基因結(jié)構(gòu)的基本策略

第二十五章

基因結(jié)構(gòu)分析的基本策略Basicstrategyforanalyzinggenestructure

主要內(nèi)容：第一節(jié)基因序列結(jié)構(gòu)的生物信息學檢索和比對分析第二節(jié)基因轉(zhuǎn)錄起始點的鑒定第三節(jié)啟動子的結(jié)構(gòu)及功能分析第四節(jié)編碼序列結(jié)構(gòu)分析第一節(jié)基因序列結(jié)構(gòu)的生物信息學檢索和比對分析就是在數(shù)據(jù)庫中對基因序列或DNA序列進行比對分析，以其能夠推測出其結(jié)構(gòu)、功能及在進化上的聯(lián)系.比對方法：

1.雙重比對

2.多序列比對序列比對目的：判斷兩個或多個序列間是否具有足夠的相似性從而判斷二者之間是否具有同源性直接的數(shù)量關(guān)系進化上曾具有共同祖先基因或DNA序列比對序列比對的結(jié)果：取代插入缺失Mouse:GGKDSCQGDSGGPVVCNG----QLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAANCrayfish:GGKDSCQGDSGGPLAASDTGSTYLAGIVSWGYGCARPGYPGVYTEVSYHVDWIKANAV--缺失？保守序列保守序列：可能是共同進化的標志可能并不代表功能的重要性插入？當兩個序列非常相似時，是否一定說明它們具有相似的功能？NCBI數(shù)據(jù)庫NCBI首先創(chuàng)建GenBank數(shù)據(jù)庫于1991年開發(fā)了Entrez數(shù)據(jù)庫檢索系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了GenBank、EMBL、PIR和SWISS-PROT等數(shù)據(jù)庫的序列信息以及MEDLINE有關(guān)序列的文獻信息，并通過相關(guān)鏈接，將他們有機地結(jié)合在一起NCBI還提供了其他數(shù)據(jù)庫，包括在線人類孟德爾遺傳(OMIM）、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫（MMDB）、人類基因序列集成（UniGene）、人類基因組基因圖譜（GMHG）、生物門類（Toxonomy）等數(shù)據(jù)庫1.各種數(shù)據(jù)庫的介紹(1)Nucleotide該數(shù)據(jù)庫由國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫成員美國國立衛(wèi)生研究院GenBank、日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)和英國HinxtonHall的歐洲分子生物學實驗室數(shù)據(jù)庫(EMBL）三部分數(shù)據(jù)組成三個組織每天交換各自數(shù)據(jù)庫中的新增序列實現(xiàn)數(shù)據(jù)共享(2)Genome即基因組數(shù)據(jù)庫，提供了多種基因組、完全染色體、重疊序列圖譜以及一體化基因物理圖譜(3)Structures即結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫或稱分子模型數(shù)據(jù)庫(MMDB)，包含來自X線晶體學和三維結(jié)構(gòu)的實驗數(shù)據(jù)NCBI已經(jīng)將結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)交叉鏈接到書目信息、序列數(shù)據(jù)庫和NCBI的Taxonomy中運用NCBI的3D結(jié)構(gòu)瀏覽器和Cn3D，可以很容易地從Entrez獲得分子的分子結(jié)構(gòu)間相互作用的圖像(4)Taxonomy即生物學門類數(shù)據(jù)庫，可以按生物學門類進行檢索或瀏覽其核苷酸序列、蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)等(5)PopSet包含研究一個人群、一個種系發(fā)生或描述人群變化的一組組聯(lián)合序列PopSet既包含了核酸序列數(shù)據(jù)又包含了蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)(7)文獻數(shù)據(jù)據(jù)庫PubMed：生物醫(yī)藥藥科學的的檢索系系統(tǒng)OMIM：孟德爾遺遺傳學數(shù)數(shù)據(jù)庫是是人類基基因和基基因疾病病的目錄錄數(shù)據(jù)庫庫其他他：：書書目目，，雜雜志志，，文文章章引引用用匹匹配配等等該數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)庫庫包包括括原原文文信信息息、、圖圖片片和和參參考考信信息息，，同同時時還還可可以以鏈鏈接接到到Entrez系統(tǒng)統(tǒng)MEDLINE數(shù)據(jù)據(jù)庫庫中中相相關(guān)關(guān)文文獻獻和和序序列列信信息息2.NCBI數(shù)據(jù)據(jù)庫庫檢檢索索在檢檢索索框框中中輸輸入入檢檢索索詞詞，，檢檢索索詞詞間間默默認認邏邏輯輯關(guān)關(guān)系系為為AND，檢檢索索規(guī)規(guī)則則基基本本同同PubMed可以通過過下拉菜菜單選擇擇記錄的的顯示格格式，通通常選擇擇GenBankReport格式或FASTAReport格式。當選擇GenBankReport格式后，，屏幕顯顯示較完完整的基基因記錄錄，包括括：基因因位點(Locus）、基因因定義(Definition）、基因因存取號號(Accession）、核酸酸編號(NID）、關(guān)鍵詞詞(Keywords）、來源源(Source）、組織分分類(Organism)、參考文獻獻(Reference)、著者(Author）、題目(Title）、期刊(Journal）、Medline存取號(Medline）、序列列特征(Features）、基因因(Gene）、、CDS（cDNA）、、等位位基基因因(Allele）對對等等的的肽肽(Mat-Peptide）、、計計算算堿堿基基數(shù)數(shù)而FASTAReport格式僅包括檢出序列的簡要特征描述。例如如：：人人EPO基因因序序列列檢檢索索輸入入關(guān)關(guān)鍵鍵詞詞，，選選擇擇合合適適的的程程序序向下下拉拉尋尋找找符符合合目目標標的的條條目目點擊擊此此條條打打開開連連接接向下下拉拉尋尋找找關(guān)關(guān)注注的的內(nèi)內(nèi)凡是是連連接接的的地地方方都都可可以以點點擊擊查查看看可以以直直接接拷拷貝貝保保存存相相關(guān)關(guān)內(nèi)內(nèi)容容Entrez：是一一個個用用以以整整合合NCBI數(shù)據(jù)據(jù)庫庫中中信信息息的的搜搜尋尋和和檢檢索索工工具具3.NCBI數(shù)據(jù)據(jù)庫庫搜搜索索工工具具BLAST：是一一個個NCBI開發(fā)發(fā)的的序序列列相相似似搜搜索索程程序序，，還還可可作作為為鑒鑒別別基基因因和和遺遺傳傳特特點點的的手手段段NCBI提供供的的附附加加軟軟件件工工具具有有：：開開放放閱閱讀讀框框?qū)ひ捯捚髌鳎∣RFFinder），，電子子PCR，和序序列列提提交交工工具具，，Sequin和BankItEntrez的一一個個強強大大和和獨獨特特的的特特點點是是檢檢索索相相關(guān)關(guān)的的序序列列，，結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)，，和和參參考考文文獻獻的的能能力力Entrez:BLAST:BLAST程序序程序數(shù)據(jù)庫查詢內(nèi)容Blastp蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)使用取代矩陣尋找較遠的關(guān)系：可以進行SEG過濾Blastn核苷酸核苷酸尋找較高分值的匹配，對較遠關(guān)系不太適用Blastx核苷酸蛋白質(zhì)對于新的DNA序列和ESTs的分析極（翻譯）為有用Tblastn蛋白質(zhì)核苷酸對于尋找數(shù)據(jù)庫中沒有標注的編碼（翻譯）區(qū)極為有用Tblastx核苷酸核苷酸對于分析EST極為有用（翻譯）（翻譯）點擊擊核核酸酸序序列列blast，在在框框內(nèi)內(nèi)輸輸入入序序列列：：選擇擇搜搜索索條條件件：：選擇擇特特殊殊程程序序：：比較較兩兩個個序序列列之之間間的的相相似似性性：：以上上僅僅簡簡介介了了NCBI相關(guān)數(shù)據(jù)庫庫及工具軟軟件關(guān)于其其他數(shù)據(jù)庫庫及軟件工工具等信息息見書中第第二十五章章表1-5第二節(jié)基因轉(zhuǎn)錄起起始點的鑒鑒定主要內(nèi)容：：一、基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄起始點點的序列特特征二、基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄起始點點的序列分分析一、基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄起始點點的序列特特征

TATAbox

CAATbox

GCbox

增強子

順式作用元件

結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始點1.真核基因及及其調(diào)控元元件II型啟動子的的TSS：沒有明確的的保守序列列有一種趨勢勢，即mRNA的第一個堿堿基是A，其側(cè)翼堿堿基傾向于于是嘧啶與mRNA第一個堿基基對應的位位置標記為為-1區(qū)-3~+5區(qū)域被稱作作起始子(initiator)2.轉(zhuǎn)錄起始點點（TSS）+10+20Startsite-10-20-30-40+1ATG-3+5InitiatorPy2CAPy5二、基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄起始點點的序列分分析思考：轉(zhuǎn)錄起始點點(TSS)位于基因編編碼序列的的5端基因編碼區(qū)區(qū)是指能體體現(xiàn)在多肽肽鏈中的核核苷酸序列列多肽鏈是以以mRNA為模板經(jīng)翻翻譯合成的的因此，分析鑒定TSS的方法都是是以cDNA為切入點1.cDNA克隆測序AAAAAnAAAAAnAAAAAnmRNA反轉(zhuǎn)錄酶AAAAAnOligo(dT)15-18TTTTT15-18cDNA第一鏈CCCCCTTTTT15-18cDNA第一鏈nCCCCnGGGGcDNA第二鏈克隆擴增，，5端測序分析析反轉(zhuǎn)錄酶的的末端轉(zhuǎn)移移酶活性O(shè)ligo(dG)15-18mRNA與線性載體體相連接要求：cDNA的5端完整無缺缺2.cDNA末端快速擴擴增技術(shù)(RACE)傳統(tǒng)的RACE：AAAAAnmRNAAAAAAnTTTTT15-18cDNAmRNA-53-反轉(zhuǎn)錄酶Oligo(dT)15-18末端轉(zhuǎn)移酶酶dGTPTTTTT15-18nGGGGG錨定PCR擴增TTTTT15-18nGGGGGnCCCCC錨定引物特異引物PCR產(chǎn)物Deep-RACE：用寡核苷酸酸替代mRNA的5′端帽結(jié)構(gòu)以以及發(fā)光標標記巢氏PCR引物實現(xiàn)高高通量鑒定定轉(zhuǎn)錄起始始點AAAAAn5-p帽mRNA牛小腸磷酸酸酶(CIP)AAAAAn5-帽煙草酸酸焦磷磷酸酶酶(TAP)AAAAAn5-將5-RACEadaptor(寡核苷苷酸)加到脫脫帽RNA分子上上AAAAAn5-RACEadaptor(寡核苷苷酸)反轉(zhuǎn)錄錄酶10nt隨機引引物5-RACEadaptor5-RACEadaptor5-RACEadaptor5-RACEadaptor長短不不同的的cDNA隨機引引物用10nt隨機引引物與與5-RACE引物進進行PCR擴增5-RACEadaptor5-RACEadaptor5-RACEadaptor5-RACEadaptorPCR產(chǎn)物隨機引引物以5’-RACE引物和和5’端甩尾尾的基基因特特異性性反向向引物物進行行巢氏氏PCR5-RACEadaptor以5’-RACE發(fā)光標標記引引物對對PCR混合物物直接接進行行一次次性測測序分析基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄起起始點點3.連續(xù)分分析基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄起起始點點在RACE的基礎(chǔ)礎(chǔ)上，，通過過在轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄本本5′端引入入一個個特殊殊的II型限制制性核核酸內(nèi)內(nèi)切酶酶識別別位點點，實實現(xiàn)了了基因因5′端短片片段串串聯(lián)連連接產(chǎn)產(chǎn)物一一次測測序分分析多多個基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄起起始點點的目目的主要要有有兩兩種種方方法法：：5′端連連續(xù)續(xù)分分析析基基因因表表達達（5′-endserialanalysisofgeneexpression,5′SAGE）帽分析析基因因表達達（capanalysisgeneexpression,CAGE）(1)5′SAGE5′SAGE是在PCR過程中中將MmeI酶切位位點引引物cDNA的5′端，通過酶酶切和連接接獲得不同同短片段重重復序列，，并對重復復序列進行行測序獲得得大量片段段序列信息息不同序列的的短片段代代表不同基基因的轉(zhuǎn)錄錄起始點(TSS)MmeI:是一種特殊殊的II型限制性核核酸內(nèi)切酶酶識別的序列列不是回文文結(jié)構(gòu)，而而是不對稱的DNA序列5′-TCCRAC-3′（R代表G或A）在識別位點下下游18~20堿基處切開雙雙鏈DNAGpppAAAAAAAAnmRNA用BAP和TAP處理AAAAAAAAnp在RNA的5端加上寡核苷苷酸帽AAAAAAAAn5XhoIMmeI反轉(zhuǎn)錄酶RT5AAAAAAAAn5cDNAPCRBiotin-標記引物隨機引物55BiotinMmeI酶切消化520mer5Biotin親和素用親和和素-生物素素，可可以將將5-端片段與與其他他片段段分離離開520mer連接5Biotin5Biotin520merPCR擴增55Biotin5Biotin5XhoI酶切消消化自身連連接串聯(lián)體體測序分分析(2)CAGECAGE與5′SAGE非常相相似所不同同的是是:CAGE不需要要在RNA上加接頭，而而是用oligo(dT)引物先進行第第一鏈cDNA的合成然后通過捕獲獲帽結(jié)構(gòu)，將將含有MmeI和另一內(nèi)切酶酶位點如XmaJI的linker加到單鏈全長長cDNA的3′末端AAAAAAnCapmRNA反轉(zhuǎn)錄酶Oligo(dT)15~18AAAAAAnCapTTTTTTTncDNA捕獲5-帽結(jié)構(gòu)單鏈linker連接TTTTTTTnBiotincDNA第二鏈的合成成TTTTTTTnAAAAAAnMmeIXmaJIMmeI酶切親和素20mer用親和素-生物素，可以以將5-端片段與其他片片段分離開連接第二個linkerXbaIXmaJIXmaJI,Xbal酶切消化PCR（用linker1和linker2作引物）Linker1Linker2純化，串聯(lián)連連接，克隆20merXmaJI和XbaI是同尾酶：XmaJI：C^CTAGGXbaI：T^CTAGA串聯(lián)體測序分析第三節(jié)啟動子的結(jié)構(gòu)構(gòu)及功能分析析主要內(nèi)容：一、啟動子的的結(jié)構(gòu)分析二、啟動子的的功能分析啟動子（promoter）是一段能被蛋蛋白質(zhì)識別的的、參與特定定基因轉(zhuǎn)錄調(diào)調(diào)控的DNA序列II型啟動子通常常位于結(jié)構(gòu)基基因的上游共通序序列(consensussequence)是其特特征性性序列列共通序序列和和啟動動子所所處的的位置置是研研究啟啟動子子的重重要線線索+10+20Startsite-10-20-30-40+1ATG-3+5Initiator共通序序列例如：：原核基基因的的共通通序列列：-10區(qū)：Pribnowbox（T77A76T60A61A56T82序列））-35區(qū)：T69T79G61A56C54A54序列真核基基因的的共通通序列列：真核基基因啟啟動子子在-50區(qū)域附附近（（大約約5%~30%基因啟啟動子子在-25~-30區(qū)域））有TATAbox（TATAAA序列））TATAATTTGACA一、啟啟動子子的結(jié)結(jié)構(gòu)分分析主要方方法：：利用PCR技術(shù)克克隆啟啟動子子利用核核酸-蛋白質(zhì)質(zhì)相互互作用用方法法研究究啟動動子生物信信息學學預測測啟動動子（一））利用用PCR技術(shù)克克隆啟啟動子子特異性性基因因序列列基因上上游序序列基因組組DNA根據(jù)基基因序序列合合成一一條反反向引引物正向引引物用用隨機機引物物PCR擴增隨機引引物特異引引物克隆及及測序序分析析注意：：真核基基因有有內(nèi)含含子，，應該該根據(jù)據(jù)mRNA序列設(shè)設(shè)計特特異性性引物物特異性性引物物盡可可能靠靠近基基因的的5端1.根據(jù)已已知基基因序序列直直接進進行PCR擴增2.利用TSS釣取啟啟動子子AAAAAAnCap5-mRNA反轉(zhuǎn)錄錄AAAAAAnTTTTTTncDNA插入載載體，，克隆隆擴增增Cap5-以基因因特異異引物物與載載體引引物配配對PCR擴增5-測序分分析基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄起起始點點序列列以TSS序列為為引物物，基基因組組序列列為模模板，，與隨隨機引引物配配對進進行TSS上游序列列的PCR擴增3.利用環(huán)狀狀PCR釣取啟動動子基因組DNA酶切消化化基因組DNA片段直接環(huán)化化連接加上接頭頭后環(huán)化化連接根據(jù)基因因上游序序列設(shè)計計一對反反向互補補引物PCR擴增根據(jù)接頭頭序列設(shè)設(shè)計引物物PCR擴增克隆測序分析析克隆測序分析析加接頭環(huán)環(huán)化PCR不依賴特特異基因因序列可用于篩篩選啟動動子接頭（二）利利用核酸酸-蛋白質(zhì)互互作方法法研究啟啟動子啟動子是是一段能能被蛋白白質(zhì)識別別和結(jié)合合的DNA序列，因因此，能能夠檢測測核酸-蛋白質(zhì)相相互作用用的研究究方法都都可以用用于啟動動子的研研究中主要方法：：足跡法（酶酶足跡法，，化學足跡跡法）電泳遷移率率變動實驗驗（EMSA）染色體免疫疫沉淀（ChIP）1.用足跡法研研究啟動子子足跡法（Footprinting）利用DNA電泳條帶連連續(xù)性中斷斷的圖譜特特點判斷與與蛋白質(zhì)結(jié)結(jié)合的DNA區(qū)域基本流程：：DNA與蛋白質(zhì)相相互作用切割DNA凝膠電泳分析電泳圖圖譜蛋白與未標記的競爭DNA結(jié)合蛋白與標記的DNA結(jié)合凝膠電泳放射自顯影（1）酶足跡法法(Enzymaticfootprinting)利用能切割割DNA的酶處理DNA-蛋白質(zhì)混合合物，然后后通過電泳泳進行分析析DNaseI足跡法(DNaseIfootprinting)是一種利用用DNaseI隨機切割雙雙鏈DNA，從而確定定DNA結(jié)合蛋白在在DNA上結(jié)合位點點的方法核酸外切酶酶III足跡法(ExonucleoaseIIIfootprinting)是利用核酸酸外切酶III（ExoIII）的35外切酶活性性從3末端切割雙雙鏈DNA的特性，確確定蛋白質(zhì)質(zhì)在DNA上的結(jié)合位位點的常用用方法DNaseI足跡法dsDNA單鏈末端標標記DNA結(jié)合蛋白DNaseI酶切消化（控制反應應時間）產(chǎn)生長短不不同的片段段但蛋白質(zhì)結(jié)結(jié)合區(qū)被保保護蛋白質(zhì)結(jié)合合區(qū)MNo-proPro-DNA對在凝膠上上出現(xiàn)空白白區(qū)域的DNA進行克隆測測序，即可可確定結(jié)合合蛋白質(zhì)的的DNA序列變性凝膠電電泳（2）化學足跡跡法(Chemicalfootprinting)是利用能切切斷DNA骨架的化學學試劑處理理DNA-蛋白質(zhì)復合合物，從而而通過化學學試劑無法法接近結(jié)合合蛋白質(zhì)的的DNA區(qū)域而確定定DNA的蛋白質(zhì)結(jié)結(jié)合位點主要方法：：羥自由基足足跡法體內(nèi)足跡法法1）羥自由基基足跡法（Hydroxylradicalfootprinting）化學試劑羥自由基利用化學試試劑產(chǎn)生的的羥自由基基攻擊DNA分子表面脫脫氧核糖骨骨架使DNA斷裂當DNA結(jié)合蛋白將將脫氧核糖糖遮蓋時，，自由羥基基無法攻擊擊而使這個個區(qū)域的DNA受到保護電泳圖譜上上出現(xiàn)空白白區(qū)的地方方就是結(jié)合合蛋白質(zhì)的的DNA變性凝膠電電泳2）體內(nèi)基足足跡法（Invivofootprinting）用化學試劑劑對活細胞胞進行體內(nèi)內(nèi)處理，使使DNA在細胞內(nèi)受受到化學修修飾，然后后裂解細胞胞，用化學學法或酶法法進行足跡跡實驗。甲基化干擾擾實驗(Methylationinterferenceassay)是利用化學學試劑如硫硫酸二甲酯酯（Dimethylsulfate,DMS）對活細胞DNA進行甲基化化修飾，從從而干擾蛋蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。乙基化干擾擾實驗(Ethylationinterferenceassay)是利用化學學試劑對活活細胞DNA進行乙基化化修飾，從從而干擾蛋蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合?；瘜W試劑提取DNADNaseI或化學試劑劑變性凝膠電電泳分析切割DNA化學修飾對對蛋白質(zhì)與與DNA的結(jié)合有干干擾，因此此，體內(nèi)足足跡實驗也也叫干擾實實驗電泳圖譜需需與未修飾飾的DNA樣品進行比比較，在未未修飾樣品品中出現(xiàn)空空白區(qū)的位位置是體內(nèi)內(nèi)發(fā)生化學學修飾的DNA區(qū)域正常對照化學修飾提取DNA2.用電泳遷移率率變動實驗研研究啟動子電泳遷移率變變動實驗(Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)是利用結(jié)合蛋蛋白質(zhì)的DNA片段在凝膠中中遷移滯后的的特點，通過過電泳分離研研究核酸-蛋白質(zhì)互作的的方法又稱為凝膠阻阻滯實驗(Gelretardationassay)細胞蛋白質(zhì)提提取物標記的DNA片段蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-DNA復合物電泳遷遷移滯后凝膠電泳顯影滯后條帶表明明DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)結(jié)合的區(qū)域3.用染色體免疫疫沉淀技術(shù)研研究啟動子染色體免疫沉沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)是在保持蛋白白質(zhì)與染色體體DNA結(jié)合的同時，，將染色體切切割成小片段段并沉淀下來來非變性ChIP：是先用核酸酸酶處理細胞胞核，將染色色體消化成碎碎片，然后用用合適的抗體體將結(jié)合有蛋蛋白質(zhì)的染色色體片段通過過免疫沉淀選選擇出來，再再以PCR或核酸雜交技技術(shù)對DNA序列進行分析析變性ChIP：是先用甲醛醛處理細胞，，使蛋白質(zhì)與與DNA在細胞內(nèi)發(fā)生生交聯(lián)，然后后分離染色體體并進行剪切切，用特異性性抗體與DNA結(jié)合蛋白相結(jié)結(jié)合，以沉淀淀法分離DNA-蛋白質(zhì)復合體體前面章節(jié)已介介紹，這里不不再詳述（三）生物信信息學預測啟啟動子真核基因組的的測序正在以以不斷增長的的速度進行著著，目前已經(jīng)經(jīng)可以獲得大大約50個完整真核生生物基因組的的序列信息，，預計在未來幾幾年內(nèi)將會完完成更多的基基因組測序工工作對基因組注釋釋工作中最難難的就是精確確鑒定和描繪繪啟動子，因因此，啟動子子的預測就顯顯得非常重要要預測啟動子的的切入點啟動子的結(jié)構(gòu)構(gòu)特征啟動子在染色色體上的位置置1.啟動子的結(jié)構(gòu)構(gòu)特征典型啟動子核心啟動子：：一般在TSS上游-35區(qū)域以內(nèi)近端啟動子：：一般涉及TSS上游幾百個堿堿基遠端啟動子：：一般涉及TSS上游幾千個堿堿基含有增強子或或沉默子一些特征性的的結(jié)構(gòu)TSS附近的CG島經(jīng)常出現(xiàn)在在啟動子中共通序列(consensussequence)2.啟動子的預測測分析EPD(Eukaryoticpromoterdatabases)TRRD(Transcriptionregulatoryregionsdatabases)基因轉(zhuǎn)錄起始點數(shù)數(shù)據(jù)庫(DBTSS)啟動子數(shù)據(jù)庫庫這些數(shù)據(jù)庫主主要通過計算算機識別、判判斷及分析，，在數(shù)據(jù)庫中中尋找啟動子子的特異性特特征結(jié)構(gòu)。二、啟動子的的功能分析啟動子通常是是基因上游參參與基因轉(zhuǎn)錄錄調(diào)控的DNA序列。由于啟啟動子中的順順式作用元件件在基因的特特異性表達中中發(fā)揮重要作作用，因此，，可以通過連連接報告基因因研究啟動子子的功能。1.報告基因(Reportergene)是研究者們?yōu)闉榱酥圃煲环N種可在細胞培培養(yǎng)條件下或或動植物體內(nèi)內(nèi)作為篩選標標志的易檢測測信號，通過過分子生物學學操作將發(fā)光光蛋白或酶的的編碼基因附附加到一個感感興趣基因上上或插入基因因調(diào)控序列下下游，從而監(jiān)監(jiān)測感興趣基基因的表達或或分析基因調(diào)調(diào)控序列的活活性。常用的報告基基因熒光蛋白編碼碼基因：綠色熒光蛋白白(GFP)紅色熒光蛋白白(dsRed)蛋白酶：熒光素酶(luciferase)-半乳糖苷酶在藍色光源照照射下發(fā)綠光光能催化熒光素素(luciferin)發(fā)生氧化反應應發(fā)光能使細菌在X-gal存在條件下變變成藍色2.報告基因的應應用監(jiān)測基因的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染效率報告基因與目目的基因分別別插入各自啟啟動子下游，，實現(xiàn)報告基基因的組成性性表達模式監(jiān)控目的基因因的表達報告基因與目目的基因融合合共同受控于于一個啟動子子，報告基因因的表達即代代表目的基因因的表達研究啟動子的的活性報告基因插入入被研究啟動動子下游，通通過觀察報告告基因的表達達情況推測啟啟動子活性啟動子捕獲技技術(shù)(promotertrapping)：是一種研究究啟動子活性性的篩選方法法基本流程：構(gòu)建啟動子捕捕獲載體觀察報告基因因的表達報告基因MCSori候選啟動動子序列列插入MCS轉(zhuǎn)染細胞胞觀察報告告基因的的表達啟動子捕捕獲載體體第四節(jié)編碼序列列結(jié)構(gòu)分分析編碼序列列(codingsequence)：通常是指指能體現(xiàn)現(xiàn)在蛋白白質(zhì)氨基基酸序列列中的基基因信息息主要內(nèi)容容一、基因因編碼序序列的結(jié)結(jié)構(gòu)特征征二、基因因編碼序序列的結(jié)結(jié)構(gòu)分析析一、基因因編碼序序列的結(jié)結(jié)構(gòu)特征征基因的編編碼序列列具有一一些特征征性序列列比如：開放閱讀讀框架蛋白質(zhì)翻翻譯的起起始密碼碼子和終終止密碼碼子真核基因因的外顯顯子（編編碼序列列）和內(nèi)內(nèi)含子（（非編碼碼序列））之間有有特殊序序列（一））開放放閱讀讀框架架開放閱閱讀框框架(openreadingframe,ORF)是指生生物基基因組組中含含有能能潛在在編碼碼蛋白白質(zhì)的的一段段核苷苷酸序序列在基因因序列列中，，ORF位于起起始密密碼子子（startcodon）和終終止密密碼子子（stopcodon）之間間密碼子子：是由三三個核核苷酸酸組成成的DNA序列，，也稱稱作三三聯(lián)密密碼子子生物體體基因因組中中總共共有64種密碼碼子，，其中中三個個終止止密碼碼子，，61個編碼碼氨基基酸的的密碼碼子分析一一段DNA序列中中是否否存在在ORF：從理論論上說說，一一般需需要對對雙鏈鏈DNA序列的的6種閱讀讀框架架進行行分析析，每每一條條鏈分分析三三種閱閱讀框框架例如：：1）5-UCUAAAAUGGGUGAC-3(其中AUG是起始始密碼碼子)2）5-UCUAAAAUGGGUGAC-33）5-UCUAAAAUGGGUGAC-3(其中UAA是終止密密碼子)只有真正正的ORF可以不遇遇到終止止密碼子子（二）mRNA選擇性剪剪接的序序列特征征mRNA的選擇性性剪接(alternativesplicing)：是指基因因外顯子子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)產(chǎn)物RNA以不同方方式進行行切割再再連接的的過程經(jīng)剪接所所產(chǎn)生的的mRNA可以翻譯譯成不同同的蛋白白質(zhì)，從從而導致致一個基基因可以以編碼一一個以上上蛋白質(zhì)質(zhì)真核基因因的內(nèi)含含子在與與外顯子子交界區(qū)區(qū)域有共共通序列列(consensussequences)：內(nèi)含子的的5端有GU序列，3端有AG序列（三）基基因外顯顯子的序序列特征征基因外顯顯子可以以被分成成三部分分能夠被翻翻譯成蛋蛋白質(zhì)的的編碼區(qū)區(qū)5-非翻譯區(qū)區(qū)（5UTR）3-非翻譯區(qū)區(qū)（3UTR）有作為蛋蛋白質(zhì)翻翻譯起始始重要元元件的Kozak序列：由起始密密碼子AUG及其周周圍序序列組組成3UTR位于終終止密密碼子子下游游，含含有polyA尾的加加尾信信號AATAAA序列二、基基因編編碼序序列的的結(jié)構(gòu)構(gòu)分析析基因的的編碼碼序列列是指指能體體現(xiàn)在在成熟熟mRNA中的核核苷酸酸序列列，因因此，，與mRNA互補的的cDNA成為研研究編編碼序序列的的主主要方法：cDNA文庫的編碼序序列篩選RNA剪接分析編碼碼序列用數(shù)據(jù)庫分析析編碼序列高通量分析RNA剪接的方法主主要有三種：：基于DNA微點陣分析、、交聯(lián)免疫沉沉淀（CLIP）和體外報告告基因測定法法對各種方法所所獲得的cDNA片段的序列在在基因數(shù)據(jù)庫庫中進行同源源性比對，通通過染色體體定位分析、、內(nèi)含子/外顯子分析析、ORF分析及表達譜譜分析等小結(jié)：基因結(jié)構(gòu)分析析的切入點已已經(jīng)從一個基基因的克隆測測序，發(fā)展到到如今在基因因組范圍的高高通量篩選，，因此，研究究策略也發(fā)生生了變化，基基因數(shù)據(jù)庫在在不知不覺中中占據(jù)了重要要地位?；蚪Y(jié)構(gòu)特點點成為基因組組范圍內(nèi)高通通量掃描基因因的重要靶標標，基因的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄起始點、、啟動子以及及編碼序列是是基因的重要要結(jié)構(gòu)特征9、靜夜夜四無無鄰，，荒居居舊業(yè)業(yè)貧。。。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、雨中中黃葉葉樹，，燈下下白頭頭人。。。06:10:1706:10:1706:1012/23/20226:10:17AM11、以我獨沈久久，愧君相見見頻。。12月-2206:10:1706:10Dec-2223-Dec-2212、故人江海海別，幾度度隔山川。。。06:10:1706:10:1706:10Friday,December23,202213、乍見見翻疑疑夢，，相悲悲各問問年。。。12月月-2212月月-2206:10:1706:10:17December23,202214、他鄉(xiāng)生白白發(fā)，舊國國見青山。。。23十二二月20226:10:17上上午06:10:1712月月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。。十二月226:10上上午12月-2206:10December23,202216、行行動動出出成成果果，，工工作作出出財財富富。。。。2022/12/236:10:1806:10:1823December202217、做前前，能能夠環(huán)環(huán)視四四周；；做時時，你你只能能或者者最好好沿著著以腳腳為起起點的的射線線向前前。。。6:10:18上上午6:10上上午午06:10:1812月月