基因工程的概念

Chapter

15

RecombinantDNA

andGeneticEngineering基礎理論和技術的發(fā)展催生了基因工程15.1基因工程的概念一、基因工程的概念：

利用DNA體外重組或PCR擴增技術從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經過一系列切割，加工修飾，連接反應形成重組DNA分子，再將其轉入適當的受體細胞，以期獲得基因表達的過程.基因工程(geneengineering)常和以下名稱混用遺傳工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重組DNA技術(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名詞時指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系.15.1基因工程的概念二、基因工程的主要內容或（步驟）1、從復雜的生物有機體基因組中，經過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段。2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3、將重組DNA分子轉移到適當的受體細胞(亦稱寄主細胞)，并與之一起增殖。4、從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞克隆。5、從這些篩選出來的受體細胞克隆，提取出已經得到擴增的目的基因，供進一步分析研究使用。6、將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現功能表達，產生出人類所需要的物質。15.1基因工程的概念三、基因工程的應用醫(yī)藥：生物制藥；基因治療；人工器官農業(yè)和畜牧業(yè)

轉基因植物：抗病蟲害新品種、抗逆新品種、高品質新品種

轉基因動物：生產有用蛋白質和高品質的畜產品

生物反應器：利用動植物細胞或組織作為生物反應器，直接生產有用蛋白質輕工與食品新型食品；營養(yǎng)食品；保健食品；輕工用酶環(huán)境污染治理；廢物利用；污染物生物降解15.1基因工程的概念15.1基因工程的概念轉基因植物物15.1基基因工程程的概念轉基因動物物作為生物物發(fā)生器15.1基基因工程程的概念15.2基基因工程程中的工具具酶限制性內切切酶—主要用于于DNA分分子的特異異切割DNA甲基基化酶—用于DNA分子的的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特特異性切割割核酸聚合酶酶—用于DNA和RNA的合成成核酸連接酶酶—用于DNA和RNA的連接接核酸末端修修飾酶—用于DNA和RNA的末端端修飾其它酶類—用于生物物細胞的破破壁，轉化化，核酸純純化，檢測測等15.2基基因工程程中的工具具酶一、限制性性內切酶（一）、限制修修飾系統統的種類類（二）、、限制性性內切酶酶的定義義、命名名（三）、、限制酶酶的特點點（四）、、異源同同序酶（（isoschizomer，同裂裂酶）（五）、、限制酶酶的用途途15.2基因因工程中中的工具具酶一種限制制酶只能識別一種種特定核苷苷酸序列列；并在特定切點切割．限制性核核酸內切切酶——“分分子手術術刀”來源：種類：作用：主要是微微生物4000種。15.2基因因工程中中的工具具酶（一）、、限制修修飾系統統的種類類1.ⅠⅠ型：由三個個基因構構成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于于染色體體上，三三個基因因構成一一個復合合體，限限制酶需需要ATP、Mg2+、SAM（５——腺苷甲甲硫氨酸酸），無無特異切切割位點點。2.ⅡⅡ型：限制與與修飾基基因產物物獨立起起作用，，在Ｅ.coli中這兩種種基因位位于質粒粒上。3.ⅢⅢ型：修飾酶酶與Ｉ型型酶相同同，hsdＭ與hsdＳ基因產產物結合合成一亞亞單位，，限制酶酶是獨立立存在的的。上述三個個系統中中，只有有II型型限制酶酶與甲基基化酶具具有相當當高的核核苷酸識識別特異異性，因因而被廣廣泛用于于基因工工程中。。15.2基因因工程中中的工具具酶（二）、、限制性性內切酶酶的定義義、命名名1.定定義：廣義指指上述三三個系統統中的限限制酶；；狹義義指Ⅱ型型限制酶酶。2.命命名：限制酶酶由三部部分構成成，即菌菌種名、、菌系編編號、分分離順序序。例如：HindⅢ前前三個字字母來自自于菌種種名稱H.influenzae，“ｄ”表示菌菌系為ｄｄ型血清清型；““Ⅲ”表表示分離離到的第第三個限限制酶。。EcoRI—EscherichiacoliRI15.2基因因工程中中的工具具酶（三）、、限制酶酶的特點點1.識識別順序序和酶切切位點１）識別別４-8個相連連的核苷苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’’N’N’CCGG２）富含含ＧＣ３）對稱稱性—雙雙對稱EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’４）切點點大多數數在識別別順序之之內，也也有例外外５）限制制酶切后后產生兩兩個末端端，末端端結構是是５’-Ｐ和３３’-ＯＯＨ15.2基因因工程中中的工具具酶2.末末端種種類１）３’’-端突突起，個個數為２２或４個個核苷酸酸PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’’3’-GACGTC-5’3’’-GACGTC-5’’２）５’’-端突突起，個個數為２２或４個個核苷酸酸EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’粘性末端能與與另一個相同同的粘連末端端相連接，任任何兩個具有有相同識別位點的DNA分子經限制制酶切割后能能夠重新連接接成新的重組組DNA分子子。在進行DNA重組時時，應用限制制酶同時切割割目的基因和和載體DNA，使之產生生相對的粘性末端，然后后再將二者連連接成重組DNA分子15.2基基因工程中的的工具酶EcoRⅠⅠ5’-G-A-A-T-T-C-3’3’-C-T-T-A-A-G-5’Palindrome5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAPHOG-5’CohesiveEnds(StickyEnds)15.2基基因工程中的的工具酶SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’BluntEnds15.2基基因工程中的的工具酶３）

平齊末末端SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’４）非互補的的粘性末端ａ）切點在識識別順序之外外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能識別簡簡并順序的，，如：AvaIAvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG15.2基基因工程中的的工具酶（四）、異源源同序酶（isoschizomer，同裂酶酶）1.定定義：能識別別相同序序列但來來源不同同的兩種種或多種種限制酶酶2.特特點：1）識識別相同同順序2）切割割位點的的異同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG15.2基基因工程程中的工具具酶（五）、限限制酶的的用途1.DNA重組2.限限制制酶（物理理）圖譜繪繪制3.突突變變分析（RFLP分分析）4.限限制酶的的部分酶切切與完全酶酶切附：IIS型限制酶酶的特點1.具具有有特異型核核苷酸順序序識別能力力，但該順順序不具有有對稱結構構。2.酶酶切切位點與識識別位點不不一致，切切點常在識識別位點的的一側，1--20nt。。3.酶酶切切后的末端端經補平后后又可發(fā)生生酶切反應應。4.產產生生粘性末端端可以是1--5個個核苷酸。。5.均均為為單體，分分子量為47—108kD。15.2基基因工程程中的工具具酶RestrictionMaps(a)15.2基基因工程程中的工具具酶RestrictionMaps(b)15.2基因因工程中中的工具具酶M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭RE用于基因組文庫的建立用于cDNA的連接RERERE15.2基因因工程中中的工具具酶二、DNA聚合合酶（一）、、E.coliDNA聚聚合酶I（polⅠ））1.E.coli的DNA聚聚合酶酶系統統PolⅠⅠ參參與DNA修復復,具具3’→→5’’和5’→→3’’外切切酶活活性polⅡⅡ同同上上具具3’’→5’’外切酶酶活性polⅢⅢ參參與與DNA復制,具3’→5’和5’→3’外切切酶活性性2.E.colipolⅠⅠ的特點點1）具兩兩種外切切酶活性性和DNA聚合合酶活性性，在蛋蛋白酶作作用下，，該酶分分裂成兩兩個大小小不同的的片段，，其中小小片段具具5’→→3’外外切酶活活性，大大片段具具3’→→5’外外切酶活活性(大大片段亦亦稱為Klenow片片段,polIK)2）聚合合酶活性，，5’→3’,要要求3’-OH引物物和模板DNA，其其延續(xù)性受受反應條件件的影響3）外切切酶活性15.2基基因工程程中的工具具酶3.用途途1）除去去3’-端端突起的單單鏈DNA（在無dNTP時時）2）補齊齊5’-突突起端3）合成成第二條cDNA4））切切口口移移位位制制備備探探針針其中中用用途途2)和和3)常常用用大大片片段段15.2基基因因工工程程中中的的工工具具酶酶三、、連連接接酶酶（一一））、、T4DNA連連接接酶酶1.特特點點：：只連連接接ds-DNA分分子子，，要要求求3’’-羥羥基基和和5’’-磷磷酸酸基基2.用用途途：：1)相相同同或或相相容容粘粘性性末末端端的的連連接接2)平平整整末末端端的的相相連連DNA平平端端來來源源：：限限制制酶酶作作用用結結果果;限限制制酶酶與與其其它它酶酶共共同同作作用用結結果果。。平平端端的的連連接接比比粘粘性性末末端端的的連連接接要要困困難難得得多多，，所所需需的的酶酶量量也也多多15.2基基因因工工程程中中的的工工具具酶酶5’’-AAGCTT-3’’5’’-AOHPAGCTT-3’’PAGCTTAOH3’-TTCGAA-5’3’-TTCGAPHOA-5’HOATTCGAP退火5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’或5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’T4DNA連接酶5’-AAGCTTAAGCTT-3’’3’-TTCGAATTCGAA-5’’或5’-AAGCTTAAGCTT-3’’3’-TTCGAATTCGAA-5’’T4DNA連接酶的連連接反應(兩兩種插入方向向)+Thepolymerasechainreaction(PCR)：：toamplifyasequenceofDNAusingapairofprimerseachcomplementarytooneendofthetheDNAtargetsequence.1985年，，美國Cetus公司司和加利福尼尼亞大學聯合合創(chuàng)建了一種種核酸體外擴擴增技術。15.3PolymeraseChainReactionDenaturation（變性）:ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing（引物退火）:Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesupdNTPsandrequiredMg++15.3PolymeraseChainReaction15.4Vectors一、質粒的一一般生物學特特性；二、質粒DNA的分離與與純化；三、質粒載體體的構建及類類型；四、常用質粒粒載體舉例；；一、質粒的一一般生物學特特性（一）、質粒粒DNA1、質粒是細菌染色體體外能夠自主主復制的環(huán)形形雙鏈的DNA分子。2、編碼碼抗菌素素抗性基基因的質質粒叫R質粒。R質粒粒可將其其抗性轉轉移到缺缺乏該質質粒的適適宜的受受體細胞胞，使后后者也獲獲得同樣樣的抗菌菌素抗性性能力。。2、質粒粒DNA分子可可以持續(xù)續(xù)穩(wěn)定地地處于染染色體外外地游離離狀態(tài)，，但在一一定地條條件下又又會可逆逆地整合合到寄主主染色體體上，隨隨著染色色體地復復制而復復制，并并通過細細胞分裂裂傳遞到到后代。。3、質粒粒DNA不僅能能在細菌菌中復制制，并且且在添加加真核復復制信號號和啟動動子后，，可以構構建出能能在原核核和真核核細胞中中均可復復制的穿穿梭質粒粒，并在在真核細細胞中表表達，因因此這類類載體在在基因工工程中應應用廣泛泛。4、環(huán)形形雙鏈的的質粒DNA分分子具有有三種不不同的構構型：共共價閉合合環(huán)狀DNA（（cccDNA），開開環(huán)DNA（ocDNA），，線性DNA（（cDNA），，具有不不同的電電泳遷移移率，可可在瓊脂脂糖凝膠膠電泳中中分開。（二）、、質粒的的拷貝數數與不親親和性1、質粒的拷拷貝數是指某種種質粒在在一個細細菌細胞胞內的數數目。根據每個個寄主細細胞中質質?？截愗悢档亩喽嗌?，把把質粒分分為嚴緊緊型復制制質粒（（拷貝數數少，為為1-5個）與與松弛型型復制質質粒（拷拷貝數多多，可達達10-200份拷貝貝）。因因此，作作為載體體的質粒粒應該是是松弛型型的。2、質粒的不不親和性性，有時也也稱為不不相容性性，是指指在沒有有選擇壓壓力的情情況下，，兩種親親緣關系系密切的的不同質質粒，不不能夠在在同一個個寄主細細胞系中中穩(wěn)定地地共存的的現象。。在細胞胞的增殖殖構成中中，其中中必然有有一種會會被逐漸漸地排斥斥（稀釋釋）掉。。這樣的的兩種質質粒稱為為不親和和質粒。。15.4Vectors二、質粒粒DNA的分離離與純化化15.4Vectors三、質粒粒載體的的構建及及類型（一）質質粒載體體的發(fā)展展概況；；（二）質質粒載體體的特點點（基本本條件））；（三）遺遺傳標記記基因（四）質質粒載體體的類型型15.4Vectors（一）發(fā)發(fā)展概況況1.第第一階階段（1977年前））：天然質粒粒和重組組質粒的的利用，，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第第二階階段：增大載體體容量（（降低載載體長度度），建建立多克克隆位點點區(qū)和新新的遺傳傳標記基基因。如如pUC系列載載體。3.第第三階段段：進一步完完善載體體功能以以滿足基基因工程程克隆中中的不同同要求，，如M13mp系列載載體，含含T3，，T7，，sp6啟動子子載體，，表達型型載體及及各種探探針型載載體。15.4Vectors（二）載體體特點1、至少少有一個復復制起點，，因而至少少可在一種種生物體中中自主復制制。2、至少應有一一個克隆位位點，以供供外源DNA插入。。3、至少應有一一個遺傳標標記基因，，以指示載載體或重組組DNA分分子是否進進入宿主細細胞。4、具有較較小的分子子量和較高高的拷貝數數。注：前三個個特點必不不可少。（三）遺傳傳標記基因因1、、標標記記基基因因的的作作用用1））指指示示外外源源DNA分分子子（（載載體體或或重重組組分分子子））是否否進進入入宿宿主主細細胞胞這種種指指示示可可以以是是選選擇擇性性的的（（Ampr，Tetr，Kanr），，也也可可以以是是非非選選擇擇性性的的（（如如lacZ））2））指指示示外外源源DNA分分子子是否否插插入入載載體體分分子子形成成了了重重組組子子。。*這這種種指指示示也也可可以以是是選擇擇性性的（（如如TcS），，也也可可以以是是非選選擇擇性性的（（如如TcS，lacZαα）），，絕絕大大多多數數為為后后者者。。**有有的的遺遺傳傳標標記記基基因因可可以以完完成成上上述述兩兩項項作作用用。。當當充充任任第第一一作作用用時時，，最最好好是是選選擇擇性性標標記記基基因因；；當當完完成成第第二二作作用用時時，，目目前前多多采采用用非非選選擇擇性性的的——檢檢測測性性標標記記基基因因。。有有的的基基因因是是不不能能用用作作選選擇擇性性標標記記基基因因（（lacZ等等））。。2、標標記記基因因的種種類1）抗性標標記基基因（可直直接用用于選選擇轉轉化子子）主要是是抗生素素抗性性基因因:Ampr，Tetr，Cmlr，Kanr，Strr2）生化標標記基基因其表達達產物物可催催化某某些易易檢測測的生生化反反應，，如lacZ3、常常用的的遺傳傳標記記基因因及其其作用用機制制1)四環(huán)素素抗性性基因因（Tetr，Tcr）Tetracycline可可結結合在在核糖糖體30s亞基基中的的一種種蛋白白質分分子上上，抑抑制核核糖體體的轉轉位過過程。。四環(huán)環(huán)素抗抗性基基因編編碼一一種399AAs蛋白白質，，與細細菌細細胞膜膜結合合，阻止四四環(huán)素素分子子進入入細菌細細胞。。2)氨芐青青霉素素抗性性基因因（Ampr，Apr）Ampicillin可可抑制制細菌菌細胞胞膜上上參與與細胞胞壁合合成酶酶類的的活性性。Apr抗性基基因編編碼一一種分分泌到到細菌菌細胞胞周間間質的的酶，，可特特異地地切割氨芐青青霉素素的ββ—內內酰胺胺環(huán)，，使氨氨芐青青霉素素失活活。3)氯霉素素抗性性基因因（Cmlr，Cmr）Chlorophenicol可可結合合在核核糖體體50S亞基基上，，阻止止蛋白白質合合成。。Cmr基因編編碼氯氯霉素素乙酰酰轉移移酶，，使氯氯霉素素乙?；?，導致致乙酰酰化的的氯霉霉素不不能結結合在在核糖糖體上上。4)卡那霉霉素(Kanr),新新霉霉素(Neor)和G418抗抗性(G418r)基因因Kanamycin，Neomycin和和G418均屬屬脫氧氧鏈霉霉胺氨氨基葡葡萄糖糖苷類類抗生生素，，可結結合在在核糖糖體上上阻止止蛋白白質的的合成成。Kanr等抗性基基因均均可使使這類類抗生生素磷酸化化，使之之不能能進入入細胞胞內。。5）β—半半乳糖糖苷酶酶基因因（lacZ和和lacZαα）β—半乳糖糖苷酶基因因有1021AAs，基因因產物裝配配為四聚體體后才有酶酶活。該蛋蛋白質可分分為兩部分分：α鏈和和β鏈。前前者負責四四聚體裝配配，后者具具β—半乳乳糖苷酶活活性；只有有當兩者都都存在時，，才會表現現出酶活性性，該作用用稱之為α-互補作作用。這兩個部部分可獨立立存在，分分別由兩兩個基因編編碼。為αα鏈編碼的的基因稱之之為lacZαα(編碼145AAs)。這這兩個基因因（LacZ和LacZα））均可作為為標記基因因。lacZ（（lacZα）中含含有多克隆隆位點，當當無外源DNA片段段插入時，，質粒表達達β—半乳乳糖苷酶的的α-肽，，與缺失突突變體宿主主菌（不能能編碼α-肽）表達達的lacZ基因產產物（ββ鏈）互補補，產生有有活性的ββ—半乳糖糖苷酶，在在含有指示示劑X-gal和誘誘導劑IPTG的存存在下，菌菌落呈現蘭蘭色；外源源基因的插插入后，破破壞了lacZαα-肽基因因的結構，，細菌內不不能產生ββ—半乳糖糖苷酶活性性，菌落呈呈白色。β—半乳糖糖苷酶基因因的優(yōu)點:a.酶催化X-Gal水水解為蘭色色產物，檢檢測直觀b.lacZαα編碼5‘‘-端可容容許很大的的變化（如如加入多克克隆位點））而不影響響酶活性c.lacZα和和β鏈基因因的分別表表達可使載載體小而容容量大

PLacZαLacZβ

轉錄

翻譯

αβLacZ基基因的結構構與產物pUC18BamHI片段重組DNA分子轉化E.coli

外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子（四）、質質粒載體的的類型1、根據載載體的分子子生物學特特性劃分（1）.質質粒型載體體—環(huán)狀dsDNA分子子，自主復復制（2）.病病毒型載載體—環(huán)狀、線狀狀、ss-和ds-DNA分分子，形成成病毒顆粒粒（3）.混合合型載體—具質粒和病毒毒特性，特性性的轉換依賴賴于宿主細胞胞生物學特性性15.4Vectors2、根據載體體功能劃分（1）.普通型載體1)特點:至少有一一個以上的克克隆位點和兩兩個標記基因因，其中一個個用于轉化化體選擇，另另一個用于重重組子檢測。。2)用途:基因組或或cDNA文文庫的構建;次克隆(subcloning)或限制酶譜譜分析；外源源DNA擴增增。例子:pBR322和pUC載體。上述兩例中的的非重組子來來源有兩個：：a.

酶切切反應時仍未未被作用的pBR322或pUC18分子b.酶切后后的載體分子子經自我連接接又形成載體體分子15.4VectorspUC18和和pUC19載體普通型載體pBR322的結構圖（2）、表達型載體（（expressionvector）1)特點:a.基因的的啟動子序列列和終止子序序列；b.一般無無檢測標記基基因；c.

克隆隆位點是確定定的（即位于于啟動子序列列后）；d.重組分分子用凝膠電電泳檢出（依依賴于分子量量差異）。2)結構:a.轉化單單元--宿主主細胞轉化b.表達單單元--外源源基因表達3)類型:Ⅰ型：轉錄起始區(qū)區(qū)（調控序列列+啟動子））+終止子子Ⅱ型:轉錄起起始區(qū)終止子子+翻譯譯起始區(qū)（核核糖體結合序序列和起始密密碼子）+終終止子Ⅲ型:轉錄起始始區(qū)+翻翻譯起始區(qū)+信號肽肽鏈編碼區(qū)+終止子子（常稱之為為表達分泌型型載體）15.4Vectors三種表達型載載體結構圖15.4VectorsPlasmidsEasytouseandstore.Recombinantplasmidsreadilyselectedwithantibiotics.LambdaphageUsefulforcloninglarge(15-20Kbfragments).CosmidsCombinedplasmid/phagevectorpermitscloningofevenlarger(e.g.45Kb)DNAfragments.YeastplasmidsPermitdirectstudiesoneukaryoticgeneregulation.PlantplasmidsBacterial(Agrobacterium)infectionofplanttransfersTiplasmidintohostplantcells.TypeofVectorAdvantage四、常用質質粒載體舉舉例1、pBR322載載體2、pUC載體15.4Vectors1、pBR322載載體優(yōu)點：1、分子量量較小，為為4363bp，不不僅利于自自身DNA的純化，，可容納的的外源DNA也較大大。2、具有兩兩種抗菌素素抗性基因因可供轉化化子的選擇擇記號。3、具有較較高的拷貝貝數，經過過氯霉素擴擴增后，每每個細胞中中可累積1000-3000個拷貝，，為重組體體DNA的的制備提供供了極大的的方便。15.4Vectors利用抗生素素抗性基因因篩選重組組子的過程程

BamHI片段(Tcr)

pBR322PstI(Apr)片段

重組分子I

重組分子Ⅱ(ApsTcr)

(AprTcs）

PstI片段

外源DNABamHI片段重組分子I

涂布Ap平板Apr轉化子

分別轉化E.coli(ApSTcS)

重組分子Ⅱ涂布Tc平板Tcr轉化子影印到Tc平板上AprTcS為重組子AprTcr為原載體

影印到Ap平板上ApSTcr為重組子即為非重組子篩選重組子子的示意圖圖2、pUC18和pUC19pUC系列列質粒載體體具有三個個顯著特點點：（1）、分分子量更小小，僅為2.7KB，容納外外源DNA量增大；；具有更高高的拷貝數數（不用氯氯霉素擴增增，每個細細胞含500-700個拷貝貝）。（2）、含含易于檢測測是否有外外源DNA插入的標標記基因LacZαα，可利用用-互補原原理進行藍藍白篩選。。（3）、多多克隆位點點區(qū)（MCS）由人工合成成的多個單單一酶切位位點構成。。每一種限限制性內切切酶會產生生不同的粘粘性末端，，可選用兩兩種內切酶酶組合在質質粒載體和和外源DNA上產生生相同的末末端，進行行雙粘端連連接，既提提高克隆的的效率，又又可以定向向克隆。其MCS區(qū)區(qū)與M13mp噬菌菌體載體的的相同，可可使pUC上克隆的的目的基因因直接轉移移到M13mp載體體，進行DNA測序序和體外突突變等研究究。15.4VectorspUC18和pUC19載體體利用菌落顏顏色篩選重重組子15.4CloningStrategiesforIdentifyingSpecificGenes過程優(yōu)點缺點直接分離法（鳥槍法）操作簡便工作量大，有盲目性，目的基因含有不表達的內含子人工合成法反轉錄法專一性強，目的基因中不含內含子操作過程麻煩。mRNA生存時間短，技術要求高由氨基酸序列合成據推測出的核苷酸序列，通過化學方法合成

專一性最強，目的基因不含內含子，可合成自然界不存在的基因目前，復雜的尚不知核苷酸序列的基因不能合成供體細胞中DNA限制性酶運載體DNA片段不同受體細胞DNA片段段擴增找出目的基因細細胞目的基因mRNA逆轉錄單鏈DNA合成雙鏈DNA獲取目的基基因的方法法重組DNA操作過程程示意圖15.4CloningStrategiesforIdentifyingSpecificGenes9、靜夜四四無鄰，，荒居舊舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黃黃葉樹，，燈下白白頭人。。。06:00:3906:00:3906:0012/23/20226:00:39AM11、以我獨沈久久，愧君相見見頻。。12月-2206:00:3906:00Dec-2223-Dec-2212、故人江海別別，幾度隔山山川。。06:00:3906:00:3906:00Friday,December23,202213、乍見翻翻疑夢，，相悲各各問年。。。12月-2212月-2206:00:3906:00:39December23,202214、他鄉(xiāng)生白發(fā)發(fā)，舊國見青青山。。23十二月月20226:00:39上午06:00:3912月-2215、比不不了得得就不不比，，得不不到的的就不不要。。。。十二月月226:00上上午午12月月-2206:00December23,202216、行動動出成成果，，工作作出財財富。。。2022/12/236:00:3906:00:3923December202217、做前前，能能夠環(huán)環(huán)視四四周；；做時時，你你只能能或者者最好好沿著著以腳腳為起起點的的射線線向前前。。。6:00:39