基因重組及遺傳

第五章細菌基因重組及遺傳分析基因重組（generecombination）是指不同來源的遺傳物質通過轉移和交換而重新組合的過程。高等動植物和許多產生有性孢子的真核微生物的基因重組都是通過有性世代來完成。在細菌中，提供部分遺傳物質或少數(shù)基因的一方稱為供體（donor），而獲得基因的另一方稱為受體（recipient）。第一節(jié)轉化（Transformation）轉化：是指某一基因型的細胞從周圍介質中吸收來自另一基因型細胞的DNA而使受體的基因型和表型發(fā)生相應變化的現(xiàn)象。轉化現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和轉化因子的證實對促進現(xiàn)代分子生物學的誕生和發(fā)展產生了巨大的推動作用。

在實驗室條件下，通常用CaCl2、cAMP、低溫培養(yǎng)、PEG介導及電脈沖等方法轉化細菌或其它微生物。細菌轉化的過程大體可分為三個階段：感受態(tài)的出現(xiàn)DNA的吸附和進入DNA的整合感受態(tài)的出現(xiàn)

感受態(tài)（competence）：是指受體菌細胞最容易接受外源DNA并使之不被DNA酶降解的生理狀態(tài)。一、轉化過程和機制

細菌細胞在特定時期產生一種稱為感受態(tài)因子的小分子蛋白（5-10kD）。這種感受態(tài)因子可與細胞表面受體蛋白結合，使細胞產生感受態(tài)特異蛋白，其中包括細胞壁自溶素。自溶素使細胞表面的DNA結合蛋白及核酸酶裸露出來，使其具有與DNA結合的活性。因此，當細菌表面出現(xiàn)許多DNA結合位點時，就意味著細菌出現(xiàn)了感受態(tài)。

4.進入細胞的單鏈與寄主DNA同源區(qū)重組并整合到染色體上革蘭氏陽性菌1.雙鏈DNA片段在DNA結合蛋白（黑色點）的幫助下吸附到細胞表面并由核酸酶（紫色橢圓）切成缺口2.由核酸酶降解其中一條單鏈3.未被降解的單鏈與感受態(tài)特異蛋白相互作用并進入細胞DNA的吸附和進入

在流感嗜血菌中，其感受態(tài)細胞形成一種結合雙鏈DNA的膜結構，稱為轉化小體（transformasome）。該小體吸附DNA后，與細胞的內外膜相融合而轉入細胞內側，再將雙鏈變成單鏈DNA。

轉化小體雙鏈DNA被轉化小體攝取轉化的雙鏈DNA（30-50kb）結合到膜受體上很快進行同源重組使外源DNA整合到染色體上革蘭氏陰性菌DNA在進入感受態(tài)細胞之前，要經過可逆性吸附和不可逆性吸附?？赡嫖降腄NA對DNA酶敏感，并可以洗脫下來。隨著感受態(tài)細胞膜蛋白的參與，可逆性吸附逐步向不可逆吸附轉化，不可逆吸附DNA對DNA酶不敏感。吸附到細胞表面是雙鏈DNA，而不是單鏈DNA實驗證明：肺炎鏈球菌的轉化因子在100℃下逐漸失去轉化活性(DNA發(fā)生變性)。在逐漸冷卻過程中活性逐漸恢復(單鏈DNA復性成雙鏈)。說明完整的DNA雙鏈結構對于轉化活性來說是必要的，轉化的第一步，需要雙鏈DNA才能結合到細胞表面的結合位點上。當DNA吸附后，被酶解開成單鏈DNA，只有單鏈DNA才能進入細胞內并與受體染色體DNA進行整合。

流感嗜血菌特異性攝取序列：5’AAGTGCGGTCA3’淋病奈瑟球菌特異性攝取序列：5’GCCGTCTCAA3’在流感嗜血菌的染色體上有600個拷貝的攝取序列。攝取序列雖然只有10-12bp，但很少隨機地出現(xiàn)在其他物種的DNA序列中，因此這些細菌對外源DNA的吸收具有選擇性。為什么有些細菌對攝取的DNA有特異性要求呢？近年來的研究表明，G-菌和G＋菌對單鏈DNA也能進行有效轉化，但一般是在較低的pH值下進行的。外源DNA片段在受體細胞中的命運：外源DNA（紅色）轉化到受體細胞后，通過同源重組整合到染色體上，否則被降解成核苷酸。

DNA的整合

轉化為相相同或相相近物種種之間的的同源重重組提供供了可能能性，是是自然界界中基因因交換的的一條重重要途徑徑，在生生物變異異和進化化中起著著重要作作用。轉化的效效率決定定于下列列三個內內在因素素：受體細胞胞的感受受態(tài)，決決定轉化化DNA能否進入入細胞受體細胞胞的限制制系統(tǒng)，，決定轉轉化DNA在整合前前是否被被分解供體和受受體DNA的同源性性，決定定轉化DNA的整合。。由于轉轉化DNA總是與順順序相同同或相似似的受體體DNA配合，所所以親緣緣關系越越近的其其同源性性也越強強，轉化化效率也也越高。。二、人工工轉化通過二價價陽離子子處理，，大腸桿桿菌等部部分G-細菌能產產生感受受態(tài)通過制備備原生質質，大多多數(shù)細菌菌特別是是某些G+細菌已知許多多細菌包包括大腸腸桿菌均均無自然然轉化的的能力，，但經人人工誘導導可使它它們形成成感受態(tài)態(tài)。如：：1970年Mandel和Higa首先發(fā)現(xiàn)現(xiàn)DNA在含有高高濃度Ca2+的條件下下能夠被被受體細細胞攝入入和轉化化，隨后后的實驗驗證明由由Ca2+誘導的人人工轉化化的大腸腸桿菌中中，其轉轉化DNA必須是一一種獨立立DNA復制子。。大腸桿菌菌的轉化化隨著研究究技術的的改進和和經驗的的積累，，人們已已經建立立了用Ca2+、Mg2+等誘導轉轉化的標標準程序序，能對對大腸桿桿菌菌株株C600、JMl01、JMl09、DH5a等進行有有效的轉轉化。先將大腸腸桿菌培培養(yǎng)至OD600=0.5～1接著用50-100mmol／LCaCl2處理制備備成感受受態(tài)細胞胞然后將DNA與感受態(tài)態(tài)細胞混混合在冰浴中中反應20-40min進行42℃熱擊可增增加DNA的吸收（（107個轉化子/ug質粒DNA）最經典的轉化化方法是：由于異源的質質粒DNA分子能夠進入入大腸桿菌細細胞，所以大大腸桿菌攝取取DNA是非選擇性的的。PEG介導的轉化不能自然形成成感受態(tài)的G+細菌如枯草芽芽孢桿菌和放放線菌，可通通過聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG，一般用PEG6000)的作用實現(xiàn)轉轉化。這類細菌必須須首先用細胞胞壁降解酶完完全除去它們們的肽聚糖層層，然后使其其維持在等滲滲的培養(yǎng)基中中，在PEG存在下，質粒粒或噬菌體DNA可被高效地導導入原生質體體。電脈沖法（電穿孔法）在許多細菌和和真核系統(tǒng)中中，它們既無無自然的感受受態(tài)呈現(xiàn)也不不能用上述的的方法建立感感受態(tài)。因此此人們發(fā)展了了一種新的將將核酸分子導導入細胞的方方法，最突出出的是電穿孔(electroporation)法和基因槍(biolistic)轉化法。電穿孔法：是用高壓脈沖沖電流擊破細細胞膜或將細細胞膜擊成小小孔，使各種種大分子(包括DNA)能通過這些小小孔進入細胞胞，所以又稱稱電轉化。電場強度、電電脈沖的長度度和DNA濃度基因槍(biolistic)轉化基因槍轉化法法首先由Sanford報道，該方法法是將包裹有有DNA的鎢顆粒像子子彈一樣用高高壓射進細胞胞并使DNA留在細胞內，，特別是留在在細胞器中。。用這種方法首首次成功地將將DNA導入酵母線粒粒體并引起線線粒體遺傳變變化?；驑寴屴D化現(xiàn)在被被廣泛地應用用于植物的轉轉化中三、建立轉化化方法的策略略被轉化對象（（轉化受體））轉化DNA的構建（目的的）轉化方法選擇擇四、轉化應用用在轉化中，如如果轉化因子子的兩個基因因是連鎖的，，那么它們可可以同時被轉轉化，也稱為為共轉化，連連鎖的兩個基基因距離越近近，其共轉化化頻率越高，，反之則低。。利用共轉化化率和連鎖的的二基因間的的距離的反比比關系可進行行基因定位的的工作。1.連鎖檢測2.遺傳圖譜的繪繪制trp2+his2+tyr1+（供體）×trp2-his2-tyr1-（受體）的轉轉化類型trp2-his2重組率=2600+107+3660+418×100%=34%11940+1180+2600+107+3660+418trp2-tyr1重組率=2600+1180+3660+685×100%=40%11940+107+2600+1180+3660+685his2-tyr1重組率=418+1180+685+107×100%=13%11940+3660+418+1180+685+107trp2his2tyr1

3413403.基因中斷4.插入基因第二節(jié)接合合作用（conjugation）接合作用：是指在供體細細胞和受體細細胞直接接觸觸后，質粒從從供體細胞向向受體細胞轉轉移的過程，，也稱細菌雜雜交。一、接合現(xiàn)象象的發(fā)現(xiàn)與證證實Lederberg和Tatum（1946年）建立了用用大腸桿菌K12的兩個營養(yǎng)缺缺陷型菌株在在基本培養(yǎng)基基上是否生長長，來檢驗細細菌雜交或重重組存在的方方法。在此以以前，沒有人人證實細菌雜雜交現(xiàn)象。細細菌雜交有別別于典型的有有性雜交，故故稱為細菌接接合作用。A菌株B菌株混合培培養(yǎng)后后在基基本培培養(yǎng)基基中出出現(xiàn)的的原養(yǎng)養(yǎng)型菌菌落是是否是是雜交交的結結果？？必須要排除下下列幾種解釋釋：一是細菌細胞胞并沒有接合合，而是交換換了DNA(轉化作用)二是細胞并未未接合，而是是通過培養(yǎng)基基交換了養(yǎng)料料(互養(yǎng))三是細菌細胞胞并未接合而而是親本發(fā)生生了回復突變當時Lederberg和Tatum已經證明，當當把A菌株的培養(yǎng)液液經過滅菌，，再加入到B菌株的培養(yǎng)液液中，沒有原原養(yǎng)型菌落，，這說明上述述實驗并非轉轉化的結果。。1950年，Davis通過他的U形管試驗進一一步支持了Lederberg和Tatum的結論論。1.轉化作作用的的排除除營養(yǎng)缺缺陷型型細胞胞通過過培養(yǎng)養(yǎng)基交交換養(yǎng)養(yǎng)料而而生長長的現(xiàn)現(xiàn)象亦亦稱為為互養(yǎng)。2.互養(yǎng)的的排除除在A-B+T1s和A+B-T1r的雜雜交交中中，，將將基基因因型型A-B+T1s和A+B-T1r兩種種細細菌菌在在基基本本培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上混混合合培培養(yǎng)養(yǎng)，，接接觸觸較較短短的的一一段段時時間間以以后后，，噴噴上上噬噬菌菌體體T1，把把A-B+T1s細菌菌殺殺死死。。經培培養(yǎng)養(yǎng)以以后后仍仍有有原原養(yǎng)養(yǎng)型型菌菌落落出出現(xiàn)現(xiàn)，，這這說說明明原原養(yǎng)養(yǎng)型型菌菌落落的的出出現(xiàn)現(xiàn)并并非非由由于于互互養(yǎng)養(yǎng)。。因為為大大腸腸桿桿菌菌的的突突變變率率一一般般都都<10-8，若若兩兩個個基基因因同同時時回回復復突突變變，，則則其其可可能能性性只只有有<10-16（10-8×10-8），，這這種種幾幾率率在在平平板板上上是是很很難難檢檢測測到到的的，，所所以以混混合合培培養(yǎng)養(yǎng)能能出出現(xiàn)現(xiàn)10-5~10-6頻率的的菌落落一定定是重重組的的結果果。3.回復突突變的的排除除4.遺傳物物質的的單向向轉移移正交實實驗（A）Strs×（B）Strr用鏈霉霉素將將A菌株殺殺死重組體體的數(shù)數(shù)目變變化不不大(A)Strr×(B)Strs將B菌株殺殺死一個重重組體體也沒沒有出出現(xiàn)反交實實驗（A）met-bio-（Strr或Strs）×（B）thr-leu-thi-（Strs或Strr）Hayse（1952）用正反雜雜交實驗證證明，細菌菌重組的發(fā)發(fā)生只是染染色體單方方向的轉移移，而且染染色體的轉轉移往往不不完全。把A菌株認為是是供體，而B菌株是受體A菌株作為遺遺傳物質的的供體，當當鏈霉素對對它進行滅滅活以后，，并未影響響它傳遞遺遺傳物質的的能力。B菌株作為遺遺傳物質的的受體，一一旦被鏈霉霉素殺死以以后，必然然不能出現(xiàn)現(xiàn)重組體。。供體菌株又又稱為雄性細胞，受體菌株株又稱為雌性細胞StrrA突變型（不不育變種））⊙置冰箱1年后供體的的A菌株Strr×B菌株Strs可育的StrsA菌株共培養(yǎng)，一一起繁殖不能得到雜雜交子StrrA菌株×B菌株Strs恢復了StrrA突變型的可可育性F質粒的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)(Hayes)①大腸桿菌的的供體或雄雄性細胞(如A菌株)記為F+，帶有一個個性因子或或致育因子F(fertilityfactor)，而另一個個不帶性因因子F的受體或雌雌性細胞(如B菌株)叫做F-；②雜交F+×F-是可育的，，雜交F-×F-是不育的；；③F因子可以傳傳遞，從F+到F-細菌，但必必須通過細細胞接觸④F因子能夠自自發(fā)喪失，，一旦喪失失就不能再再恢復，除除非從另一一個F+細胞再把它它傳遞過來來。分析結果：：F因子是染色色體外的一一種遺傳結結構，也就就是質粒(plasmid)。F+是一種遺傳傳性狀F因子的存在在使細菌成成為F+F因子的喪失失使細菌成成為F-F+細菌分裂仍仍得到F+細胞二、F質粒的結構構及其在細細胞中的存存在狀態(tài)F質粒的遺傳傳結構F質粒的基因因組由三個個主要區(qū)段段組成：轉轉移區(qū)、復復制區(qū)、插插入?yún)^(qū)。長度為33kb，由23個基因組成成，構成一一個tra操縱子(traoperon)。traABCEFGHKLQUVW與性菌毛的的形成有關關traYZMIGD等與F因子的轉移移有關traG、traN影響雜交對對的配對形形成與否traI、traM決定DNA轉移起始traI編碼解旋酶酶I(helicaseⅠ)traD控制DNA轉移；traY、traZ編碼的核酸酸內切酶能能在轉移起起始區(qū)oriT上切開一個個缺口。（1）轉移區(qū)(transferregion)復制區(qū)負責責F質粒的自我我復制F質粒自主復復制區(qū)為oriV（Vegetativeoriginofreplication），在oriV中包含含有復復制起起點。。F質粒的的復制制是按按θ型方式式進行行復制制，它它是一一種嚴嚴緊型型質粒粒。F質粒的的拷貝貝數(shù)能能被精精確地地控制制，一一個寄寄主細細胞約約有1~2個F質粒。。rep（Freplicativeprotein）編碼一一組與與F質粒復復制相相關的的蛋白白質。。inc（incompatibility）基因產產物使使細胞胞具有有不相相容性性。（2）復制制區(qū)（（replicationregion）F質粒插插入?yún)^(qū)區(qū)包含含4個插入入順序序：2個IS31個IS21個Tn1000（γδ）它們與與F質粒的的整合合、切切除、、易位位有關關（3）插入入?yún)^(qū)（（insertionregion）2.F質粒在在細胞胞內的的存在在形式式根據(jù)大大腸桿桿菌細細胞內內有無無F質粒及及F質粒在在細胞胞內的的存在在狀態(tài)態(tài)可將將細胞胞分為為4種類型型：F-、F+、Hfr、F’。F-：是細胞胞內不不含F(xiàn)質粒；；F+：是細胞胞內含含有F質粒且且獨立立染色色體外外；Hfr菌株(highfrequencyrecombinationstrain)：高頻重重組菌菌株：：是F質粒整整合到到宿主主的染染色體體上，，隨著著宿主主染色色體的的復制制而復復制；；F’是指攜攜帶了了宿主主的一一部分分染色色體的的F質粒。三、F質粒與接合作作用1.F+×F-雜交有F質粒的細胞在在形態(tài)學上可可以與F-明顯區(qū)別。除除了共有的大大量表面菌毛毛以外，F(xiàn)+還有少量（通通常在細胞對對數(shù)生長期中中只有1~3根）性菌毛。。纖細的蛋白白質性菌毛有有的長數(shù)毫米米，直徑約為為8nm。性菌毛在細細菌的接合過過程中起著十十分重要的作作用。2.Hfr×F-雜交Hfr菌株是怎樣形形成的呢?F質粒有兩種方方式整合到染染色體上：同同源重組、質質粒和染色體體共有插入序序列和轉座子子。大腸桿菌菌染色體基因因組有7個IS1、13個IS2及6個IS3；F質粒有1個IS2和2個IS3。3.F’’×F-雜交F質粒在脫離Hfr細胞的染色體體時也會發(fā)生生差錯，從而而形成帶有細細菌染色體基基因的F′質粒。而F′因子又可通過過交換融合到到細菌染色體體的原來位置置上，回復到到原來的Hfr狀態(tài)。由于在F’×F-接合使用中能能專一性地向向F-轉移F′質粒攜帶的供供體基因，因因而通過F′因子的轉移而而使受體菌改改變其遺傳性性狀，這種現(xiàn)現(xiàn)象也被稱為為F因子轉導。四、中斷雜交交試驗和基因因定位中斷雜交：就是將兩個菌菌株（例如Hfra+strs×F-astrr）在培養(yǎng)液中中進行通風培培養(yǎng)，每隔一一定時間取樣樣，把菌液放放入組織搗碎碎器里攪拌以以中斷雜交，，經過稀釋接接種到鑒別培培養(yǎng)基上，待待形成菌落后后鑒定它們的的基因型。1957年Wollman和Jacob首次進行中斷斷雜交實驗：：供體菌：HfrHstrsthr+leu+azistonslac+gal+受體菌：F-strrthr?leu-azirtonrlac-gal-0azitonlacgalF0thrlactrphisthyargstrF282745616973Peptide-inducedtransferofEnterococcusfaecalisplasmidpCF10.(A)PeptidepheromonecCF10(triangles)isexpressedfromthechromosomeofbothplasmid-containingdonorcellsandplasmid-freerecipientcells.Inhibitorpeptide(stars)isexpressedfrompCF10andsecretedintothemediumtopreventpheromonefromthedonorcellfrominducingitself,probablythroughcompetitivebindingtothepheromonebindingproteinPrgZ.(B)PheromonefromanearbyrecipientcellisdetectedbyPrgZ.PrgZimportsthepeptidepheromoneusingthechromosomallyencodedOpp(Oligopeptidepermease)system.(C)ImportedcCF10inducesexpressionoftransfergenes,includingthecell–surfaceadhesinPrgB.(D)PrgBmediatesaggregationofthedonorandrecipientcells.Amatingchannelisthenformedandsingle-strandedpCF10istransferredtothedonorcellviaarollingcirclemechanism.AfterpCF10hasestablisheditselfintherecipientcell,theinhibitorpeptideandanothermechanismofnegativecontrol,PrgY,isexpressedtopreventself-inductionbyendogenouscCF10.第三節(jié)轉轉導(transduction)轉導：是利用噬噬菌體為媒媒介，將供供體菌的部部分DNA轉移到受體體菌內的現(xiàn)現(xiàn)象。因為為絕大多數(shù)數(shù)細菌都有有噬菌體，，所以轉導導作用較普普遍。另外外，轉導DNA位于噬菌體體蛋白外殼殼內，不易易被外界的的DNA水解酶所破破壞，所以以比較穩(wěn)定定。局限性轉導導：被轉導的DNA片段僅僅是是那些靠近近染色體上溶源化化位點的基基因轉導普遍性轉導導：任何供體的的染色體都都可以轉移移至受體細細胞1952年Lederberg和他的學生生Zinder把鼠傷寒沙沙門菌的一一個突變菌菌株LT22(trp-)和另一個突突變菌株LT2(his-)在基本培養(yǎng)養(yǎng)基上進行行混合培養(yǎng)養(yǎng)，結果在在107細胞中得到到大約100個原養(yǎng)型菌菌落。一、轉導現(xiàn)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)LT2菌株LT22菌株中間用濾板隔開U形管實驗①可過濾因子子并不由于于DNA酶的處理而而失活；②可過濾濾因子和從從溶源性的的LT22菌株得來的的噬菌體(稱為P22)具有相同的的大小和質質量；③可過濾濾因子加熱熱后失活，，用抗P22血清清處處理理后后也也失失活活；；④把把P22與LT2和LT22菌株株分分別別混混合合培培養(yǎng)養(yǎng)，，在在基基本本培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上不不出出現(xiàn)現(xiàn)原原養(yǎng)養(yǎng)型型菌菌落落。。結果果證證實實了了可可過過濾濾因因子子是是溫溫和和噬噬菌菌體體P22。這這就就是是最最早早發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的的轉導導現(xiàn)現(xiàn)象象。通過過一一系系列列的的實實驗驗，，證證實實可可過過濾濾因因子子具具有有下下列列一一些些特特性性：：轉導導過過程程中中有有三三個個組組成成部部分分，，即即供體體、、噬噬菌菌體體和和受受體體。這這種種導導致致基基因因重重組組的的方方式式不不同同于于轉轉化化，，轉轉化化需需要要供供體體DNA和受體細細胞接觸觸，而轉轉導則是是以噬菌菌體為媒媒介將供供體遺傳傳物質傳傳給受體體，無需需DNA和受體細細胞接觸觸。轉導可分分為普遍性轉轉導和局局限性轉轉導，普遍性性轉導又又可分為為完全轉導導和流產產轉導。二、普遍遍性轉導導1.完全轉導導P1供體收收集子代代噬菌體體菌苔計數(shù)數(shù)噬菌體體（完全培培養(yǎng)基））受體（缺陷型型大腸桿桿菌）選出重組組子（轉導子子）（基本培培養(yǎng)基））侵染裂裂解侵侵染野生型轉導頻率率=轉導子數(shù)數(shù)×100%=轉導子數(shù)數(shù)×100%侵染受體體的P1顆粒數(shù)噬噬菌斑斑數(shù)+轉導子數(shù)數(shù)2.流產轉轉導3.普遍性性轉導導在遺遺傳學學和分分子生生物學學研究究中的的應用用(1)共轉導導：普遍性性轉導導的重重要應應用之之一是是通過過測定定共轉轉導的的頻率率進行行基因因定位位，所所謂共轉導導(cotransduction)是指兩兩個處處在一一個轉轉導片片段上上的基基因一一起整整合進進受體體染色色體中中。被共轉轉導的的兩個個基因因之間間的距距離不不能超超過轉轉導噬噬菌體體所能能包裝裝的DNA長度，，而且且越是是緊密密連鎖鎖的基基因其其共轉轉導頻頻率也也越高高。F為共轉轉導頻頻率，，d為基因因間距距離，，L為轉導導片段段長度度（這這里指指噬菌菌體基基因組組長度度，用用分鐘鐘表示示）F=(1－d/L)3d=L(1－3√F)以thr+leu+為供體，以以thr-leu-為受體的P1噬菌體轉導導實驗中，，得到1%的thr+leu+轉導子，計計算thr和leu之間的遺傳傳圖距。（（P1噬菌體基因因組約為大大腸桿菌染染色體長度度的2.4%）d=2.4×(1－3√0.01)=2.4×(1-0.215)=1.883(2)三點雜交法法：P1噬菌體所進進行的共轉轉導被廣泛泛應用于大大腸桿菌的的基因定位位中。1955年Lennox用P1噬菌體轉導導寄主大腸腸桿菌染色色體，研究究基因連鎖鎖關系時發(fā)發(fā)現(xiàn)，thr和leu有時能、有有時不能與與第三個基基因ara共轉導。他用P1噬菌體感染染供體(thr+leu+ara+)，用所得到到的噬菌體裂解液去去感染受體體菌(thr-leu-ara-)，得到的結結果。實驗1可知：ara基因與leu基因靠得較較近，而與與thr基因相距較較遠，排列列順序應是是thr-ara-leu或thr-leu-ara。如果是前一一種情況，，則thr+leu+轉導子應該該大多數(shù)含含有ara+基因；如果是后后一種形式式，則thr+leu+轉導子應該該很少含有有是ara+，或者根本本沒有。而由實驗2可知，thr+leu+轉導子同時時又是ara+的占85％，所以上上述3個基因的排排列順序是是第1種。三、局限性性轉導(specializedtransduction)局限性轉導導：是指以噬菌菌體為媒介介，只能將將供體菌特特定的一個個或幾個基因轉移到受體體菌中的轉轉導現(xiàn)象。。導致局限性性轉導的一一般都是溫溫和噬菌體體，它們在在供體菌染染色體上具具有特定的的整合位點點。在某些些條件下，，當這種整整合狀的原原噬菌體脫離寄寄主染色色體時，，偶爾會會將整合合位點兩兩端相鄰鄰的基因錯誤地切切離下來來，并組組裝到噬噬菌體顆顆粒中。。當這種種噬菌體體感染另另一細菌菌時，就就將原寄寄主的基因轉移到另另一細菌菌中。1高頻轉導導的原理理不正常環(huán)環(huán)出形成成特殊性轉轉導顆粒粒這種缺陷陷噬菌體亦是轉導導噬菌體，它具有感感染能力力，能整整合到寄寄主染色色體相同同的位點點上形成成穩(wěn)定的的轉導子子。所得轉導導子的頻頻率約為為10-6，稱為低低頻轉導導。當攜帶有gal基因的λ缺陷噬菌菌體和正正常的λ噬菌體在在同一細細胞時，，正常λ噬菌體整整合到寄主的染色體體上后，，產生兩個雜合合(細菌/噬菌體)att位點，λdgal缺陷噬菌菌體就可可以整合合到該位位點上。。高頻轉導導子的形形成雜基因子子重組性轉轉導再次整合合導致溶溶源性轉轉導正常λ噬菌體幫助λdgal缺陷噬菌菌體整合合和繁殖殖，因此此被稱為為助手噬菌菌體（helperphage）。這種轉轉導子不不穩(wěn)定，，因為原原噬菌體體很容易易被誘導導切離下下來。在這種切切離的裂裂解物中中，有一一半是正正常λ噬菌體，，另一半半為λdgal缺陷噬菌菌體。如如果用這這種裂解解物去轉轉導另一一個Gal-菌株，其其轉化頻頻率理論論上可達達50%，所以也也稱之為為高頻轉導導。CRISPR結結構及作作用機理理CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)為規(guī)規(guī)律律成成簇簇間間隔隔短短回回文文重重復復，，是是一一類類廣廣泛泛分分布布于于細細菌菌和和古古菌菌基基因因組組中中的的重重復復結結構構。CRISPR通過過與與一一系系列列相相關關蛋蛋白白、、前前導導序序列列一一起起，，為為原原核核生生物物提提供供對對抗抗噬噬菌菌體體等等外外源源基基因因的的獲獲得得性性免免疫疫能能力力。這種結構最早早于1987年在大腸桿桿菌(Escherichiacoli)K12的iap基因側翼序列列中被發(fā)現(xiàn)，，后來，科學學家利用這個個小片段找到到了一種操作作簡單、可對對多種生物的的基因組進行行遺傳改造的的工具——CRISPR—Cas系統(tǒng)。后續(xù)的遺傳學學試驗和生物物化學試驗也也證實，這些些CRISPR序列與很多病病毒或者質粒粒的DNA序列是互補的的，很有可能能是生物體抵抵御病毒等外外來人侵者的的一套特異性性防御機制，，就像是另外外一套適應性性免疫反應系系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)基本結結構CRISPR系統(tǒng)由前導序序列（leadersequence，LS）、CRISPR基因座座以及一系列列Cas（CRISPR--associated）蛋白組成。Leader序列：Leader序列前導序列列由300～500bp堿基組成，位位于CRISPR的5’端，與第一個個重復序列直直接相連，是是一段在物種種內相對保守守的AT富集的區(qū)域。。有研究表明明前導序列是是新插入序列列的識別位點點，也有研究究指出，它能能夠作為啟動動子，啟動CRISPR基因座的轉錄錄。CRISPR基因座：CRISPR基因座由簡簡短穩(wěn)定的同同向重復序列列(directrepect，，DR)和長長度相近的非非重復的間隔隔序列(spacer)間隔排列而而成，稱為R-S結構。。其中重復序序列的片段長長度在21～～48b，且且含有5～7bp的回回文序列，通通常能形成穩(wěn)穩(wěn)定的莖環(huán)結結構，間隔序序列的長度在在26～72bp，可可能來源于噬噬菌體、質粒粒等外源DNA序列。Cas基因：cas基因是存在于于CRISPR位點附近近的一系列基基因，cas基因簇通常由由4～10個個保守基因組組成，它表達達出的cas蛋白對CRISPR防御御機制的實現(xiàn)現(xiàn)不可或缺。。cas基因根據(jù)其保保守程度可分分為核心cas基因、亞型特特異性cas基因和重復序序列相關未知知蛋白(repeat．．associatedmysteriousproteins，RAMP)組件件基因。cas1～6基因廣廣泛存在于各各種CRISPR亞型中中，故被稱為為核心cas基因，其編碼碼蛋白的功能能現(xiàn)已初步得得到證實，例例如，Casl和Cas2蛋白在所有有CRISPR類型中均均存在，主要要在獲取新的的重復序列過過程中發(fā)揮作作用，Cas3則具有核酸酸酶和解旋酶酶的功能，主主要作用是剪剪切目標基因因。CRISPR的工作原理理當細菌抵御噬噬菌體等外源源DNA入侵侵時，在前導導區(qū)的調控下下CRISPR被轉錄為長的的RNA前體體(PreRISPRRNA，pre-crRNA)，，然后加工成成一系列短的的