抗腫瘤藥物實驗法課件

在抗腫瘤研究中，人們提出了腫瘤多步驟、DNA突變、細胞凋亡、細胞周期核心機制、細胞周期啟動及多條信號轉(zhuǎn)導途徑參與等許多理論和學說。

抗腫瘤藥的研究隨著理論的更新和技術(shù)的進步，已從以核酸等為靶點的殺傷型細胞毒藥轉(zhuǎn)向?qū)δ[瘤新靶點的研究。包括化學預防藥、分化誘導劑、凋亡誘導劑、信號傳導阻滯劑、血管生成抑制劑、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑、生物調(diào)節(jié)劑以及化放療保護劑等。

隨著新型抗癌藥的研究，誕生了許多抗腫瘤藥物實驗方法。在抗腫瘤研究中，人們提出了腫瘤多步驟、DNA突1第1節(jié)腫瘤細胞體外篩選方法

一、抗腫瘤藥體外方法

動物模型在抗腫瘤藥物的評價中起重要的作用，但動物模型費用高，周期長使其不適合大規(guī)模的抗腫瘤藥物評價。因此抗腫瘤藥初步篩選首先應采用腫瘤細胞體外實驗方法，既節(jié)約成本又節(jié)省時間。第1節(jié)腫瘤細胞體外篩選方法

一、抗腫瘤藥體外方法21.MTT法【基本原理】活細胞線粒體中存在的脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）為藍紫色的甲臜；而死細胞此酶消失，MTT不被還原。用DMSO溶解甲臜后，570nm處酶標儀測定其吸光度（OD值）。OD值與活細胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)OD值推測出活細胞的數(shù)目，了解藥物抑制或殺傷腫瘤細胞的能力。1.MTT法3【操作步驟】（1）0.25%胰酶消化對數(shù)生長期細胞，5%～10%NBS的RPMI1640調(diào)細胞濃度50000個/ml。96孔板100ul/孔。設(shè)溶劑對照，每組3-6平行孔。37℃，5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h，棄上清。（2）加藥物5個10倍稀釋的濃度（溶劑常用的有二甲亞砜和水)，通常為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。（3）細胞連續(xù)培養(yǎng)24～72h，每孔加入10μl5mg/ml的MTT溶液（以無血清培養(yǎng)基配制），繼續(xù)培養(yǎng)4h。（4）吸去上清。加入200μlDMSO，輕輕振蕩以使甲臜完全溶解。570nm處用酶標儀測定OD值。（5）計算抑制率(%)=（對照OD-藥物OD）/對照OD*100%【操作步驟】42.XTT法【基本原理】XTT是MTT的衍生物，經(jīng)過活細胞代謝還原成水溶性的代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物的量與活細胞的數(shù)目成正比，因此利用酶標儀在檢測波長465nm處測定代謝物的OD值可以推測活細胞的數(shù)量。數(shù)據(jù)處理方法同MTT法。2.XTT法5【操作步驟】（1）細胞接種，藥物處理均同MTT方法。（2）藥物處理24～72h后，每孔加50μlXTT溶液（內(nèi)含50μgXTT，5μl10mmol/L的電子偶聯(lián)劑(PMS)）繼續(xù)培養(yǎng)4h。（3）96孔培養(yǎng)板振蕩2～3min后，直接用酶標儀在465nm波長處測OD值?！静僮鞑襟E】6【注意事項】（1）優(yōu)點：XTT代謝產(chǎn)物溶解于水，不需要吸去上清就可測OD值，簡單方便，減少誤差。（2）XTT不易被線粒體酶還原，因此同時加入電子偶聯(lián)劑(PMS)。（3）每孔的XTT量不宜加入太多，高濃度的代謝產(chǎn)物抑制線粒體酶活性。（4）XTT和PMS現(xiàn)用現(xiàn)配。【注意事項】73.染料排斥法檢測藥物對腫瘤細胞的生長抑制【基本原理】活細胞有排斥染料（如伊紅、臺盼藍、苯胺黑等染色的能力，而細胞死亡后由于膜完整性遭到破壞，細胞即被著色。3.染料排斥法檢測藥物對腫瘤細胞的生長抑制8【操作步驟】（1）25ml培養(yǎng)瓶中加入細胞4×104個、受試藥40μl，終體積4ml，（2）5%CO2，37℃培養(yǎng)48～96h。（3）取細胞懸液0.4ml，加0.4%臺盼藍液0.1ml，在室溫作用5min，在15min內(nèi)，細胞計數(shù)板計數(shù)約200個細胞中死細胞（藍色）的個數(shù)。【結(jié)果評定】（1）活細胞率%=（未染色細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。（2）將活細胞率與藥物濃度的對數(shù)作圖，可得到S形劑量反應曲線，計算半數(shù)殺傷濃度（LC50）。（3）當LC50<10μg/ml并能重復時，提示藥物應進一步實驗。【操作步驟】9【注意事項】

藥物殺傷細胞作用可能被低估原因：

（1）存活細胞可能繼續(xù)繁殖，使活細胞率增高。（2）死細胞可能過早地崩解，計數(shù)時已不存在，使死細胞率下降?！咀⒁馐马棥?04.集落形成法測定藥物對腫瘤克隆原細胞的生長抑制作用【基本原理】克隆原細胞指具有持續(xù)增殖能力的細胞。當單個細胞能連續(xù)分裂6代或以上時，其后代所組成的群體（集落）含50個以上細胞。計數(shù)集落可以對克隆原細胞作定量分析。反映了單個細胞增殖潛力，能較靈敏地測定抗腫瘤藥物的活性，目前被認為是一種較理想的檢測方法。常用的集落形成方法可分為貼壁法及半固體培養(yǎng)基法。4.集落形成法測定藥物對腫瘤克隆原細胞的生長抑制作用11【操作步驟】（1）貼壁集落形成：適用于幾乎所有貼壁生長的細胞。1）生長期貼壁細胞一瓶，胰蛋白酶消化成單細胞懸液，活細胞計數(shù)，培養(yǎng)基稀釋成50～100個細胞/ml。2）取直徑33～35mm培養(yǎng)皿（或15ml培養(yǎng)瓶）或6孔板，每組3復孔/皿，受試藥20μl，稀釋后細胞懸液2ml，搖勻，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～14天。3）棄上清，PBS洗2次，2ml/次，無水甲醇固定5min，靜置干燥，用吉姆薩染色或1%結(jié)晶紫染色5～10min后，用自來水沖洗，室溫干燥，鏡下計數(shù)75μm以上的集落。【操作步驟】12（2）軟瓊脂集落形成：適用懸浮和貼壁生長細胞。

1）計數(shù)對數(shù)生長期細胞，15%NBS培養(yǎng)液配成1000個/ml細胞懸液，37℃溫育。2）取33～35mm培養(yǎng)皿，3復皿，加受試藥20μl。3）取37℃新鮮培養(yǎng)液9份，加沸水浴中融化的5%瓊脂液1份，搖勻，加入平皿，每個1ml，混勻置室溫使瓊脂凝固。4）取預溫的細胞懸液按每9.4ml加5%瓊脂液0.6ml的比例混勻，加入已鋪底層瓊脂的平皿中，每個1ml，置室溫使瓊脂凝固。5）將平皿置5%CO2，37℃孵育箱中培養(yǎng)7～10天。6）鏡下計數(shù)直徑大于75μm（50個細胞以上）的集落。（2）軟瓊脂集落形成：適用懸浮和貼壁生長細胞。13【結(jié)果評定】（1）劑量反應曲線：以集落抑制百分率與劑量對數(shù)作圖，可以得到一條S形曲線并求出藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

（2）亦可計算各加藥組集落形成率?！窘Y(jié)果評定】145、癌細胞分化誘導實驗

【基本原理】癌癥屬于細胞分化異常的疾病。惡性腫瘤存在著明顯的細胞分化受阻。白血病、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)母細胞瘤等可在體外被某些化合物誘導分化為正常細胞或近似正常的細胞。這些發(fā)現(xiàn)為抗腫瘤藥物研究開辟了一條新的途徑。因此，癌的分化治療已成為癌癥研究的重要前沿方向之一。5、癌細胞分化誘導實驗15分化指標包括形態(tài)學變化、及生化功能變化。人早幼粒細胞白血病HL-60細胞的分化誘導實驗HL-60細胞分化為成熟度不同的粒細胞或巨噬細胞

硝基四氮唑藍（NBT）試驗:NBT還原能力應大于50％。

形態(tài)學變化的觀察:成熟粒細胞所占比例越高，說明分化效果越好。

吞噬功能測定:分化誘導劑的吞噬百分率應在50％以上。

分化指標包括形態(tài)學變化、及生化功能變化。16肝癌Bel7402細胞分化誘導實驗【基本原理】肝癌Bel7402細胞甲胎蛋白（AFP）在肝癌中分泌量很高。γ-GT（半乳糖轉(zhuǎn)移酶）在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中活性逐漸上升。白蛋白（ALB）及TAT（酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶）在分化良好細胞下降。在體外測定這些蛋白的含量及活性，用以判斷肝癌細胞的分化程度。

AFP及ALB測定：AFP、ALB放免測定試劑盒說明測定AFP及ALB含量

γ-GT、TAT測定：紫外可見分光光度法。肝癌Bel7402細胞分化誘導實驗17第2節(jié)腫瘤動物模型體內(nèi)篩選方法

1.誘發(fā)腫瘤動物模型實驗法2.自發(fā)腫瘤動物模型實驗法3.移植性腫瘤動物模型實驗法4.轉(zhuǎn)基因動物腫瘤實驗法第2節(jié)腫瘤動物模型體內(nèi)篩選方法1.誘發(fā)腫瘤動物模型18對誘發(fā)腫瘤的評價誘發(fā)性腫瘤的病因與由環(huán)境因素所誘致人癌情況相似。癌細胞增殖動力學在兩者間亦接近，故動物誘發(fā)腫瘤類似人體腫瘤。但人癌原因十分復雜，誘癌劑不清，腫瘤的病理組織學與動物不同，發(fā)生發(fā)展與動物誘發(fā)腫瘤不完全一致。誘發(fā)腫瘤不僅誘發(fā)需時較長，成癌率不高。多數(shù)內(nèi)臟腫瘤不作解剖，難以判斷是否已發(fā)生腫瘤。發(fā)生時間先后、發(fā)展速度個體差異大。加之化學致癌物的來源比較困難，并隨著環(huán)境保護意識的增強對相關(guān)的動物實驗室提出了更高的要求和限止，所以本法不宜作一般抗癌藥物篩選應用.對移植性腫瘤有效的藥物，可用本法進一步驗證其抗癌療效。對誘發(fā)腫瘤的評價19對自發(fā)腫瘤總的評價其腫瘤發(fā)生率與瘤細胞動力學特點與人癌近似，生長較移植腫瘤慢，對藥物敏感度不高，療程較長，故便于進行綜合化療的研究；理論上用帶有自發(fā)腫瘤模型篩選藥物較理想。然而，動物自發(fā)腫瘤的病因取決于的遺傳特性，與人癌病因區(qū)別較大。很難在限定期間內(nèi)得到大量生長均勻的帶瘤動物，各動物腫瘤之間生長速度差異也較大，給評價帶來困難。此類腫瘤常用于特殊目的試驗或作為“二級篩選”模型。

對自發(fā)腫瘤總的評價20對轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型的評價該模型較好地再現(xiàn)了人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的完整變化，包括機體從正常演變?yōu)榘┣安∽冞M而發(fā)展為惡性腫瘤的全過程，該模型也為相關(guān)基因與腫瘤的關(guān)系在整體水平研究和基因藥物的研發(fā)提供了良好的手段。但腫瘤的發(fā)生受到一個或多個基因的協(xié)同調(diào)控的，與轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型不同；該模型同樣存在實驗周期長、腫瘤發(fā)生時間不齊、繁育能力較低以及成本較高等缺點。對轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型的評價21移植性腫瘤實驗法動物移植性腫瘤實驗法是最通用的抗腫瘤方法，比自發(fā)性、誘發(fā)性及轉(zhuǎn)基因動物腫瘤容易造模,成功率高（100％），且能同時獲得大量生長相對均勻腫瘤。一般給藥7-10天，第8-11天解剖動物。觀察指標：一般狀況，體重變化及死亡率，判斷藥物是否有明顯的抑制腫瘤生長的作用，為抗癌藥物臨床療效提供有意義的依據(jù)。動物移植性腫瘤是任何體外試驗不能代替的。移植性腫瘤實驗法動物移植性腫瘤實驗法是最通用的抗腫瘤方法，比22一種藥物未必對各種類型的移植性腫瘤有效，選擇某一瘤株供篩選都可能漏篩藥物。動物腫瘤的生物學特點與人類有較大的差距，動物瘤株惡性程度高，生長迅速，對藥物的敏感性比人類自發(fā)的癌瘤高得多，因此，對動物腫瘤生長有抑制的藥物對人癌不一定有效。本法的命中率低。一種藥物未必對各種類型的移植性腫瘤有效，選擇某一瘤株供篩選都23篩選藥物時最好采用三種瘤株，即肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株腫瘤。國內(nèi)用肉瘤S180、艾氏癌腹水型EAC和L615白血病，目前L615往往以P388或L1210小鼠白血病株取代。我國對新藥在第一輪篩選有效的基礎(chǔ)上，推薦人癌異種模型進行第二輪篩選，即人癌進行T細胞免疫缺陷或免疫抑制裸鼠異種移植模型。篩選藥物時最好采用三種瘤株，即肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株腫瘤241.1動物選擇

常用小鼠、大鼠和地鼠。每批實驗用同一性別（但乳癌、卵巢癌、宮頸癌等必須用雌性）。1.2腫瘤移植(1)一般要求

無菌、低溫（消毒不嚴、瘤塊污染常是接種失敗的主要原因）

接種部位:

皮下接種(右前肢腋);肌肉接種(大腿肌肉部);腹水型接種(腹腔)。1.1動物選擇25(2)瘤塊制備：取接種7-10天、生長旺盛且無潰破瘤源。消毒，切開皮膚、瘤生長良好（無壞死或液化），放入無菌平皿，剪成2-3mm3小塊。平皿應置于冰上。無菌套管針抽吸或向套管針內(nèi)塞進一小瘤塊。一般應在30min內(nèi)接種完畢。(3)瘤細胞懸液的制備：數(shù)個瘤塊混合，剪成小塊，用玻璃組織勻漿器研磨，生理鹽水適量稀釋成l：3或l：4的瘤細胞懸液。(2)瘤塊制備：取接種7-10天、生長旺盛且無潰破瘤源。消毒26(4)腹水型腫瘤懸液的制備1)抽取腹水：選擇接種后7-10天瘤源動物，腹水應為乳白色濃稠液體(如黃色或有大量紅細胞則棄去)。2)細胞計數(shù)：用白細胞計數(shù)法計瘤細胞總數(shù)。3)接種：腹水用無菌生理鹽水或含葡萄糖的平衡鹽水(如Hanks液、Gey液等)稀釋至適當?shù)臐舛龋?×107/ml

），ip每鼠0.2ml。(5)白細胞瘤株的接種：腹水型白細胞瘤如P388及L1210的接種同腹水型腫瘤接種法。(4)腹水型腫瘤懸液的制備271.3移植性動物腫瘤的質(zhì)量鑒定(1)每年進行一次實驗動物瘤株的組織學檢查。(2)接種前置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)以檢查細菌，霉菌;在接種和傳代過程中，必須嚴格無菌操作，防止感染。(3)腫瘤生長潛力的檢查1)實體瘤：若對照組中20％腫瘤<400mg或平均重量<1g；大鼠腫瘤平均重量小于2g，作廢。2)腹水型腫瘤：對照組平均生存率應在規(guī)定范圍內(nèi)。1.3移植性動物腫瘤的質(zhì)量鑒定28(4)死亡分析：動物體重減輕、明顯的感染等都會影響實驗的可靠性，必須追究原因（是否給藥劑量過大等）。(5)陽性對照：通常選用對所選瘤株敏感的已知抗腫瘤藥作陽性對照。如S180、EAC皮下型可用環(huán)磷酰胺20～30mg／(kg·d)；L615可用5-Fu25mg/(kg·d)。在同類型化合物抗腫瘤試驗時，最好使用同類型臨床有效的藥物。(4)死亡分析：動物體重減輕、明顯的感染等都會影響實驗的可靠291.4待篩藥物的給藥途徑化學合成藥、抗生素濾液及植物藥的提取物，通常用ip、sc或ig給藥，其他途徑有im、iv等。1.5劑量的選擇一日量可用l/3～1/5LD50劑量參考同類藥物臨床劑量參考同類藥物動物劑量預實驗,開始有動物死亡計量的l/3～1/5為一日量1.4待篩藥物的給藥途徑301.6動物分組隨機小鼠體重相差不超過4g；每組小鼠平均體重相差不宜超過1g；每組大鼠平均體重相差不宜超過5g。1.6動物分組311.7療效評價(1)實體瘤療效評價在治療期間給藥組死亡超過20％，或平均體重(去瘤后)下降(自身對照)超過15％者，表示藥物毒性反應，減少劑量重新試驗。瘤重抑制率％=(1-T／C)×100％中草藥抑制率大于30％，合成藥大于40％，并經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著差異時，認為有苗頭，繼續(xù)重復，連續(xù)3次，療效穩(wěn)定，則評定此藥有一定療效。1.7療效評價32(2)腹水型腫瘤療效評價：逐日記錄動物死亡情況。對照組通常2-3周內(nèi)死完。如對照組動物7天內(nèi)死亡≥20％；或20％存活4周以上，實驗作廢。治療組觀察時間一般為30天或60天(生存超過此時限者，仍按30天或60天計算)。分別記錄對照組和治療組的平均生存時間，按下列公式計算生命延長率：

生命延長率％=(T／C—1)×100％非腹腔給藥時生命延長率大于50％，或腹腔給藥生命延長率大于75％，并經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著差異時，認為有苗頭，需繼續(xù)試驗。連續(xù)3次，療效穩(wěn)定，則評定此藥有一定療效。(2)腹水型腫瘤療效評價：331.8瘤株的選擇目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多首先經(jīng)動物移植性腫瘤篩選而發(fā)現(xiàn)的，從尋找新藥角度看來，按照我國目前條件和情況，篩選細胞毒類藥物時可選用肉瘤Sl80腹水型或?qū)嶓w型、艾氏癌腹水型(EAC)或?qū)嶓w型(ESC)、肝癌Hep腹水型(HAC)或?qū)嶓w型(H22)、Lewis肺癌LL、白血病L1210和P388、黑色素瘤B16、肉瘤S37、腸癌C38、C26及Walker癌肉瘤W256等。1.8瘤株的選擇34從天然產(chǎn)物中尋找新抗腫瘤藥物可選用S180實體型、ESC、LL、L1210和P388、B16、HepA或S、腸癌C26、C38、子宮頸癌U14、白血病L615以及W256等。企圖用一種模型去篩選各種不同類型的新藥，顯然是不恰當?shù)?，因為各種動物移植瘤對抗癌藥物的敏感性不一樣。從天然產(chǎn)物中尋找新抗腫瘤藥物可選用S180實體型、ESC、L351.9腫瘤的低溫保存冷凍保存液可以改變細胞或瘤塊的滲透性，減少細胞內(nèi)的水分，防止水分在細胞內(nèi)產(chǎn)生大量冰晶，如含15％的甘油或10％二甲基亞砜的培養(yǎng)基。凍存時，慢凍（引起的細胞損傷最?。瑩p傷是由于在極少量未結(jié)冰水中保留了高濃度電解質(zhì)引起，因此細胞從0～-20C間冷凍速度要緩慢，一般以每分鐘降1C為宜。然后再將安瓿放置于干冰(固體CO2)或液氮中保存。一般可保存6個月左右。速融，凍存管迅速放入38-40度水浴，RPMI1640液洗滌1-2次，接種。1.9腫瘤的低溫保存361.10移植性腫瘤實驗法舉例l.l0.1小鼠腹水型L1210模型【基本原理】將小鼠白血病L1210瘤細胞懸液ip小鼠，給予不同劑量抗癌活性藥物，可延長荷瘤宿主的生命?！静僮鞑襟E】(1)無菌取DBA/2小鼠約7d的L1210腹水，生理鹽水配制成瘤細胞懸液，細胞數(shù)為5×106/ml，ip小鼠0.2ml(L1210細胞105個)。每組6-10只動物。（雄性,l8-22g，雌性17-21g，每次實驗均用同一性別），接種當天為d0。1.10移植性腫瘤實驗法舉例37

(2)

d1稱重、隨機分組，給藥，包括陰性對照(溶劑)及陽性對照藥，一般用腹腔注射(方案可有多種：僅給1次，次日給藥；每日一次，連續(xù)7天；于第1、5天或第1、5、9天每隔4天給藥一次等)。記錄30天內(nèi)各組動物的死亡情況，至第30天，統(tǒng)計各組動物的平均死亡率?！窘Y(jié)果計算】根據(jù)公式計算試藥對L1210的延長生命率。(L1210平均存活期8-1ld。一般腹水型腫瘤的實驗觀察期為30d，未死亡動物以30d計)。(2)d1稱重、隨機分組，給藥，包括陰性對照(溶劑)38【方法評價】(1)本法也適用P388、EAC、HepA、w256及S180等腹水型移植性腫瘤模型。(2)給藥組第5天動物存活數(shù)應大于65％，否則表示藥物劑量過大。(3)若陰性對照組動物在15d內(nèi)仍不死亡，說明實驗失敗，應分析原因，重做?！痉椒ㄔu價】391.10.2實體瘤模型以肉瘤S180皮下接種【基本原理】皮下接種同種宿主前肢腋下S180，給予抗癌活性的藥物，可以抑制腫瘤在體內(nèi)的生長?！静僮鞑襟E】(1)無菌取接種于昆明小鼠約7天的S180腹水或S180腫瘤。

S180腫瘤無菌剔除包膜和壞死部分，選取完好的瘤塊，置于玻璃勻漿器內(nèi)，加入適量的生理鹽水，計數(shù)，以生理鹽水配制成懸液（1×107／ml），0.2ml/只接種于小鼠前肢腋下，10只一組（雄性體重l8-22g；雌性17-21g）。

1.10.2實體瘤模型以肉瘤S180皮下接種40(2)第2天（d1）稱重、分組、給藥。(3)第11天，動物稱體重，取腫瘤，稱重，最計算抑瘤率?！窘Y(jié)果計算】按上式計算樣本對S180的抑瘤率?！咀⒁馐马棥?1)本法適用于Hep、w256及C26等實體型模型。(2)原則上,陽性對照組的腫瘤抑瘤率應>80％。陰性對照組腫瘤為2g左右。(3)試驗組動物體重不低于原始體重的20％，否則表示試藥劑量過高，需降低劑量重試。(2)第2天（d1）稱重、分組、給藥。411.10.3肌肉接種大鼠Walker癌肉瘤W256模型【操作步驟】(1)Wistar大鼠，55-65g。后腿肌內(nèi)接種瘤細胞懸液0.2ml(約2-4×106個瘤細胞),每組用6-10只動物.(2)接種分組給藥同前。至第8-11天，處死動物，將雙側(cè)后肢從髓關(guān)節(jié)處剪下，分別稱重，荷瘤肢重減去正常肢重即為瘤重。【結(jié)果計算】按荷瘤宿主瘤重抑制率公式計算。1.10.3肌肉接種大鼠Walker癌肉瘤W256模型42[注意事項](1)本法也適用于S180及EAC等腫瘤。(2)接種用瘤源有兩種：一種取用腹水型瘤源，取傳代6-8天的瘤源，抽出的腹水應帶有血性；另一種取用皮下接種的腫瘤以勻漿法制成瘤細胞懸液。(3)對照組肌肉型平均瘤重為3-5g；皮下型平均瘤重為3-12g；腹水型平均生存l0-14天。(4)d7給藥動物存活率>65％,否則劑量過大。[注意事項]431.10.4足趾皮下接種小鼠Lewis肺癌模型【基本原理】惡性程度較高，受體鼠為C57BL/6，SC、IM接種對藥物的敏感性較低，自發(fā)轉(zhuǎn)移肺。接種于后足趾皮下后，待腫瘤生長10d，切除帶瘤足趾稱重，計算抑制率。【操作步驟】取皮下接種8-12d的腫瘤，制成1×107/ml懸液,足趾皮下接種5×105/0.02ml，接種于C57BL/6,18-24g，6-7Wk。給藥后，次日處死動物，將帶瘤后足趾從足關(guān)節(jié)處剪下，分別稱取荷瘤足趾重，與陰性對照組比較，計算抑瘤率。【結(jié)果計算】計算腫瘤抑制率.1.10.4足趾皮下接種小鼠Lewis肺癌模型44【注意事項】(1)Lewis肺癌由于其接種的部位不同，可觀察抑瘤率、生命延長率、自發(fā)肺轉(zhuǎn)移。(2)Lewis肺癌對環(huán)磷酰胺及亞硝脲敏感，對5-Fu及博來霉素的敏感性稍差。(3)Lewis肺癌的足趾接種具有兩種意義：一是直接取荷瘤的足趾測算樣本對原發(fā)灶的抑瘤率；繼續(xù)給藥又可觀察樣本對自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的效果。(4)本實驗只適用于宿主為近交系的腫瘤模型，因接種的細胞量偏少，若應用于非近交系動物，腫瘤的生長將會出現(xiàn)較大的偏差，結(jié)果難以統(tǒng)計?！咀⒁馐马棥?51.10.5人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型【基本原理】裸鼠又稱無胸腺小鼠，具有先天性胸腺缺失；胸腺依賴性免疫功能缺乏，其T細胞功能接近于零，但B細胞功能基本正常，體內(nèi)不具排斥反應，故是人體腫瘤異種移植的理想宿主。異種移植于裸鼠體內(nèi)的人體腫瘤仍保持其原有的組織形態(tài)及生化功能，以及特有的染色體組型和對抗腫瘤藥原有的敏感性。一般認為人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型對抗癌藥的反應與臨床有較好的相關(guān)性，對臨床療效有重要的參考價值。1.10.5人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型46【操作步驟】

(1)人體腫瘤異種移植于裸鼠的瘤源：

一是已建株的人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型，腹水型或?qū)嶓w型，與移植性動物腫瘤模型一樣進行操作。

二是培養(yǎng)的各種病理類型人體腫瘤細胞。

(2)經(jīng)一定的潛伏期，可見腫瘤生長。待腫瘤增殖至可觸及時(瘤結(jié)節(jié)約400mg)，將動物隨機分組，進行治療。亦可在腫瘤接種后次日即分組治療?！静僮鞑襟E】47

【結(jié)果計算】(1)計算給藥組腫瘤抑制率、生命延長率。其計算方法同移植性動物腫瘤模型。(2)裸鼠因皮膚無毛，可便于用卡尺從體外測量腫瘤的體積，易于動態(tài)觀察腫瘤的生長狀態(tài)，比較治療組和對照組腫瘤增殖曲線的變化。每次測量腫瘤的長徑(L)和短徑(W)根據(jù)下列公式計算腫瘤體積(V)：V=(L×w2)/2。【結(jié)果計算】48【注意事項】(1)裸鼠因T細胞免疫缺陷的特性，故對外界的環(huán)境非常敏感，因此裸鼠一定要飼養(yǎng)于無特殊病原體(SPF)的環(huán)境，至少需飼養(yǎng)于層流架內(nèi)，其飼養(yǎng)籠需附帶有濾膜的蓋。所接觸和使用的器具、飼料、飲水、墊料、籠具均預先用高壓滅菌處理過。所用的試藥也應無菌處理。實驗操作也應在層流柜內(nèi)進行。(2)價格比較昂貴，實驗所需代價高。一般要在試藥通過動物移植性腫瘤有效的基礎(chǔ)上再進行本實驗的試驗。【注意事項】49(3)異種移植于裸鼠體內(nèi)的人體腫瘤因仍保持其原有的腫瘤特性，故其生長周期相對較動物腫瘤模型為長，因此，有關(guān)給藥的方案，尤其是給藥的時間和周期因瘤株而異?？鼓[瘤藥物實驗法課件501.10.6小鼠腎囊膜下腫瘤移植法·1.10.7抗轉(zhuǎn)移模型的舉例1.10.7.1Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移模型1.10.7.2B16小鼠黑色素瘤人工肺轉(zhuǎn)移模型1.10.7.3小鼠Hep肝癌脾內(nèi)移植后肝轉(zhuǎn)移模型1.10.8癌侵襲的動物模型1.10.8.1癌骨侵襲大鼠walker-256模型1.10.8.2腎侵襲小鼠宮頸癌U14模型1.10.9原位移植癌動物模型1.10.9.1小鼠膠質(zhì)母細胞瘤G422腦原位瘤試驗法‘1.10.9.2大鼠肝癌BERH一2肝原位移植癌試驗法1.10.9.3人胃癌SGC一7901裸鼠原位接種模型，1.10.10W256肝內(nèi)接種介入治療的模型1.10.11癌分化誘導的動物模型等。1.10.6小鼠腎囊膜下腫瘤移植法·51抗腫瘤藥物實驗法課件52四、轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型（Tumormodelsoftransgenicanimal）是指通過重組DNA技術(shù)將外源腫瘤基因或相關(guān)基因?qū)雱游锶旧w基因組，使之穩(wěn)定表達并能遺傳給后代的一類腫瘤動物模型。轉(zhuǎn)基因方法主要有顯微注射法、精子載體法、電轉(zhuǎn)移、胚胎干細胞移植法、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法、人工酵母染色法等多種方法。用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的腫瘤模型可為腫瘤研究提供理想的動物模型，為深入研究其發(fā)病機制以及基因藥物的等創(chuàng)造了前所未有的條件，為人類精確地研究基因與疾病的相關(guān)關(guān)系提供了可能。但轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型也存在一定的穩(wěn)定性，長期繁育傳代過程中會發(fā)生性狀的改變，甚至丟失。胚胎或精子的冷凍保存技術(shù)的應用可避免這種現(xiàn)象的發(fā)生。并在發(fā)育和研究中加強對動物腫瘤生長的生物學特性觀察，同時利用PCR技術(shù)檢測外源腫瘤基因在動物體內(nèi)的表達，以防外源腫瘤基因的丟失。（一）乙型肝炎病毒（HBV）轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型（二）乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型四、轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型53

三、體外腫瘤細胞遷移、侵襲能力檢測模型（一）細胞劃痕實驗（Woundhealingassay）【基本原理】上皮細胞，成纖維細胞，腫瘤細胞等，在生理狀態(tài)下，常形成單層或者復層上皮細胞。在病理狀態(tài)下，細胞遷移的時候則以側(cè)向運動為主。細胞劃痕實驗是將細胞單層培養(yǎng)在培養(yǎng)板上，待細胞融合后機械性地使小片細胞脫落，然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞，觀察細胞向無細胞的劃痕區(qū)域遷移情況的實驗，很好的模擬了這種側(cè)向遷移運動，一直被用來檢測細胞的遷移能力。三、體外腫瘤細胞遷移、侵襲能力檢測模型54【操作步驟】（1）

準備：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和Marker筆操作前要在超凈臺內(nèi)紫外照射30min。（2）

用Marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線（3）

向孔中加入約106個細胞，因細胞增殖能力不同而略有不同，37℃,5%CO2孵育過夜，使細胞貼壁，鋪滿板底即可。（4）

第二天，用200μl的槍頭在細胞表面進行劃痕，槍頭應盡量垂直于孔背后的橫線，可用直尺比著，槍頭要垂直。（5）

用PBS洗滌細胞3次，清除劃下的細胞，然后加入低血清培養(yǎng)液（含1%～2%FBS），放入孵箱，37℃,5%CO2孵育。（6）

在0~24h內(nèi)取不同的時間點拍照，通過計算劃痕區(qū)域內(nèi)無細胞區(qū)的面積統(tǒng)計細胞遷移情況。【結(jié)果判定】比較各組劃痕區(qū)域內(nèi)的細胞數(shù)目多少、計算劃痕區(qū)域內(nèi)無細胞區(qū)的大小或面積?！咀⒁馐马椗c模型評價】劃痕法的優(yōu)點：價格低廉，操作簡單，細胞外圍環(huán)境簡單，容易控制。劃痕法的不足：對細胞的要求高，適用的細胞系范圍較窄。劃痕實驗要求細胞本身具有較強的遷移能力，且對無血清的培養(yǎng)環(huán)境有較強的忍受力，因此只適用于上皮、纖維樣細胞系和部分腫瘤細胞系?！静僮鞑襟E】55（二）Transwell（Boyden小室）實驗Transwell準確的說應該是一種實驗技術(shù)，這項技術(shù)的主要材料是Transwell小室或Boyden小室，是一類有通透性的杯狀的裝置，杯子底層的一張有通透性的膜，這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.1～12.0μm，根據(jù)不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonatemembrane）。應用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。（二）Transwell（Boyden小室）實驗561.Matrigel侵襲實驗【基本原理】腫瘤侵襲基底膜被認為是轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腫瘤細胞最初穿過基底膜是它們侵入淋巴系統(tǒng)或血管床的開始，隨后腫瘤細胞通過血行散播或淋巴轉(zhuǎn)移進入靶器官/組織，最終形成轉(zhuǎn)移灶。為了體外分析評估腫瘤細胞的侵襲能力，人們研發(fā)了多個系統(tǒng)來評估細胞侵襲穿過基底膜的能力。一些實驗利用組織的基底膜提取物，例如羊膜、雞絨(毛)膜尿囊膜、晶狀體囊膜和膀胱壁等。然而，由于組織本身的異質(zhì)性，這些基質(zhì)的實驗重復性并不理想。而且，提取這些基質(zhì)通常需要很長時間，技術(shù)上也很復雜。因此，人們研制出了同質(zhì)性更好的細胞外基質(zhì)來用于體外侵襲實驗的研究。其中應用最廣泛的就是Matrigel從一種富含細胞外基質(zhì)蛋白的小鼠Engelbreth–Holm–Swarm肉瘤中提取的可溶性的基底膜。它主要包含層黏連蛋白Ⅳ型膠原、硫酸類肝素蛋白多糖等多種基底膜組分。在實驗室里，Matrigel加工應用起來相對簡單。這部分的侵襲實驗檢測的是細胞黏附在基質(zhì)膠上，侵襲進入和穿過基質(zhì)，繼而朝向趨化因子的方向遷移的能力。這些步驟被證明是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。1.Matrigel侵襲實驗57【操作步驟】（1）Matrigel膠包被小室的制備1）解凍未開封的Matrigel溶液，置于冰上放入冰箱里，至少6h，推薦過夜解凍。遇冷所有的細胞培養(yǎng)板、Transwell小室或Boyden小室、無菌吸量管、小管。除非有所提示，否則所有的步驟都應該在無菌條件下進行。2）搖動瓶子使Matrigel更好溶解。吸取適量Matrigel稀釋到所需要濃度。起始濃度可選擇1.2mg/ml,0.6mg/ml,0.3mg/ml等，溶解于無血清培養(yǎng)基中。吸出5ml待用，剩余Matrigel應立即儲存在–20℃。3）室溫無菌環(huán)境下，小心的吸取Matrigel溶液于小室膜的上方，輕輕轉(zhuǎn)動小室，確保膜的上表面完全被包被住。（6孔板加入300μl，12孔板加入100μl，24孔板加入40μl）。在Matrigel上方非常小心的覆蓋適量無菌雙蒸水（6孔板加入200μl，12孔板加入100μl，24孔板加入50μl）。每組應至少做3個復孔。同時應準備無Matrigel的小室作為對照，以下步驟相同。4）將包被好Matrigel的小室置于37℃細胞培養(yǎng)箱中，通常30min~1h。5）再水化Matrigel層：加入37℃無血清細胞培養(yǎng)基于細胞培養(yǎng)板內(nèi)（6孔板加入600μl，12孔板加入200μl，24孔板加入75μl），孵育Matrigel使其再水化約2h。對照小室同樣進行此步驟的孵育。（2）胰酶消化法從培養(yǎng)瓶中獲取細胞，用含1%FBS的培養(yǎng)基洗滌三遍，再用含1%FBS的培養(yǎng)基懸重細胞，使細胞的濃度達到（1~5）×105個/ml.（3）Matrigel侵襲分析1）在下室中（濾膜下方）加入含有5%~10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，可根據(jù)需要在培養(yǎng)基中下室加入纖維黏連蛋白，濾膜和下室培養(yǎng)基之間應該不存在氣泡。2）在對照孔的膜上方或?qū)嶒灲M的Matrigel上方輕輕加入適量細胞懸液（6孔板加入2ml，12孔板加入1ml，24孔板加入0.25ml）。3）在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育一定時間（根據(jù)細胞遷移能力和實驗要求選擇孵育時間，例如可以選擇12，24，36，72h等）。（4）結(jié)晶紫染色法收集下室細胞，并統(tǒng)計遷移到下室的細胞數(shù)。1）用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞2）從培養(yǎng)板中移去Transwell小室，倒置，風干。3）培養(yǎng)板中加入500μl0.1%結(jié)晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37℃孵育30min后取出，用PBS清洗。4）將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察細胞，照相，計細胞數(shù)。5）在培養(yǎng)板中加入適量33%醋酸，將小室置于其中，使膜浸沒在液體中，振蕩10min后取出小室，將培養(yǎng)板置于酶標儀上測570nm的OD值，間接反應細胞數(shù)?！静僮鞑襟E】58【注意事項與模型評價】（1）常用于Transwell侵襲實驗的細胞培養(yǎng)板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔板為最常用。根據(jù)實驗需要選擇不同孔徑的Transwell小室。（2）Transwell侵襲實驗應選擇有侵襲力的細胞。（3）膜的下室面可涂上纖維黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N，Sigma有售)，這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。（4）常用的染色方法還包括臺肦藍染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。若已將腫瘤細胞用熒光標記，則可收集細胞后用流式細胞術(shù)檢測熒光標記的細胞數(shù)量。（5）也可不用Matrigel包被濾膜，而是直接在上室中加入細胞懸液，在下室中加入血清、某種趨化因子或另一種細胞懸液等，檢測不同因素對細胞遷移和趨化作用的影響。（6）上層培養(yǎng)液：采用無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入0.05%～0.2%BSA；下層培養(yǎng)液：下層常用含5%～10%FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細胞侵襲力而定，侵襲力弱的細胞可適當提高FBS濃度。【注意事項與模型評價】59在抗腫瘤研究中，人們提出了腫瘤多步驟、DNA突變、細胞凋亡、細胞周期核心機制、細胞周期啟動及多條信號轉(zhuǎn)導途徑參與等許多理論和學說。

抗腫瘤藥的研究隨著理論的更新和技術(shù)的進步，已從以核酸等為靶點的殺傷型細胞毒藥轉(zhuǎn)向?qū)δ[瘤新靶點的研究。包括化學預防藥、分化誘導劑、凋亡誘導劑、信號傳導阻滯劑、血管生成抑制劑、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑、生物調(diào)節(jié)劑以及化放療保護劑等。

隨著新型抗癌藥的研究，誕生了許多抗腫瘤藥物實驗方法。在抗腫瘤研究中，人們提出了腫瘤多步驟、DNA突60第1節(jié)腫瘤細胞體外篩選方法

一、抗腫瘤藥體外方法

動物模型在抗腫瘤藥物的評價中起重要的作用，但動物模型費用高，周期長使其不適合大規(guī)模的抗腫瘤藥物評價。因此抗腫瘤藥初步篩選首先應采用腫瘤細胞體外實驗方法，既節(jié)約成本又節(jié)省時間。第1節(jié)腫瘤細胞體外篩選方法

一、抗腫瘤藥體外方法611.MTT法【基本原理】活細胞線粒體中存在的脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）為藍紫色的甲臜；而死細胞此酶消失，MTT不被還原。用DMSO溶解甲臜后，570nm處酶標儀測定其吸光度（OD值）。OD值與活細胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)OD值推測出活細胞的數(shù)目，了解藥物抑制或殺傷腫瘤細胞的能力。1.MTT法62【操作步驟】（1）0.25%胰酶消化對數(shù)生長期細胞，5%～10%NBS的RPMI1640調(diào)細胞濃度50000個/ml。96孔板100ul/孔。設(shè)溶劑對照，每組3-6平行孔。37℃，5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24h，棄上清。（2）加藥物5個10倍稀釋的濃度（溶劑常用的有二甲亞砜和水)，通常為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。（3）細胞連續(xù)培養(yǎng)24～72h，每孔加入10μl5mg/ml的MTT溶液（以無血清培養(yǎng)基配制），繼續(xù)培養(yǎng)4h。（4）吸去上清。加入200μlDMSO，輕輕振蕩以使甲臜完全溶解。570nm處用酶標儀測定OD值。（5）計算抑制率(%)=（對照OD-藥物OD）/對照OD*100%【操作步驟】632.XTT法【基本原理】XTT是MTT的衍生物，經(jīng)過活細胞代謝還原成水溶性的代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物的量與活細胞的數(shù)目成正比，因此利用酶標儀在檢測波長465nm處測定代謝物的OD值可以推測活細胞的數(shù)量。數(shù)據(jù)處理方法同MTT法。2.XTT法64【操作步驟】（1）細胞接種，藥物處理均同MTT方法。（2）藥物處理24～72h后，每孔加50μlXTT溶液（內(nèi)含50μgXTT，5μl10mmol/L的電子偶聯(lián)劑(PMS)）繼續(xù)培養(yǎng)4h。（3）96孔培養(yǎng)板振蕩2～3min后，直接用酶標儀在465nm波長處測OD值?！静僮鞑襟E】65【注意事項】（1）優(yōu)點：XTT代謝產(chǎn)物溶解于水，不需要吸去上清就可測OD值，簡單方便，減少誤差。（2）XTT不易被線粒體酶還原，因此同時加入電子偶聯(lián)劑(PMS)。（3）每孔的XTT量不宜加入太多，高濃度的代謝產(chǎn)物抑制線粒體酶活性。（4）XTT和PMS現(xiàn)用現(xiàn)配?！咀⒁馐马棥?63.染料排斥法檢測藥物對腫瘤細胞的生長抑制【基本原理】活細胞有排斥染料（如伊紅、臺盼藍、苯胺黑等染色的能力，而細胞死亡后由于膜完整性遭到破壞，細胞即被著色。3.染料排斥法檢測藥物對腫瘤細胞的生長抑制67【操作步驟】（1）25ml培養(yǎng)瓶中加入細胞4×104個、受試藥40μl，終體積4ml，（2）5%CO2，37℃培養(yǎng)48～96h。（3）取細胞懸液0.4ml，加0.4%臺盼藍液0.1ml，在室溫作用5min，在15min內(nèi)，細胞計數(shù)板計數(shù)約200個細胞中死細胞（藍色）的個數(shù)?！窘Y(jié)果評定】（1）活細胞率%=（未染色細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。（2）將活細胞率與藥物濃度的對數(shù)作圖，可得到S形劑量反應曲線，計算半數(shù)殺傷濃度（LC50）。（3）當LC50<10μg/ml并能重復時，提示藥物應進一步實驗。【操作步驟】68【注意事項】

藥物殺傷細胞作用可能被低估原因：

（1）存活細胞可能繼續(xù)繁殖，使活細胞率增高。（2）死細胞可能過早地崩解，計數(shù)時已不存在，使死細胞率下降?！咀⒁馐马棥?94.集落形成法測定藥物對腫瘤克隆原細胞的生長抑制作用【基本原理】克隆原細胞指具有持續(xù)增殖能力的細胞。當單個細胞能連續(xù)分裂6代或以上時，其后代所組成的群體（集落）含50個以上細胞。計數(shù)集落可以對克隆原細胞作定量分析。反映了單個細胞增殖潛力，能較靈敏地測定抗腫瘤藥物的活性，目前被認為是一種較理想的檢測方法。常用的集落形成方法可分為貼壁法及半固體培養(yǎng)基法。4.集落形成法測定藥物對腫瘤克隆原細胞的生長抑制作用70【操作步驟】（1）貼壁集落形成：適用于幾乎所有貼壁生長的細胞。1）生長期貼壁細胞一瓶，胰蛋白酶消化成單細胞懸液，活細胞計數(shù)，培養(yǎng)基稀釋成50～100個細胞/ml。2）取直徑33～35mm培養(yǎng)皿（或15ml培養(yǎng)瓶）或6孔板，每組3復孔/皿，受試藥20μl，稀釋后細胞懸液2ml，搖勻，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～14天。3）棄上清，PBS洗2次，2ml/次，無水甲醇固定5min，靜置干燥，用吉姆薩染色或1%結(jié)晶紫染色5～10min后，用自來水沖洗，室溫干燥，鏡下計數(shù)75μm以上的集落?！静僮鞑襟E】71（2）軟瓊脂集落形成：適用懸浮和貼壁生長細胞。

1）計數(shù)對數(shù)生長期細胞，15%NBS培養(yǎng)液配成1000個/ml細胞懸液，37℃溫育。2）取33～35mm培養(yǎng)皿，3復皿，加受試藥20μl。3）取37℃新鮮培養(yǎng)液9份，加沸水浴中融化的5%瓊脂液1份，搖勻，加入平皿，每個1ml，混勻置室溫使瓊脂凝固。4）取預溫的細胞懸液按每9.4ml加5%瓊脂液0.6ml的比例混勻，加入已鋪底層瓊脂的平皿中，每個1ml，置室溫使瓊脂凝固。5）將平皿置5%CO2，37℃孵育箱中培養(yǎng)7～10天。6）鏡下計數(shù)直徑大于75μm（50個細胞以上）的集落。（2）軟瓊脂集落形成：適用懸浮和貼壁生長細胞。72【結(jié)果評定】（1）劑量反應曲線：以集落抑制百分率與劑量對數(shù)作圖，可以得到一條S形曲線并求出藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

（2）亦可計算各加藥組集落形成率?！窘Y(jié)果評定】735、癌細胞分化誘導實驗

【基本原理】癌癥屬于細胞分化異常的疾病。惡性腫瘤存在著明顯的細胞分化受阻。白血病、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)母細胞瘤等可在體外被某些化合物誘導分化為正常細胞或近似正常的細胞。這些發(fā)現(xiàn)為抗腫瘤藥物研究開辟了一條新的途徑。因此，癌的分化治療已成為癌癥研究的重要前沿方向之一。5、癌細胞分化誘導實驗74分化指標包括形態(tài)學變化、及生化功能變化。人早幼粒細胞白血病HL-60細胞的分化誘導實驗HL-60細胞分化為成熟度不同的粒細胞或巨噬細胞

硝基四氮唑藍（NBT）試驗:NBT還原能力應大于50％。

形態(tài)學變化的觀察:成熟粒細胞所占比例越高，說明分化效果越好。

吞噬功能測定:分化誘導劑的吞噬百分率應在50％以上。

分化指標包括形態(tài)學變化、及生化功能變化。75肝癌Bel7402細胞分化誘導實驗【基本原理】肝癌Bel7402細胞甲胎蛋白（AFP）在肝癌中分泌量很高。γ-GT（半乳糖轉(zhuǎn)移酶）在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中活性逐漸上升。白蛋白（ALB）及TAT（酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶）在分化良好細胞下降。在體外測定這些蛋白的含量及活性，用以判斷肝癌細胞的分化程度。

AFP及ALB測定：AFP、ALB放免測定試劑盒說明測定AFP及ALB含量

γ-GT、TAT測定：紫外可見分光光度法。肝癌Bel7402細胞分化誘導實驗76第2節(jié)腫瘤動物模型體內(nèi)篩選方法

1.誘發(fā)腫瘤動物模型實驗法2.自發(fā)腫瘤動物模型實驗法3.移植性腫瘤動物模型實驗法4.轉(zhuǎn)基因動物腫瘤實驗法第2節(jié)腫瘤動物模型體內(nèi)篩選方法1.誘發(fā)腫瘤動物模型77對誘發(fā)腫瘤的評價誘發(fā)性腫瘤的病因與由環(huán)境因素所誘致人癌情況相似。癌細胞增殖動力學在兩者間亦接近，故動物誘發(fā)腫瘤類似人體腫瘤。但人癌原因十分復雜，誘癌劑不清，腫瘤的病理組織學與動物不同，發(fā)生發(fā)展與動物誘發(fā)腫瘤不完全一致。誘發(fā)腫瘤不僅誘發(fā)需時較長，成癌率不高。多數(shù)內(nèi)臟腫瘤不作解剖，難以判斷是否已發(fā)生腫瘤。發(fā)生時間先后、發(fā)展速度個體差異大。加之化學致癌物的來源比較困難，并隨著環(huán)境保護意識的增強對相關(guān)的動物實驗室提出了更高的要求和限止，所以本法不宜作一般抗癌藥物篩選應用.對移植性腫瘤有效的藥物，可用本法進一步驗證其抗癌療效。對誘發(fā)腫瘤的評價78對自發(fā)腫瘤總的評價其腫瘤發(fā)生率與瘤細胞動力學特點與人癌近似，生長較移植腫瘤慢，對藥物敏感度不高，療程較長，故便于進行綜合化療的研究；理論上用帶有自發(fā)腫瘤模型篩選藥物較理想。然而，動物自發(fā)腫瘤的病因取決于的遺傳特性，與人癌病因區(qū)別較大。很難在限定期間內(nèi)得到大量生長均勻的帶瘤動物，各動物腫瘤之間生長速度差異也較大，給評價帶來困難。此類腫瘤常用于特殊目的試驗或作為“二級篩選”模型。

對自發(fā)腫瘤總的評價79對轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型的評價該模型較好地再現(xiàn)了人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的完整變化，包括機體從正常演變?yōu)榘┣安∽冞M而發(fā)展為惡性腫瘤的全過程，該模型也為相關(guān)基因與腫瘤的關(guān)系在整體水平研究和基因藥物的研發(fā)提供了良好的手段。但腫瘤的發(fā)生受到一個或多個基因的協(xié)同調(diào)控的，與轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型不同；該模型同樣存在實驗周期長、腫瘤發(fā)生時間不齊、繁育能力較低以及成本較高等缺點。對轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型的評價80移植性腫瘤實驗法動物移植性腫瘤實驗法是最通用的抗腫瘤方法，比自發(fā)性、誘發(fā)性及轉(zhuǎn)基因動物腫瘤容易造模,成功率高（100％），且能同時獲得大量生長相對均勻腫瘤。一般給藥7-10天，第8-11天解剖動物。觀察指標：一般狀況，體重變化及死亡率，判斷藥物是否有明顯的抑制腫瘤生長的作用，為抗癌藥物臨床療效提供有意義的依據(jù)。動物移植性腫瘤是任何體外試驗不能代替的。移植性腫瘤實驗法動物移植性腫瘤實驗法是最通用的抗腫瘤方法，比81一種藥物未必對各種類型的移植性腫瘤有效，選擇某一瘤株供篩選都可能漏篩藥物。動物腫瘤的生物學特點與人類有較大的差距，動物瘤株惡性程度高，生長迅速，對藥物的敏感性比人類自發(fā)的癌瘤高得多，因此，對動物腫瘤生長有抑制的藥物對人癌不一定有效。本法的命中率低。一種藥物未必對各種類型的移植性腫瘤有效，選擇某一瘤株供篩選都82篩選藥物時最好采用三種瘤株，即肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株腫瘤。國內(nèi)用肉瘤S180、艾氏癌腹水型EAC和L615白血病，目前L615往往以P388或L1210小鼠白血病株取代。我國對新藥在第一輪篩選有效的基礎(chǔ)上，推薦人癌異種模型進行第二輪篩選，即人癌進行T細胞免疫缺陷或免疫抑制裸鼠異種移植模型。篩選藥物時最好采用三種瘤株，即肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株腫瘤831.1動物選擇

常用小鼠、大鼠和地鼠。每批實驗用同一性別（但乳癌、卵巢癌、宮頸癌等必須用雌性）。1.2腫瘤移植(1)一般要求

無菌、低溫（消毒不嚴、瘤塊污染常是接種失敗的主要原因）

接種部位:

皮下接種(右前肢腋);肌肉接種(大腿肌肉部);腹水型接種(腹腔)。1.1動物選擇84(2)瘤塊制備：取接種7-10天、生長旺盛且無潰破瘤源。消毒，切開皮膚、瘤生長良好（無壞死或液化），放入無菌平皿，剪成2-3mm3小塊。平皿應置于冰上。無菌套管針抽吸或向套管針內(nèi)塞進一小瘤塊。一般應在30min內(nèi)接種完畢。(3)瘤細胞懸液的制備：數(shù)個瘤塊混合，剪成小塊，用玻璃組織勻漿器研磨，生理鹽水適量稀釋成l：3或l：4的瘤細胞懸液。(2)瘤塊制備：取接種7-10天、生長旺盛且無潰破瘤源。消毒85(4)腹水型腫瘤懸液的制備1)抽取腹水：選擇接種后7-10天瘤源動物，腹水應為乳白色濃稠液體(如黃色或有大量紅細胞則棄去)。2)細胞計數(shù)：用白細胞計數(shù)法計瘤細胞總數(shù)。3)接種：腹水用無菌生理鹽水或含葡萄糖的平衡鹽水(如Hanks液、Gey液等)稀釋至適當?shù)臐舛龋?×107/ml

），ip每鼠0.2ml。(5)白細胞瘤株的接種：腹水型白細胞瘤如P388及L1210的接種同腹水型腫瘤接種法。(4)腹水型腫瘤懸液的制備861.3移植性動物腫瘤的質(zhì)量鑒定(1)每年進行一次實驗動物瘤株的組織學檢查。(2)接種前置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)以檢查細菌，霉菌;在接種和傳代過程中，必須嚴格無菌操作，防止感染。(3)腫瘤生長潛力的檢查1)實體瘤：若對照組中20％腫瘤<400mg或平均重量<1g；大鼠腫瘤平均重量小于2g，作廢。2)腹水型腫瘤：對照組平均生存率應在規(guī)定范圍內(nèi)。1.3移植性動物腫瘤的質(zhì)量鑒定87(4)死亡分析：動物體重減輕、明顯的感染等都會影響實驗的可靠性，必須追究原因（是否給藥劑量過大等）。(5)陽性對照：通常選用對所選瘤株敏感的已知抗腫瘤藥作陽性對照。如S180、EAC皮下型可用環(huán)磷酰胺20～30mg／(kg·d)；L615可用5-Fu25mg/(kg·d)。在同類型化合物抗腫瘤試驗時，最好使用同類型臨床有效的藥物。(4)死亡分析：動物體重減輕、明顯的感染等都會影響實驗的可靠881.4待篩藥物的給藥途徑化學合成藥、抗生素濾液及植物藥的提取物，通常用ip、sc或ig給藥，其他途徑有im、iv等。1.5劑量的選擇一日量可用l/3～1/5LD50劑量參考同類藥物臨床劑量參考同類藥物動物劑量預實驗,開始有動物死亡計量的l/3～1/5為一日量1.4待篩藥物的給藥途徑891.6動物分組隨機小鼠體重相差不超過4g；每組小鼠平均體重相差不宜超過1g；每組大鼠平均體重相差不宜超過5g。1.6動物分組901.7療效評價(1)實體瘤療效評價在治療期間給藥組死亡超過20％，或平均體重(去瘤后)下降(自身對照)超過15％者，表示藥物毒性反應，減少劑量重新試驗。瘤重抑制率％=(1-T／C)×100％中草藥抑制率大于30％，合成藥大于40％，并經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著差異時，認為有苗頭，繼續(xù)重復，連續(xù)3次，療效穩(wěn)定，則評定此藥有一定療效。1.7療效評價91(2)腹水型腫瘤療效評價：逐日記錄動物死亡情況。對照組通常2-3周內(nèi)死完。如對照組動物7天內(nèi)死亡≥20％；或20％存活4周以上，實驗作廢。治療組觀察時間一般為30天或60天(生存超過此時限者，仍按30天或60天計算)。分別記錄對照組和治療組的平均生存時間，按下列公式計算生命延長率：

生命延長率％=(T／C—1)×100％非腹腔給藥時生命延長率大于50％，或腹腔給藥生命延長率大于75％，并經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著差異時，認為有苗頭，需繼續(xù)試驗。連續(xù)3次，療效穩(wěn)定，則評定此藥有一定療效。(2)腹水型腫瘤療效評價：921.8瘤株的選擇目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多首先經(jīng)動物移植性腫瘤篩選而發(fā)現(xiàn)的，從尋找新藥角度看來，按照我國目前條件和情況，篩選細胞毒類藥物時可選用肉瘤Sl80腹水型或?qū)嶓w型、艾氏癌腹水型(EAC)或?qū)嶓w型(ESC)、肝癌Hep腹水型(HAC)或?qū)嶓w型(H22)、Lewis肺癌LL、白血病L1210和P388、黑色素瘤B16、肉瘤S37、腸癌C38、C26及Walker癌肉瘤W256等。1.8瘤株的選擇93從天然產(chǎn)物中尋找新抗腫瘤藥物可選用S180實體型、ESC、LL、L1210和P388、B16、HepA或S、腸癌C26、C38、子宮頸癌U14、白血病L615以及W256等。企圖用一種模型去篩選各種不同類型的新藥，顯然是不恰當?shù)?，因為各種動物移植瘤對抗癌藥物的敏感性不一樣。從天然產(chǎn)物中尋找新抗腫瘤藥物可選用S180實體型、ESC、L941.9腫瘤的低溫保存冷凍保存液可以改變細胞或瘤塊的滲透性，減少細胞內(nèi)的水分，防止水分在細胞內(nèi)產(chǎn)生大量冰晶，如含15％的甘油或10％二甲基亞砜的培養(yǎng)基。凍存時，慢凍（引起的細胞損傷最?。?，損傷是由于在極少量未結(jié)冰水中保留了高濃度電解質(zhì)引起，因此細胞從0～-20C間冷凍速度要緩慢，一般以每分鐘降1C為宜。然后再將安瓿放置于干冰(固體CO2)或液氮中保存。一般可保存6個月左右。速融，凍存管迅速放入38-40度水浴，RPMI1640液洗滌1-2次，接種。1.9腫瘤的低溫保存951.10移植性腫瘤實驗法舉例l.l0.1小鼠腹水型L1210模型【基本原理】將小鼠白血病L1210瘤細胞懸液ip小鼠，給予不同劑量抗癌活性藥物，可延長荷瘤宿主的生命?！静僮鞑襟E】(1)無菌取DBA/2小鼠約7d的L1210腹水，生理鹽水配制成瘤細胞懸液，細胞數(shù)為5×106/ml，ip小鼠0.2ml(L1210細胞105個)。每組6-10只動物。（雄性,l8-22g，雌性17-21g，每次實驗均用同一性別），接種當天為d0。1.10移植性腫瘤實驗法舉例96

(2)

d1稱重、隨機分組，給藥，包括陰性對照(溶劑)及陽性對照藥，一般用腹腔注射(方案可有多種：僅給1次，次日給藥；每日一次，連續(xù)7天；于第1、5天或第1、5、9天每隔4天給藥一次等)。記錄30天內(nèi)各組動物的死亡情況，至第30天，統(tǒng)計各組動物的平均死亡率?！窘Y(jié)果計算】根據(jù)公式計算試藥對L1210的延長生命率。(L1210平均存活期8-1ld。一般腹水型腫瘤的實驗觀察期為30d，未死亡動物以30d計)。(2)d1稱重、隨機分組，給藥，包括陰性對照(溶劑)97【方法評價】(1)本法也適用P388、EAC、HepA、w256及S180等腹水型移植性腫瘤模型。(2)給藥組第5天動物存活數(shù)應大于65％，否則表示藥物劑量過大。(3)若陰性對照組動物在15d內(nèi)仍不死亡，說明實驗失敗，應分析原因，重做?！痉椒ㄔu價】981.10.2實體瘤模型以肉瘤S180皮下接種【基本原理】皮下接種同種宿主前肢腋下S180，給予抗癌活性的藥物，可以抑制腫瘤在體內(nèi)的生長?！静僮鞑襟E】(1)無菌取接種于昆明小鼠約7天的S180腹水或S180腫瘤。

S180腫瘤無菌剔除包膜和壞死部分，選取完好的瘤塊，置于玻璃勻漿器內(nèi)，加入適量的生理鹽水，計數(shù)，以生理鹽水配制成懸液（1×107／ml），0.2ml/只接種于小鼠前肢腋下，10只一組（雄性體重l8-22g；雌性17-21g）。

1.10.2實體瘤模型以肉瘤S180皮下接種99(2)第2天（d1）稱重、分組、給藥。(3)第11天，動物稱體重，取腫瘤，稱重，最計算抑瘤率?！窘Y(jié)果計算】按上式計算樣本對S180的抑瘤率?！咀⒁馐马棥?1)本法適用于Hep、w256及C26等實體型模型。(2)原則上,陽性對照組的腫瘤抑瘤率應>80％。陰性對照組腫瘤為2g左右。(3)試驗組動物體重不低于原始體重的20％，否則表示試藥劑量過高，需降低劑量重試。(2)第2天（d1）稱重、分組、給藥。1001.10.3肌肉接種大鼠Walker癌肉瘤W256模型【操作步驟】(1)Wistar大鼠，55-65g。后腿肌內(nèi)接種瘤細胞懸液0.2ml(約2-4×106個瘤細胞),每組用6-10只動物.(2)接種分組給藥同前。至第8-11天，處死動物，將雙側(cè)后肢從髓關(guān)節(jié)處剪下，分別稱重，荷瘤肢重減去正常肢重即為瘤重?！窘Y(jié)果計算】按荷瘤宿主瘤重抑制率公式計算。1.10.3肌肉接種大鼠Walker癌肉瘤W256模型101[注意事項](1)本法也適用于S180及EAC等腫瘤。(2)接種用瘤源有兩種：一種取用腹水型瘤源，取傳代6-8天的瘤源，抽出的腹水應帶有血性；另一種取用皮下接種的腫瘤以勻漿法制成瘤細胞懸液。(3)對照組肌肉型平均瘤重為3-5g；皮下型平均瘤重為3-12g；腹水型平均生存l0-14天。(4)d7給藥動物存活率>65％,否則劑量過大。[注意事項]1021.10.4足趾皮下接種小鼠Lewis肺癌模型【基本原理】惡性程度較高，受體鼠為C57BL/6，SC、IM接種對藥物的敏感性較低，自發(fā)轉(zhuǎn)移肺。接種于后足趾皮下后，待腫瘤生長10d，切除帶瘤足趾稱重，計算抑制率?！静僮鞑襟E】取皮下接種8-12d的腫瘤，制成1×107/ml懸液,足趾皮下接種5×105/0.02ml，接種于C57BL/6,18-24g，6-7Wk。給藥后，次日處死動物，將帶瘤后足趾從足關(guān)節(jié)處剪下，分別稱取荷瘤足趾重，與陰性對照組比較，計算抑瘤率?！窘Y(jié)果計算】計算腫瘤抑制率.1.10.4足趾皮下接種小鼠Lewis肺癌模型103【注意事項】(1)Lewis肺癌由于其接種的部位不同，可觀察抑瘤率、生命延長率、自發(fā)肺轉(zhuǎn)移。(2)Lewis肺癌對環(huán)磷酰胺及亞硝脲敏感，對5-Fu及博來霉素的敏感性稍差。(3)Lewis肺癌的足趾接種具有兩種意義：一是直接取荷瘤的足趾測算樣本對原發(fā)灶的抑瘤率；繼續(xù)給藥又可觀察樣本對自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的效果。(4)本實驗只適用于宿主為近交系的腫瘤模型，因接種的細胞量偏少，若應用于非近交系動物，腫瘤的生長將會出現(xiàn)較大的偏差，結(jié)果難以統(tǒng)計?！咀⒁馐马棥?041.10.5人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型【基本原理】裸鼠又稱無胸腺小鼠，具有先天性胸腺缺失；胸腺依賴性免疫功能缺乏，其T細胞功能接近于零，但B細胞功能基本正常，體內(nèi)不具排斥反應，故是人體腫瘤異種移植的理想宿主。異種移植于裸鼠體內(nèi)的人體腫瘤仍保持其原有的組織形態(tài)及生化功能，以及特有的染色體組型和對抗腫瘤藥原有的敏感性。一般認為人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型對抗癌藥的反應與臨床有較好的相關(guān)性，對臨床療效有重要的參考價值。1.10.5人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型105【操作步驟】

(1)人體腫瘤異種移植于裸鼠的瘤源：

一是已建株的人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型，腹水型或?qū)嶓w型，與移植性動物腫瘤模型一樣進行操作。

二是培養(yǎng)的各種病理類型人體腫瘤細胞。

(2)經(jīng)一定的潛伏期，可見腫瘤生長。待腫瘤增殖至可觸及時(瘤結(jié)節(jié)約400mg)，將動物隨機分組，進行治療。亦可在腫瘤接種后次日即分組治療?！静僮鞑襟E】106

【結(jié)果計算】(1)計算給藥組腫瘤抑制率、生命延長率。其計算方法同移植性動物腫瘤模型。(2)裸鼠因皮膚無毛，可便于用卡尺從體外測量腫瘤的體積，易于動態(tài)觀察腫瘤的生長狀態(tài)，比較治療組和對照組腫瘤增殖曲線的變化。每次測量腫瘤的長徑(L)和短徑(W)根據(jù)下列公式計算腫瘤體積(V)：V=(L×w2)/2?！窘Y(jié)果計算】107【注意事項】(1)裸鼠因T細胞免疫缺陷的特性，故對外界的環(huán)境非常敏感，因此裸鼠一定要飼養(yǎng)于無特殊病原體(SPF)的環(huán)境，至少需飼養(yǎng)于層流架內(nèi)，其飼養(yǎng)籠需附帶有濾膜的蓋。所接觸和使用的器具、飼料、飲水、墊料、籠具均預先用高壓滅菌處理過。所用的試藥也應無菌處理。實驗操作也應在層流柜內(nèi)進行。(2)價格比較昂貴，實驗所需代價高。一般要在試藥通過動物移植性腫瘤有效的基礎(chǔ)上再進行本實驗的試驗。【注意事項】108(3)異種移植于裸鼠體內(nèi)的人體腫瘤因仍保持其原有的腫瘤特性，故其生長周期相對較動物腫瘤模型為長，因此，有關(guān)給藥的方案，尤其是給藥的時間和周期因瘤株而異?？鼓[瘤藥物實驗法課件1091.10.6小鼠腎囊膜下腫瘤移植法·1.10.7抗轉(zhuǎn)移模型的舉例1.10.7.1Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移模型1.10.7.2B16小鼠黑色素瘤人工肺轉(zhuǎn)移模型1.10.7.3小鼠Hep肝癌脾內(nèi)移植后肝轉(zhuǎn)移模型1.10.8癌侵襲的動物模型1.10.8.1癌骨侵襲大鼠walker-256模型1.10.8.2腎侵襲小鼠宮頸癌U14模型1.10.9原位移植癌動物模型1.10.9.1小鼠膠質(zhì)母細胞瘤G422腦原位瘤試驗法‘1.10.9.2大鼠肝癌BERH一2肝原位移植癌試驗法1.10.9.3人胃癌SGC一7901裸鼠原位接種模型，1.10.10W256肝內(nèi)接種介入治療的模型1.10.11癌分化誘導的動物模型等。1.10.6小鼠腎囊膜下腫瘤移植法·110抗腫瘤藥物實驗法課件111四、轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型（Tumormodelsoftransgenicanimal）是指通過重組DNA技術(shù)將外源腫瘤基因或相關(guān)基因?qū)雱游锶旧w基因組，使之穩(wěn)定表達并能遺傳給后代的一類腫瘤動物模型。轉(zhuǎn)基因方法主要有顯微注射法、精子載體法、電轉(zhuǎn)移、胚胎干細胞移植法、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法、人工酵母染色法等多種方法。用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的腫瘤模型可為腫瘤研究提供理想的動物模型，為深入研究其發(fā)病機制以及基因藥物的等創(chuàng)造了前所未有的條件，為人類精確地研究基因與疾病的相關(guān)關(guān)系提供了可能。但轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型也存在一定的穩(wěn)定性，長期繁育傳代過程中會發(fā)生性狀的改變，甚至丟失。胚胎或精子的冷凍保存技術(shù)的應用可避免這種現(xiàn)象的發(fā)生。并在發(fā)育和研究中加強對動物腫瘤生長的生物學特性觀察，同時利用PCR技術(shù)檢測外源腫瘤基因在動物體內(nèi)的表達，以防外源腫瘤基因的丟失。（一）乙型肝炎病毒（HBV）轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型（二）乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型四、轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型112

三、體外腫瘤細胞遷移、侵襲能力檢測模型（一）細胞劃痕實驗（Woundhealingassay）【基本原理】上皮細胞，成纖維細胞，腫瘤細胞等，在生理狀態(tài)下，常形成單層或者復層上皮細胞。在病理狀態(tài)下，細胞遷移的時候則以側(cè)向運動為主。細胞劃痕實驗是將細胞單層培養(yǎng)在培養(yǎng)板上，待細胞融合后機械性地使小片細胞脫落，然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞，觀察細胞向無細胞的劃痕區(qū)域遷移情況的實驗，很好的模擬了這種側(cè)向遷移運動，一直被用來檢測細胞的遷移能力。三、體外腫瘤細胞遷移、侵襲能力檢測模型113【操作步驟】（1）

準備：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和Marker筆操作前要在超凈臺內(nèi)紫外照射30min。（2）

用Marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線（3）

向孔中加入約106個細胞，因細胞增殖能力不同而略有不同，37℃,5%CO2孵育過夜，使細胞貼壁，鋪滿板底