價值。Maizequalitytraits

玉米質(zhì)量性狀Dr.Scott’slabisusingacomb118Sow’smilkcontainsalphalactalbuminAlphalactalbuminproteinisanidealcornfeedadditiveDr.ScottevelopedtransgeniccorntoproducethisproteinintheseedLinesarebeingdevelopedforfeedingtrials

母豬的牛奶含ａ-乳清白蛋白ａ-乳清白蛋白是理想的玉米飼料添加劑斯科特博士的轉(zhuǎn)基因玉米在種子中生產(chǎn)該蛋白含該基因的品系目前在飼喂試驗(yàn)中alphalactalbuminImprovingswinenutrition

改良豬肉營養(yǎng)Sow’smilkcontainsalphalact119Animalvaccinesincorn

玉米中的動物疫苗王博士的研究小組研究轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)生有活性功能的抗大腸桿菌毒素的疫苗抗體該研究是州立大學(xué)植物研究所工程之一喂養(yǎng)老鼠含抗體的玉米使老鼠不受抗大腸桿菌葡萄球菌毒素和霍亂弧菌毒素危害Dr.Wang’sgroupdevelopedtransgeniccornplantsthatproduceafullyfunctionalvaccineantigenagainstanE.colitoxin.PartofthePlantScienceInstituteBio-pharmaceuticalInitiativeFeedingantigen-containingcorntomiceprotectedthemagainstE.colienterotoxinandcholeratoxinE.coliAnimalvaccinesincorn

玉米中的動物120Scientificissues: Proofofconcept,GeneticstabilityRegulatoryrequirements:Productcomparability,puritySafetyconcerns:Environmentalimpact,Productprotection,GeneflowCommercialization:EconomicandLegalissues科學(xué)領(lǐng)域:證明概念,保證遺傳穩(wěn)定性管理要求:產(chǎn)品的可比性,純度平安性考慮:環(huán)境效應(yīng),產(chǎn)品保護(hù)和基因漂移商品化:經(jīng)濟(jì)和法律問題StewardshipofPlant-MadePharmaceuticalsandIndustrials

為植物產(chǎn)藥用工業(yè)效勞

Scientificissues:科學(xué)領(lǐng)域121基因功能分析策略ben課件122目前世界上已經(jīng)上市並商品化的轉(zhuǎn)基因植物有：黃豆、玉米、棉花、木瓜、甜菜、油菜、水稻、小麥、馬鈴薯、鳳梨等。由外觀無法判斷木瓜是否基因改造目前世界上已經(jīng)上市並商品化的轉(zhuǎn)基因植物有：黃豆、玉米、棉花、123世界上第一種基因移植作物是一種含有抗生素藥類抗體的煙草，1983年得以培植出來。世界上第一種基因移植作物是一種含有抗生素藥類抗體的煙草，19124轉(zhuǎn)基因番茄

1994年，美國政府批準(zhǔn)了他們研制成功抗干旱、早熟、保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品化之后，我國也相繼成功培育出優(yōu)良品種的轉(zhuǎn)基因番茄，以滿足人們的需求。

轉(zhuǎn)基因番茄

125基因功能分析策略ben課件126轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄127轉(zhuǎn)基因甜椒

甜椒在栽培的過程中，容易受病毒的感染。我國科學(xué)工作者，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出抗病毒的甜椒。轉(zhuǎn)基因甜椒甜椒在栽培的過程中，容易受病毒的感染。我128轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒129轉(zhuǎn)基因油菜

油菜是人們食用油的主要來源之一。一般油菜籽的含油量約為40％左右。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出來的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的純度質(zhì)量更好。轉(zhuǎn)基因油菜130

玉米是主要糧食之一，又可以提煉油脂，也可以用作食品和工業(yè)的原料以及作飼料，渾身是寶。人們稱它是含金的植物。如今培育出轉(zhuǎn)基因玉米，品質(zhì)更好，產(chǎn)量更高。轉(zhuǎn)基因玉米

抗蟲害的玉米

玉米是主要糧食之一，又可以提煉油脂，也可以用作食品131轉(zhuǎn)基因小麥

從植物體中分離出合成賴氨酸的基因，把這基因轉(zhuǎn)入小麥植株中，培育出轉(zhuǎn)基因小麥。用這種轉(zhuǎn)基因小麥制造出來的面粉，更適合用來烤面包，而且面粉中賴氨酸含量高，這種面包的營養(yǎng)價值高。

轉(zhuǎn)基因小麥132基因改造蘭花臺灣的蘭花經(jīng)基因重組技術(shù)而延長開花時間?；蚋脑焯m花臺灣的蘭花經(jīng)基因重組技術(shù)而延長開花時間。133利用基因重組技術(shù)培育新顏色的海芋，引起爭議較小。利用基因重組技術(shù)培育新顏色的海芋，引起爭議較小。134轉(zhuǎn)基因牽?；?/p>

我國科學(xué)工作者，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以轉(zhuǎn)變矮牽牛花的花色，使矮牽牛花的花色更加豐富多彩。轉(zhuǎn)基因牽?；?/p>

我國科學(xué)工作者，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以轉(zhuǎn)變矮牽牛135基因功能分析策略ben課件136基因功能分析策略ben課件137存在問題

1、食品安全問題：1）未知的可能副作用？2）外源基因在人體內(nèi)表達(dá)？2、技術(shù)問題：1）成本；2）成功率；3）基因組的有效整合、穩(wěn)定遺傳；存在問題138什么是生物反應(yīng)器？生物反應(yīng)器是指利用轉(zhuǎn)基因活體動物的某種能夠高效表達(dá)外源蛋白的器官或組織來進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)活性功能蛋白的技術(shù)，這些蛋白一般是藥用蛋白或營養(yǎng)保健蛋白。什么是生物反應(yīng)器？139用于表達(dá)的生物反應(yīng)器包括動物血液、泌尿系統(tǒng)、精囊腺、乳腺等，還包括禽蛋和昆蟲（例如家蠶）個體等。其中動物乳腺生物反應(yīng)器是目前國際上唯一證明可以達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)水平的生物反應(yīng)器。據(jù)預(yù)測，2010年世界上動物乳腺生物反應(yīng)器的年產(chǎn)值將達(dá)到500億美元以上。生物反應(yīng)器的種類及應(yīng)用用于表達(dá)的生物反應(yīng)器包括動物血液、泌尿系統(tǒng)、精囊腺、乳腺等，140第二節(jié)

基因敲除(GeneKnockout)第二節(jié)141什么是基因敲除技術(shù)？基因敲除（geneknockout）是80年代初出現(xiàn)的一項(xiàng)新的基因工程技術(shù)。采用同源重組的方法,用體外合成的無效基因或突變基因取代相應(yīng)正?；?再應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法孵育出轉(zhuǎn)基因動物,即為基因敲除動物。什么是基因敲除技術(shù)？142基因打靶基因打靶(genetargeting)通過DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究該基因的功能?；虼虬械奶卣鳎褐苯有?。準(zhǔn)確性。有效性基因敲除(geneknockout)：定向敲除某個基因的方法?；蚯萌?geneknockin)：定向?qū)⒁欢位蛐蛄刑娲硪欢位蛐蛄械姆椒ā；虼虬谢虼虬?genetargeting)143基因打靶的必備條件胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)取自胚胎早期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。ES細(xì)胞能在體外培養(yǎng)，并保存發(fā)育的全能性。打靶載體Neo〔新霉素〕陽性篩選標(biāo)志HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)基因打靶的必備條件胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)144基因打靶策略完全基因剔除基于Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)的條件基因打靶用基因打靶技術(shù)引入精細(xì)突變大片段染色體的重排和刪除隨機(jī)基因刪除ENU誘導(dǎo)點(diǎn)突變與大規(guī)?；蛲蛔兒凸δ苎芯坷没蚯萌爰夹g(shù)制備轉(zhuǎn)基因動物基因打靶策略完全基因剔除145基因敲除的根本程序打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種基因敲除的根本程序打靶載體的構(gòu)建146基因功能分析策略ben課件147示例示例148基因功能分析策略ben課件149基因敲除技術(shù)的應(yīng)用1、研究基因調(diào)控和基因功能；2、建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供材料；3、改造動物基因型，鑒定新基因和/或其新功能，研究發(fā)育生物學(xué)；4、治療遺傳病，即基因治療。5、改造生物、培育新的生物品種?；蚯贸夹g(shù)的應(yīng)用150用基因治療血友病用基因治療血友病151第三節(jié)

動物克隆技術(shù)(AnimalCloningTechnology)第三節(jié)152

CreatingDolly！1997年2月22日，英國“Nature”刊登了愛丁堡羅斯林研究所維爾穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，從此震驚了世界。

1531998年4月與威爾士山羊戴維產(chǎn)下邦尼，證明了克隆動物也能生育。2003.2.14日蘇格蘭向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫實(shí)施了安樂死。由于早衰問題，人們懷疑“多莉是穿著羔羊服裝的老羊”。多莉的生命歷程1998年4月與威爾士山羊戴維產(chǎn)下邦尼，證明了克隆動物也能生154羅斯林研究所科學(xué)家取一頭普通白綿羊的乳腺細(xì)胞，將細(xì)胞核移植到一個剔除了細(xì)胞核的卵子中，使之融合、分裂、發(fā)育成胚胎，然后移植到第三頭羊的體內(nèi)?？茖W(xué)家共培育277個胚胎，只有多莉成功出生。1996年7月5日，多莉降臨人世。直到1997年2月23日才公布于眾。羅斯林研究所科學(xué)家取一頭普通白綿羊的乳腺細(xì)胞，將細(xì)胞核移植到155克隆豬Culturedpigembryosfollowingthenucleartransfercloningprocedure.克隆豬Culturedpig156ANDi–第一只轉(zhuǎn)基因靈長類TransgenicbutnotfluorescentCarriesandexpressestheGFPtransgeneFluorescenceisnotdetectedShowsgenemodificationinprimatesispossibleANDi–第一只轉(zhuǎn)基因靈長類Transgenicbut157克隆靈長類〔CloningPrimates〕ClonedandaloneNeti(nuclearembryotransferindividual)Dittoarestilltheonlyclonedprimates,despiteyearsofeffortbyseveralgroups.克隆靈長類〔CloningPrimates〕Cloned158能發(fā)熒光的熱帶斑馬魚普通熱帶斑馬魚是不發(fā)熒光的能發(fā)熒光的熱帶斑馬魚普通熱帶斑馬魚是不發(fā)熒光的159生長快、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國)乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)生長快、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國)乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因160中科院水生生物研究所培育的轉(zhuǎn)基因鯉魚，表現(xiàn)出快速生長效應(yīng)。中科院水生生物研究所培育的轉(zhuǎn)基因鯉魚，表現(xiàn)出快速生長效應(yīng)。161我國培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因兔，轉(zhuǎn)入的乙型肝炎表面抗原基因已在基因兔體內(nèi)整合并表達(dá)。兔研人員將乙型肝炎表面抗原基因注入兔受精卵的情形。我國培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因兔，轉(zhuǎn)入的乙型肝炎表面抗原基因已在基162美國通過基因工程將人的基因植入牛的體內(nèi)，由轉(zhuǎn)基因公牛授精的母牛產(chǎn)下5頭健壯的牛犢，每頭都含有一個人類的基因。美國通過基因工程將人的基因植入牛的體內(nèi)，由轉(zhuǎn)基因公牛163轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物164不同轉(zhuǎn)基因動物研究水平綠色=常規(guī)黃色=開展中紅色=還不可行不同轉(zhuǎn)基因動物研究水平綠色=常規(guī)165什么叫克隆？細(xì)胞核移植得到的個體都叫做克隆。

核移植是指利用顯微外科手術(shù)的方法將胚胎細(xì)胞或成體細(xì)胞的細(xì)胞核移人去核的卵母細(xì)胞中，構(gòu)建成重組胚，通過體內(nèi)或體外培養(yǎng)、胚胎移植，產(chǎn)生與供體細(xì)胞基因型相同的后代的技術(shù)過程，又稱為動物克隆技術(shù)。根據(jù)核供體的來源不同，可將其分為胚胎細(xì)胞克隆動物和體細(xì)胞克隆動物技術(shù)。

通常所說的動物克隆指體細(xì)胞克隆，即動物的無性繁殖。什么叫克?。?66動物克隆的意義1、體細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的相互轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞體細(xì)胞動物克隆的意義1、體細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的相互轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞體細(xì)167動物克隆的意義2、對傳統(tǒng)動物繁殖模式的挑戰(zhàn)；（AI、Clone）3、對社會倫理的挑戰(zhàn)；4、保存物種、延續(xù)生命、提高人口素質(zhì)？動物克隆的意義2、對傳統(tǒng)動物繁殖模式的挑戰(zhàn)；4、保存物種、延168第四節(jié)

siRNA技術(shù)(siRNATechnology)第四節(jié)169什么是RNAi？RNAi〔RNAinterference〕是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，dsRNA引起同源mRNA的特異性降解，因而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過程。一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默生物體內(nèi)普遍存在抵御外在感染的重要保護(hù)機(jī)制什么是RNAi？RNAi〔RNAinterference〕170RNAi的開展歷程大事記1995，RNAi現(xiàn)象首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)。Cell，1995，81：611-6201998，RNAi概念的首次提出。Nature,1998,391〔6669〕：8061999，RNAi作用機(jī)制模型的提出。Cell，2000，101〔1〕：25-33在線蟲、果蠅、擬南芥及斑馬魚等多種生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象。2001，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。Nature，2001，411〔6836〕：494－498RNAi技術(shù)被?Science?評為2001年度的十大科技進(jìn)展之一。2002至今，有關(guān)RNAi的研究蓬勃開展，是分子生物學(xué)領(lǐng)域最為熱門的方向之一。RNAi的開展歷程大事記1995，RNAi現(xiàn)象首次在線蟲中發(fā)171預(yù)備知識dsRNA：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈Dicer：屬于RNaseⅢ家族，是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶siRNA：smallinterferingRNA，RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子，21-23個nt大小的雙鏈RNARISC：RNA-inducingsilencingcomplex，具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性RdRP：RNA-dependentRNApolymerases，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞預(yù)備知識dsRNA：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈172RNAi引發(fā)的基因沉默機(jī)制GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.RNAi引發(fā)的基因沉默機(jī)制GiselaStorz,Sci173RNAi的分子生物學(xué)特性RNAi是siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默RNAi作用針對的是靶基因的外顯子序列高特異性，只針對同源靶向mRNA高效性，極低濃度的siRNA就能完全抑制基因表達(dá)RNAi作用具有可傳遞性RNAi的分子生物學(xué)特性RNAi是siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平174RNAi研究的一般技術(shù)路線RNAi研究的一般技術(shù)路線175RNAi的研究方法siRNA的設(shè)計根據(jù)靶向mRNA進(jìn)展設(shè)計目前已證實(shí)的siRNA序列://ambion/techlib/tb/tb_502.html:///mmcmanus/www/siRNADB.html互聯(lián)網(wǎng)上的幫助://