遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)養(yǎng)殖用金藻培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范(報(bào)批稿)

ICSFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加ICS號(hào)FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類(lèi)號(hào)FORMTEXTDBFORMTEXT21DBFORMTEXT21/FORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXTFORMTEXT水產(chǎn)養(yǎng)殖用金藻培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程FORMTEXTTechnicalSpecificationforculturingofChrysophytausinginaquacultureFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)FORMDROPDOWNFORMTEXT（本稿完成日期：2011-11-15）FORMTEXTXXXX–FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施FORMTEXT遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省海洋與漁業(yè)廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王笑月、李文姬、張明、陳遠(yuǎn)、李大成、李石磊、王慶志。本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)附錄A、C為資料性附錄，附錄B為規(guī)范性附錄。水產(chǎn)養(yǎng)殖用金藻培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)給出了水產(chǎn)養(yǎng)殖常用金藻培養(yǎng)的術(shù)語(yǔ)和定義；水質(zhì)條件和設(shè)施設(shè)備；消毒方法；培養(yǎng)液的配制；藻種來(lái)源；培養(yǎng)方法；日常管理和敵害生物的防治方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于球等鞭金藻OA-3011（IsochrysisgalbanaParkeOA-3011）、湛江等鞭金藻（Isochrysiszhangjiangensis）、綠色巴夫藻（Pavlovaviridis）的培養(yǎng)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB11607漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)NY5052無(wú)公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)NY5071無(wú)公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。單種培養(yǎng)不排除細(xì)菌存在條件下的單一藻種的培養(yǎng)。接種在無(wú)污染的條件下，把選中的藻種放入新備好的培養(yǎng)基中的操作。封閉式培養(yǎng)是將藻類(lèi)在封閉的玻璃瓶或其它封閉透明的容器中培養(yǎng)。容器除了充氣管、加液管和藻液抽出管外，不與外界接觸。封閉式培養(yǎng)不容易被污染。開(kāi)放式培養(yǎng)是將藻類(lèi)在敞開(kāi)的容器中培養(yǎng)。這種培養(yǎng)方式下藻類(lèi)的繁殖比較快，但是容易被污染。一次性培養(yǎng)指在有限容積的培養(yǎng)容器中，加入定量培養(yǎng)液，接入藻種，藻細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖達(dá)到較高的密度時(shí)，不加入或不更換培養(yǎng)液，一次性全部收獲或一次性全部用于下一級(jí)接種的培養(yǎng)方式。水質(zhì)條件和設(shè)施設(shè)備水質(zhì)條件應(yīng)符合GB11607和NY5052要求。設(shè)施設(shè)備室外海水處理設(shè)施室外海水處理主要設(shè)施包括蓄水池、沉淀池、過(guò)濾設(shè)備、抽水泵及輸水管道。清洗消毒間用于清洗和消毒培養(yǎng)容器及消毒海水的操作空間。配有水槽、自來(lái)水、三角燒瓶、培養(yǎng)容器放置架、電爐或煤氣灶等。藻種間進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液的配制及一級(jí)藻種培養(yǎng)的空間。要求光線(xiàn)充足；配有顯微鏡、藥品柜、冷藏柜、有關(guān)化學(xué)試劑和藥品、天平、三角燒瓶（容積一般為5000mL～10000mL）等一級(jí)培養(yǎng)容器、藻種培養(yǎng)架、控溫設(shè)施等。餌料培養(yǎng)間主要用于金藻的大面積培養(yǎng)，也用于藻種的二級(jí)培養(yǎng)。要求光線(xiàn)充足；配有處理水池、二級(jí)培養(yǎng)容器、三級(jí)培養(yǎng)池、水泵、水管、水桶、水舀、攪拌耙、有關(guān)化學(xué)試劑和藥品、天平、量筒、稱(chēng)量操作臺(tái)、溫度計(jì)、消毒盆、耐酸堿手套、遮光簾及取暖設(shè)施等。餌料培養(yǎng)間規(guī)模的大小應(yīng)根據(jù)育苗養(yǎng)殖水體而定?！幚硭兀河糜谙咎幚砣?jí)培養(yǎng)用海水。應(yīng)設(shè)有排污閥、進(jìn)水管、海水輸出設(shè)備（如水泵、出水閥）等?！?jí)培養(yǎng)容器：采用50000mL～100000mL光生物反應(yīng)器或容量較大且透光較好的玻璃瓶、聚乙烯桶、塑料袋等。有的容器需配有攪拌耙?！?jí)培養(yǎng)池：用于金藻的三級(jí)培養(yǎng)。通常為水泥池，深度一般0.7m～1.0m，容積5m3～20m3；培養(yǎng)池應(yīng)設(shè)有排污閥，配有攪拌耙?！眉八埽褐饕糜谳斔拖竞Ｋ疤砑尤?jí)培養(yǎng)液。水泵采用1.5吋～2.0吋自吸泵或潛水泵等，實(shí)際流量以6m3∕h～10m3∕h為宜，水管采用無(wú)毒聚乙烯軟管。消毒方法一級(jí)培養(yǎng)用海水及容器的消毒將適量海水注入三角燒瓶，然后用淡水清洗瓶口及外壁，擦干瓶底水珠，置于電爐或燃?xì)庠钌现蠓?min左右，再用無(wú)菌紙蓋和橡皮套封口，冷卻至室溫后備用。二級(jí)培養(yǎng)用海水及容器的消毒二級(jí)培養(yǎng)用海水的消毒采用燒瓶、搪瓷桶、茶爐、專(zhuān)用海水消毒爐等將海水煮沸消毒，冷卻至室溫后使用。二級(jí)培養(yǎng)容器的消毒培養(yǎng)容器及攪拌耙可于稀釋5～10倍的鹽酸中浸泡消毒2h以上，倒凈酸水，用煮沸并冷卻至60℃以下的水沖洗2遍，冷卻后使用。三級(jí)培養(yǎng)用海水及培養(yǎng)池的消毒三級(jí)培養(yǎng)用海水的消毒消毒化學(xué)藥品應(yīng)符合NY5071要求。通常采用次氯酸鈉作為消毒劑。方法是：按1m3海水加入含20mg～40mg有效氯的次氯酸鈉液消毒處理6h～24h，然后按1m3加入25g～55g硫代硫酸鈉還原，并用碘化鉀淀粉試劑（配制與余氯檢測(cè)見(jiàn)附錄A）或碘化鉀淀粉試紙測(cè)試，無(wú)余氯后才可使用。用于還原余氯的硫代硫酸鈉量隨次氯酸鈉有效氯的變化而變化，添加量應(yīng)適量，不宜超量。三級(jí)培養(yǎng)池的消毒用稀釋10～20倍的次氯酸鈉液均勻地抹洗培養(yǎng)池池壁、池底及攪拌耙2遍，消毒2h以上，再用還原好（無(wú)余氯）的三級(jí)海水沖洗后即可使用。也可直接用未還原的三級(jí)消毒處理水（處理方法見(jiàn)5.3.1）浸泡消毒6h～24h。其它消毒——溫度計(jì)、稱(chēng)量用天平、藥匙等可采用70%～75%酒精消毒?！患?jí)、二級(jí)培養(yǎng)時(shí)量取營(yíng)養(yǎng)鹽母液用的刻度吸管可用淡水煮沸10min左右消毒?！僮魅藛T日常洗手、操作臺(tái)、培養(yǎng)架等可用稀釋的苯扎溴銨溶液消毒?！眉八芸捎梦催€原的三級(jí)消毒處理水在水泵及水管內(nèi)循環(huán)5min～10min，然后停留6h～24h消毒。——耐酸堿手套表面、水桶、水舀等可用稀釋的鹽酸或稀釋的次氯酸鈉液消毒，但鹽酸與次氯酸鈉不可同時(shí)使用。培養(yǎng)液的配制一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)液配制要求——所用藥品和試劑應(yīng)達(dá)到或高于化學(xué)純?！渲迫^(guò)程應(yīng)在潔凈操作間內(nèi)完成，操作時(shí)認(rèn)真消毒，保證無(wú)污染?！渲坪玫哪敢簯?yīng)遮光冷藏保存?zhèn)溆谩Ｅ渲品椒ò锤戒汢金藻培養(yǎng)液配方將營(yíng)養(yǎng)鹽成分（包括檸檬酸鐵銨、磷酸二氫鉀、尿素、硝酸鈉）及維生素成分（包括維生素B1和維生素B12）用蒸餾水或純凈水各配成1000倍的母液，使用時(shí)按每升消毒海水添加1mL營(yíng)養(yǎng)鹽母液+1mL維生素母液而配成一、二級(jí)培養(yǎng)液。三級(jí)培養(yǎng)液配制要求——所用藥品可用無(wú)污染的農(nóng)用化肥?！渲迫^(guò)程應(yīng)認(rèn)真消毒，保證無(wú)污染。配制方法按附錄B金藻培養(yǎng)液配方直接稱(chēng)量營(yíng)養(yǎng)鹽、維生素，投入還原好（無(wú)余氯）的三級(jí)海水中，攪勻即可。藻種來(lái)源藻種引進(jìn)——從有資質(zhì)的海洋微藻保種單位引進(jìn)?！愵?lèi)育苗用藻種應(yīng)在需用餌料的2～3個(gè)月前引進(jìn)，其他水產(chǎn)養(yǎng)殖用藻種根據(jù)實(shí)際情況而定。——引種數(shù)量按金藻每7d成倍增加的速度，根據(jù)水產(chǎn)養(yǎng)殖水體大小、餌料需要量等推算確定。藻種提純提純方法——在適量的培養(yǎng)液中加入1%～1.5%瓊脂，加熱將瓊脂溶化。然后按照微生物學(xué)中固體培養(yǎng)基的制作方法滅菌、倒平板?！傊鋮s后，在無(wú)菌操作臺(tái)上將少量金藻老藻液用無(wú)菌接種環(huán)或接種棒等涂于瓊脂培養(yǎng)基表面。——將接種好的培養(yǎng)皿置于最適光照、溫度下培養(yǎng)（金藻培養(yǎng)最適生態(tài)條件見(jiàn)附錄C）?！?jīng)過(guò)10d～20d，在培養(yǎng)基上將會(huì)長(zhǎng)出相互間隔的藻落。在無(wú)菌操作臺(tái)上用解剖鏡選出優(yōu)勢(shì)、獨(dú)立、無(wú)霉菌藻落，用無(wú)菌牙簽或接種針等將其挑入至適量培養(yǎng)液中培養(yǎng)。提純次數(shù)藻種每年至少應(yīng)提純1次。培養(yǎng)方法一級(jí)藻種培養(yǎng)培養(yǎng)方式為封閉式單種培養(yǎng)。培養(yǎng)方法——按5.1方法消毒三角燒瓶和適量海水，冷卻至室溫備用?！?.1.2方法配制培養(yǎng)液——將藻種與培養(yǎng)液按1:1～1：5比例接種?！?jīng)過(guò)5d～15d的培養(yǎng)后，藻液顏色較深、密度較大時(shí)應(yīng)及時(shí)添加新的培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)；滿(mǎn)瓶的應(yīng)及時(shí)分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。要求金藻培養(yǎng)應(yīng)在其最適生態(tài)條件(見(jiàn)附錄C)下培養(yǎng)；操作過(guò)程中應(yīng)認(rèn)真消毒，確保無(wú)污染。二級(jí)藻種培養(yǎng)培養(yǎng)方法——按5.2方法消毒海水、培養(yǎng)容器及攪拌耙——按6.1.2方法配制培養(yǎng)液?！獙⒁患?jí)藻種與培養(yǎng)液按1:3～1:10比例接種，進(jìn)行一次性培養(yǎng)。要求按8.1.3要求。三級(jí)培養(yǎng)培養(yǎng)方式為開(kāi)放式單種培養(yǎng)。培養(yǎng)方法——按5.3方法消毒處理并還原海水、消毒三級(jí)培養(yǎng)池及攪拌耙。——按6.2.2方法——用消毒過(guò)的水泵或?qū)Ｓ幂斔艿缹⑴囵B(yǎng)液注入消毒好的三級(jí)培養(yǎng)池中(泡池消毒的可在原池直接還原并配成營(yíng)養(yǎng)液使用)。——將二級(jí)藻種與培養(yǎng)液按1:5～1:20比例接種于三級(jí)培養(yǎng)池中培養(yǎng)?！臃N數(shù)日后，當(dāng)藻液顏色明顯變深（藻細(xì)胞密度≥150×104cell/mL），經(jīng)鏡檢無(wú)敵害生物污染時(shí)，應(yīng)及時(shí)添加新的培養(yǎng)液。要求三級(jí)接種要求——接種時(shí)應(yīng)鏡檢二級(jí)藻種，無(wú)污染的才可用于接種?！獞?yīng)在上午進(jìn)行接種操作。——貝類(lèi)育苗中初次接種時(shí)間應(yīng)提前于預(yù)計(jì)投餌時(shí)間10d左右?！Y(jié)合養(yǎng)殖動(dòng)物的餌料需要情況每日或隔日接新種。其它要求按8.1.3要求；并且攪拌耙為每個(gè)培養(yǎng)池專(zhuān)用，未經(jīng)消毒不可混用。日常管理一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)的日常管理攪拌對(duì)于沒(méi)有充氣的培養(yǎng)，可通過(guò)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶或用攪拌耙攪拌等方法使培養(yǎng)容器內(nèi)藻液充分混合，每日早、中、晚?yè)u瓶或攪拌至少各1次。調(diào)節(jié)溫度定時(shí)檢查溫度，使其始終保持在最適范圍內(nèi)。調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度根據(jù)日照強(qiáng)度變化采用布簾、人工光源等調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，使其在最適范圍內(nèi)。防止陽(yáng)光直射及光照太弱，經(jīng)常將強(qiáng)光照區(qū)及弱光照區(qū)的藻種調(diào)換位置。調(diào)節(jié)酸堿度對(duì)生長(zhǎng)特別旺盛的pH值偏高的藻種調(diào)節(jié)pH值，使其在最適范圍內(nèi)。鏡檢與肉眼觀察——定期用顯微鏡檢查，掌握藻種生長(zhǎng)繁殖情況是否良好。發(fā)現(xiàn)混種或被敵害生物等污染的藻液應(yīng)棄之，并及時(shí)再接種培養(yǎng)，補(bǔ)充空缺?！咳杖庋塾^察藻液，正常的藻液應(yīng)沉淀較少、顏色每日變深、有明顯聚集現(xiàn)象等。如果發(fā)現(xiàn)異常，應(yīng)及時(shí)鏡檢，發(fā)現(xiàn)混種或被敵害生物等污染的藻液應(yīng)棄之；若無(wú)污染，按附錄C最適生態(tài)條件調(diào)整溫度、光照、pH值及營(yíng)養(yǎng)，并增加搖瓶或攪拌次數(shù)。三級(jí)培養(yǎng)的日常管理攪拌每日用攪拌耙攪拌培養(yǎng)池內(nèi)藻液3～4次，既要攪拌徹底又要仔細(xì)操作，避免藻液濺入鄰池。調(diào)節(jié)溫度定時(shí)檢查藻液溫度，使其盡量保持在最適范圍內(nèi)?？捎门瘹?、加熱線(xiàn)、開(kāi)窗通風(fēng)等方法調(diào)節(jié)溫度。調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度在白天用布簾等調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，使其盡量保持在最適范圍內(nèi)。肉眼觀察每日肉眼觀察藻液，對(duì)顏色變灰暗、變蒼白的藻液應(yīng)立即去除，并及時(shí)再接種培養(yǎng)，補(bǔ)充空缺。每日鏡檢——每日鏡檢金藻生長(zhǎng)繁殖情況是否良好，有無(wú)敵害生物污染等。如有大量敵害生物污染的，立即去除，并及時(shí)再接種培養(yǎng)，補(bǔ)充空缺?！_定擴(kuò)大培養(yǎng)藻液：新接藻種（接種后3d～7d）、鏡檢無(wú)敵害生物污染的主要用于擴(kuò)種，即繼續(xù)添加培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)?！_定投餌藻液：三級(jí)培養(yǎng)池培養(yǎng)的新鮮藻液、細(xì)胞密度≥120×104cell/mL、鏡檢無(wú)污染的用于投餌。在餌料足夠用的情況下，宜選擇10d以?xún)?nèi)的新鮮藻液投喂，對(duì)老藻液特別是超過(guò)15d的宜棄之?！_定需要對(duì)敵害生物進(jìn)行殺滅處理的藻液：如果餌料供應(yīng)緊張，可對(duì)顏色正常、密度正常，但鏡檢有少量敵害生物污染的三級(jí)藻液進(jìn)行處理（處理方法見(jiàn)10.2），殺滅敵害生物，待藻細(xì)胞恢復(fù)后再添加培養(yǎng)液培養(yǎng)。每日記錄每日記錄鏡檢情況、接種、擴(kuò)種、投餌等情況。敵害生物的防治敵害生物的預(yù)防——培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)原生動(dòng)物等敵害生物應(yīng)以預(yù)防為主?！鳝h(huán)節(jié)應(yīng)嚴(yán)格操作，認(rèn)真消毒，確保一、二級(jí)藻種無(wú)污染；確保整個(gè)三級(jí)培養(yǎng)無(wú)人為操作污染?！獙?duì)金藻的三級(jí)接種應(yīng)有計(jì)劃進(jìn)行，應(yīng)每日或隔日有新接藻種。——增加一級(jí)、二級(jí)藻種數(shù)量及密度，加大三級(jí)接種時(shí)藻液密度。——在保證餌料能正常供應(yīng)的前提下及時(shí)將時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（三級(jí)接種后15d以上）的老藻液棄掉不用?！?jí)培養(yǎng)應(yīng)每日鏡檢，及時(shí)發(fā)現(xiàn)情況，及時(shí)處理。敵害生物的處理方法酸化處理法通常傍晚進(jìn)行酸化。用鹽酸（鹽酸與淡水比例為1：1～1：10）使藻液pH值降至3～4,經(jīng)6h～12h后用NaOH水溶液中和之，使其pH值恢復(fù)至7.5～8.5。一般經(jīng)過(guò)12h～18h藻細(xì)胞能恢復(fù)正常，敵害生物已被殺死。此時(shí)可以再添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。一般的敵害生物污染可用此法，但有些甲藻污染用此法處理效果不佳。次氯酸鈉處理法按1m3藻液加入次氯酸鈉液150mL（有效氯8％左右），1h后用適量硫代硫酸鈉還原至無(wú)余氯。一般經(jīng)過(guò)12h～18h藻細(xì)胞能恢復(fù)正常，敵害生物已被殺死。此藻液不宜馬上作為餌料投喂，宜再添加培養(yǎng)液生長(zhǎng)3d～5d后投喂。一般的敵害生物污染可用此法。

（資料性附錄）

碘化鉀淀粉試劑的配制與余氯檢測(cè)方法試劑配制：稱(chēng)取1g淀粉至200mL蒸餾水或純凈水中，加熱并不斷攪拌至液體澄清，冷卻后加入2g碘化鉀搖勻。此試劑應(yīng)避光低溫保存。余氯檢測(cè)：取被檢測(cè)海水10mL～50mL，滴入幾滴碘化鉀淀粉試劑，若被檢測(cè)海水不變色，則無(wú)余氯；若被檢測(cè)海水變藍(lán)色；則有余氯。

（規(guī)范性附錄）

水產(chǎn)養(yǎng)殖用金藻培養(yǎng)液配方表B.1水產(chǎn)養(yǎng)殖用金藻