農(nóng)藥對桑樹葉斑病的防治畢業(yè)論文

PAGE32PAGE科類農(nóng)學(xué)編號（學(xué)號）20080463本科生畢業(yè)論文云南桑樹病菌初步鑒定及其對咪酰胺的敏感性測定TheIdentificationofMulberryFungusandTheSensitivityofProchlorazinYunnan陳文智指導(dǎo)教師：杜飛職稱講師云南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆明黑龍?zhí)?50201學(xué)院：園林園藝學(xué)院專業(yè)：蠶學(xué)年級：2008級論文（設(shè)計）提交日期：2012年5月答辯日期：2012年6月答辯委員會主任：李文祥云南農(nóng)業(yè)大學(xué)2010年5月云南桑樹病菌初步鑒定及其對咪酰胺的敏感性測定陳文智（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院,昆明650201）摘要云南桑樹病害的發(fā)生逐年嚴(yán)重，嚴(yán)重阻礙了蠶桑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本文以8株從云南主要桑樹產(chǎn)區(qū)分離到的菌株為材料，采用菌落直徑法對咪酰胺EC50進(jìn)行測定。結(jié)果表明，咪酰胺對所分離的8個菌株中的三個菌株抑制率高：細(xì)極鏈格孢（3號）、甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（4號）和禾赤霉菌（5號）的EC50<0.1，桑牙枯菌（6號）的0.1＜EC50＜0.5，蔓枯病菌（7號）0.5＜EC50＜0.1，細(xì)極鏈格孢（8號）的1＜EC50＜2，桑干枯病（2號）和天竺葵鏈格孢(9號)的EC50＞17。說明咪酰胺對桑樹病菌的抑制作用顯著，可有效防治桑樹真菌病害。關(guān)鍵詞：咪酰胺；桑樹病害；EC50；敏感性；抑制率。TheIdentificationofMulberryFungusandTheSensitivityofProchlorazinYunnanChenwenzhi(Yunnanagricultureuniversitylandscapegardeningcollege)ABSTRACTMulberry(MorusalbaL.)wasalwaysinfectedbymanyfungus,whichhadembarrassedthesustainabledevelopmentofsericiculturalindustryseverely.Inthispaper,therewere8isolatesfromthemainmulberrygrowingareasinYunnanforprochlorazwastestedusingcolonydiametermeasurement.TheEC50werealsodetermined.Therewere3isolateswithhigherinhibitionrare.EC50forAlternariatenuissima(NO.3),Alternariabrassicae(NO.4)andGibberellazeae(NO.5)lowerthan0.1,whileFusariumcerealis(NO.6)from0.1to0.5,Didymellabryoniae(NO.7)from0.5to1,Alternariatenuissima(NO.8)from1to2，Phomopsissp(No.2)andAlternariaporri(No.9)higherthan17.Theresultsshowedthatprochlorazcouldinhibitmulberrydiseases.Keyword:microphonesamide;mulberrydisease;EC50;sensitivity;inhibitionrate云南桑樹病菌初步鑒定及其對咪酰胺的敏感性測定1前言1.1桑樹基本情況我國是世界上種桑養(yǎng)蠶最早的國家，也是中華民族對人類文明的偉大貢獻(xiàn)之一。桑樹的栽培已有七千多年的歷史。在商代，甲骨文中已出現(xiàn)桑、蠶、絲、帛等字形。到了周代，采桑養(yǎng)蠶已是常見農(nóng)活。春秋戰(zhàn)國時期，桑樹已成片栽植。我國收集保存的桑樹種質(zhì)分屬15個桑種3個變種，是世界上桑種最多的國家。其中栽培種有魯桑、白桑、廣東桑、瑞穗桑；野生桑種有長穗桑、長果桑、黑桑、華桑、細(xì)齒桑、蒙桑、山桑、川桑、唐鬼桑、滇桑、雞桑；變種有鬼桑(蒙桑的變種)、大葉桑(白桑的變種)、垂枝桑(白桑的變種)[1]。原產(chǎn)我國中部，有約四千年的栽培史，栽培范圍廣泛，東北自哈爾濱以南；西北從內(nèi)蒙古南部至新疆、青海、甘肅、陜西；南至廣東、廣西，東至臺灣；西至四川、云南；以長江中下游各地栽培最多。垂直分布大都在海拔1200m以下。1.2云南省桑樹主要病害桑樹的病害很多，按危害桑樹的部位可分為全株性病害、桑葉病害、枝干病害和根部病害。云南省危害較多有以下幾種。1.2.1桑萎縮病病原：由病毒引起。癥狀：萎縮病有花葉型、黃化型和萎縮型三種。桑樹發(fā)病，葉片縮小，葉色轉(zhuǎn)黃，病葉變成圓形或半圓形。枝葉叢生矮化、細(xì)小，側(cè)枝簇生成團(tuán)，病枝無花椹。黃化型葉緣向葉背卷曲；花葉型葉緣略向葉面卷縮；萎縮型皺縮，但葉不卷曲。葉肉部分斑塊狀褪綠，形成黃綠相間的花葉，葉脈有小瘤狀突起[2]。1.2.2桑白粉病病原：為球針殼屬的真菌。它利用附著器附著在葉子表皮上，部分組織能從氣孔進(jìn)入葉肉組織的細(xì)胞間隙，產(chǎn)生吸收器，攝取營養(yǎng)。癥狀：本病多發(fā)生于枝條中下部的葉片。病葉背面產(chǎn)生白粉狀圓形霉斑，后期病斑顏色由黃變黑，連成一片，最后出現(xiàn)小黑點(diǎn)。桑白粉病多發(fā)生在秋季濕潤的環(huán)境中，病菌發(fā)芽適應(yīng)的溫度為23℃，桑葉硬化早的品種更易發(fā)生。嚴(yán)重時布滿葉背面[3]。1.2.3桑褐斑病病原：病原菌屬黑盤孢科粘隔孢屬，初生于葉表皮下，形成分生孢子盤，分生孢子盤成熟后突破葉表皮。一般在未腐爛的病葉上越冬。癥狀：初期為褐色病斑，水漬狀，呈芝麻大小的斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大成近圓形或三角形。病斑周圍綠色減退變黃，同一病斑在正背面葉面均有，遇到陰濕連綿的天氣，吸收膨脹，有爛葉情況[4]。嚴(yán)重時，病斑相互連接，葉片枯黃易脫落。1.2.4桑赤銹病病原：為銹孢屬的真菌。往往在病組織皮下形成菌絲體團(tuán)塊，以后發(fā)育成球形的銹子器，隆起泡泡紗狀。由淡黃轉(zhuǎn)深，逐漸成熟，最后突破寄生表皮，露出皮面。癥狀：本病在溫度13-18℃，濕度80%以上易發(fā)生，高干桑較多，發(fā)病后桑葉局部變得臃腫，彎曲表現(xiàn)為畸形，葉面出現(xiàn)橙黃色的病斑，病斑上密布桔紅色的孢子，孢子隨風(fēng)雨傳播，引起再次侵染[1]。1.2.5桑干枯病病原：野村間座殼菌，球殼目，間座殼科，間座殼屬，其無性世代是擬莖點(diǎn)屬(Phomopsissp)。癥狀：3～5月桑樹發(fā)芽前后，距地面40～50cm以下枝于上出現(xiàn)橢圓形至不規(guī)則形淺黃色病斑，后成赤褐色，病斑擴(kuò)展環(huán)繞枝干一周后，病部以上枝條枯死。5～6月份病健組織交界處稍凹陷，橙黃色，上生鯊魚皮狀小疹，6、7月后小疹外皮破裂，露出黑點(diǎn)[2]。1.2.6桑紫紋羽病病原：為卷擔(dān)子綱的真菌，菌絲體寄生在細(xì)胞間或緊貼在根部細(xì)胞外面，靠滲透壓的不同，吸取養(yǎng)分，真菌適應(yīng)條件范圍廣，很易生長。癥狀：發(fā)病后根部失去光澤，根外包一層紫色的細(xì)絲狀菌絲，在靠近地面的根上有紫紅色的菌絲膜，嚴(yán)重時變成黑褐色而腐爛，僅剩下木質(zhì)部，病株很容易拔起。栓部不腐爛象管套一樣留在土中，地上部分生長緩慢，枝葉細(xì)小，葉色變黃，下部葉片脫落，枝梢停止生長，芽葉枯萎，最后整株枯死。苗圃發(fā)病嚴(yán)重時，短期內(nèi)成片死亡[5]。1.3咪酰胺防治作物病害的基本原理咪酰胺是一種廣譜性殺菌劑，其系抑制麥角甾醇生物合成，具有保護(hù)和鏟除作用，對多種作物子囊菌和半知菌病害有顯著防效?？捎糜诜乐魏坦阮愖魑锴o、葉、穗上的許多病害，如白粉病、葉斑病，葉面噴灑為0.3～1.0kg/hm。咪酰胺可用于果樹、蔬菜、蘑菇、草皮和觀賞植物的許多病原菌，可與多種殺菌劑、殺蟲劑、除草劑混配[6]。1.4咪酰胺對其他作物病害的防治情況20％咪酰胺·三環(huán)唑可濕性粉劑對水稻穗瘟病具有較好的防效，且對水稻生長安全，具有一定的增產(chǎn)作用[7]。以20％戊唑醇·井岡霉素·咪酰胺750g/hm2處理增產(chǎn)效果最顯著，達(dá)到9．1％，其增產(chǎn)作用主要通過增加稻谷結(jié)實率來實現(xiàn)[8]。防治器苗病的關(guān)鍵措施是搞好水稻種子藥劑處理，咪酰胺對早稻惡苗病具有很好的防治效果。溫度在10～l8℃，咪酰胺用量為60ml／hm，浸種72h，不淘洗直接播種，防效達(dá)98．8％[9]。咪酰胺不同用藥量處理對水稻出芽進(jìn)度和芽率都有一定的影響，咪酰胺浸種后淘洗與否，對種子出芽進(jìn)度影響較大而對總體芽率影響小[10]。咪酰胺不同用藥量對水稻最終成穗率、每穗實粒數(shù)、千粒重和水稻產(chǎn)量都有一定的影響。隨著用藥量的增加和浸種時間的加長，成穗數(shù)呈減少趨勢。綜合考慮咪酰胺不同用藥量的防病和增產(chǎn)效果，經(jīng)濟(jì)有效地使用咪酰胺以60ml／hm浸種72h，不淘洗處理增產(chǎn)效果最好，咪酰胺的用藥量過高反而導(dǎo)致水稻減產(chǎn)，降低經(jīng)濟(jì)效益[11]。目前云南省的桑樹病害的控制多用藥劑，但是沒有用到咪酰胺，而咪酰胺對其他作物的病害防治效果顯著，因此我做這方面的實驗，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)證明咪酰胺是否對桑樹病害有防治效果。1.5目的意義咪酰胺是目前新興的一種農(nóng)藥[6]，把其應(yīng)用在桑樹病害上，觀察其是否對桑樹病害有防治效果，以期為云南省桑樹病害的防治提供理論依據(jù)。1.6試驗流程5%NaClo處理植物保護(hù)學(xué)院何永紅老師提供編號為SHB的病原菌5%NaClo處理植物保護(hù)學(xué)院何永紅老師提供編號為SHB的病原菌病原菌分離病原菌活化曲靖、保山采集新鮮帶病桑葉病原菌純化單孢分離鑒定形態(tài)鑒定分子鑒定農(nóng)藥測定常溫培養(yǎng)3～5天常溫培養(yǎng)3～5天顯微鏡下 2材料與方法2.1實驗儀器培養(yǎng)皿、500ml錐形瓶、200ml錐形瓶、酒精燈、接種針、打孔器、電子天平、培養(yǎng)箱、顯微鏡、PCR儀、搖菌箱、烘菌箱、超凈工作臺。藥品：滅菌水、咪酰胺。2.2供試培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯220g；瓊脂粉22g；葡萄糖22g；蒸餾水定容至1L。2.3病樣保山、曲靖桑樹上采摘下病葉2.4病菌分離與培養(yǎng)2.4.1病菌分離病葉置于超凈工作臺分離。取病部和沒病部交界處組織，5%次氯酸鈉溶液消毒3分鐘，無菌水沖洗3次后置于PDA平板上，常溫暗培養(yǎng)三到五天。2.4.2病菌純化挑取單菌落置于PDA平板上，常溫暗培養(yǎng)五天。2.4.3單孢分離病菌純化后培養(yǎng)5-7天使其長出分生孢子；把顯微鏡置于超凈工作臺上，打開紫外燈滅菌30分鐘左右；把槍頭放在PDA平板的菌絲上掛一下，使其附著菌株的孢子；把帶有孢子的槍頭放到裝有蒸餾水的小試管中稀釋；取稀釋好的孢子溶液滴1滴到載玻片的水瓊脂上，把小液滴碾開放到顯微鏡載物臺上；調(diào)好焦距左右移動載玻片找到菌株的孢子；若在水瓊脂的小片區(qū)域內(nèi)只有一個孢子，小心切下水瓊脂放到PDA平板上培養(yǎng)。2.4.4病菌活化桑樹病原菌的活化，按照以下步驟進(jìn)行：培養(yǎng)皿準(zhǔn)備：將培養(yǎng)皿滅菌備用；培養(yǎng)皿平板制備：往熔化而冷至45℃左右的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中加入一定量的青霉素，充分搖動混勻后，倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，靜止冷卻；用無菌操作法將保存的桑樹病菌移至PDA平板上，放入25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5日，備用。2.5病菌鑒定2.5.1形態(tài)鑒定將待測菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件培養(yǎng)7天后觀察菌落性狀。菌落顏色參照Raynor的方法進(jìn)行劃分。菌株產(chǎn)孢后用無菌水將孢子洗脫并配制成孢子懸浮液，于顯微鏡下隨機(jī)挑選20個孢子測量孢子的長、寬、孢子和中間色孢的顏色、頂部附屬絲和基部附屬絲的多少及長度等指標(biāo)。然后參照《真菌志》進(jìn)行鑒定。2.6分子鑒定2.6.1搖菌搖菌按一下步驟進(jìn)行：做液體培養(yǎng)基，在200ml的錐形瓶中裝入1/3的液體培養(yǎng)基，放到高壓滅菌鍋中滅菌備用；把單胞分離培養(yǎng)后的菌株在超凈工作臺中接種到錐形瓶中；把錐形瓶放到搖菌箱中固定好，在常溫條件下，設(shè)置好搖菌箱進(jìn)行搖菌。5到7天后取出錐形瓶。2.6.2烘菌把搖好的菌株從錐形瓶中倒入培養(yǎng)皿取出接種時的固體培養(yǎng)基，把菌落中的水吸干，放到培養(yǎng)皿中在烘菌箱中把菌絲烘干，用濾紙包好備用。2.6.3制備DNA在液氮中把烘干的菌絲磨碎，把磨碎的菌絲放入小試管溶液中，放到離心機(jī)中離心。離心完以后提取含有DNA的上清液。把含有DNA的上清液放入小試管中并放到-4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?.6.4PCR測定把配置好的DNA上清液放到明膠上在電泳槽中跑膠，把跑好的膠放到PCR儀中觀察菌株的DNA含量。2.7農(nóng)藥測定2.7.1供試殺菌劑咪酰胺，濃度設(shè)置：10ug/ml,30ug/ml,50ug/ml,100ug/ml,150ug/ml2.7.2殺菌劑的配制配制5×103ug/ml母液：用電子天平各稱取0.05g的咪酰胺殺菌劑，然后各加入10ml的丙酮溶解，即配成的藥劑母液；配制103ug/ml母液：取上述母液1ml，加入4ml丙酮溶解，即配成103ug/ml的藥劑母液；配制咪酰胺不同濃度濃度的稀釋液：（終體積5ml,因需500mlPDA，溶劑中PDA含量≤1%）150ug/ml:取103ug/ml的溶液750ul,加入4250ml丙酮；100ug/ml:取103ug/ml的溶液500ul,加入4500ul丙酮；50ug/ml:取103ug/ml的溶液250ul,加入4750ul丙酮；30ug/ml取103ug/ml的溶液150ul,加入4850ul丙酮10ug/ml取103ug/ml的溶液50ul,加入4950ul丙酮。將（3）中各濃度溶液5ml加入到500mlPDA中，制得濃度分別為1.5ug/ml,1.0ug/ml,0.5ug/ml,0.3ug/ml,0.1ug/ml的PDA平板（3次重復(fù)的量）。對照PDA平板制備：取5ml丙酮加入到500mlPDA中(3次重復(fù)的量)。桑樹病菌接種：將培養(yǎng)5天后的桑樹病菌在無菌條件下用滅菌后的5mm打孔器在菌落邊緣切下菌餅，用接種針將菌餅接種于上述各含藥劑的和對照的培養(yǎng)皿中央，菌絲朝下。每皿接4個菌，每個菌重復(fù)三次。培養(yǎng)菌株：將所有培養(yǎng)皿放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天后，用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值。依據(jù)下式計算不同濃度藥劑對桑樹病菌的菌絲生長抑制率：抑制率（％）=對照菌落增長直徑（mm）－處理菌落增長直徑（mm）×100對照菌落增長直徑（mm）（菌落增長直徑=菌落直徑-菌餅直徑）根據(jù)“反應(yīng)率-幾率值”轉(zhuǎn)換表將抑制生長率轉(zhuǎn)換成抑制率幾率值。然后以殺菌劑濃度的對數(shù)值為橫軸，以抑制率幾率值為縱軸，做出LP-D線性方程式y(tǒng)=ax+b。由線性公式計算各種藥劑對桑樹病菌各菌株的EC50(抑制中濃度)及相關(guān)系數(shù)r。3結(jié)果與分析3.1桑樹病菌的鑒定3.1.1菌株分離2010年6月至10月間自云南曲靖、保山等桑樹種植區(qū)的葉子和枝條上采集病樣。所有菌株均采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行分離，于25℃黑暗條件下培養(yǎng)，待產(chǎn)孢后挑取單孢進(jìn)行純化。菌種在PDA斜面上于4℃冰箱中保存。1號菌株從保山地區(qū)桑葉上采集得到，病斑為黑褐色大斑點(diǎn)狀。2、3、4、5、6、7、8、9號菌株采樣地為曲靖，2、3、4、5號菌株從桑樹葉片上分離得到，2、4、5號菌株病斑形狀為斑點(diǎn)狀，3號菌株病斑形狀為條狀，病斑顏色都為黑褐色，6、7號菌株從桑樹枝條上分離得到，病斑都為黑褐色斑點(diǎn)狀，8、9號菌株從桑樹葉柄上分離得到，8號菌株病斑為條狀，9號菌株病斑為斑點(diǎn)狀，顏色都為黑褐色。表1桑樹病菌采集地點(diǎn)、分離部位和病癥Table1mulberrygermscollectingsite,separatepartsanddisease菌株編號名稱采集地點(diǎn)分離部位病斑形狀病斑顏色1保2-2保山葉片斑點(diǎn)狀黑褐色2曲4-1-1曲靖枝條斑點(diǎn)狀黑褐色3曲6-2-1曲靖葉片條狀黑褐色4曲5-1-1曲靖葉片斑點(diǎn)狀黑褐色5曲5-1-2曲靖葉片斑點(diǎn)狀黑褐色6曲2-2-2曲靖葉片斑點(diǎn)狀黑褐色7曲2-1-2曲靖枝條斑點(diǎn)狀黑褐色8曲5-2-1曲靖葉片條狀黑褐色9曲3-1-1曲靖葉片斑點(diǎn)狀黑褐色3.1.2形態(tài)鑒定結(jié)果菌落形態(tài)觀察結(jié)果表明（表2，圖1），在PDA平板上培養(yǎng)1號菌株菌落正面為粉紅色，菌絲絲狀，背面粉紅色，孢子堆黑色較少，生長過程中產(chǎn)生紅色色素。2號菌株菌落正面白色，絲狀菌絲，背面白色，孢子堆黑色較多。3號菌株菌落正面米黃色，有同心輪紋，絮狀菌絲，背面枯黃色有同心輪紋，孢子堆黑色較多，生長過程中產(chǎn)生黃色色素。4號菌株菌落正面米白色，有同心輪紋，菌絲絲狀，背面白色，孢子堆黑色較多。5號菌株菌落正面白色，菌絲絲狀，背面枯黃色，有同心輪紋，孢子堆黑色較少。6號菌株菌落正面白色，有同心輪紋，菌絲絲狀，背面黑黃相間沒有同心輪紋，孢子堆黑色較多。7號菌株菌落正面黑白相間，有同心輪紋，菌絲絮狀，背面黑黃相間，有同心輪紋，孢子堆黑色較多。8號菌株菌落黑白相間，有同心輪紋，絲狀，背面黑黃相間，孢子堆黑色較多。9號菌株菌落黑白相間，有同心輪紋，菌絲絲狀，背面黑黃相間，有同心輪紋，孢子堆黑色較多。表29種菌株在PDA平板上的形態(tài)特征Table2nineinthePDAplatingstrainsthemorphologicalcharacteristics編號名稱正面形態(tài)背面形態(tài)孢子堆1保2-2粉紅色絲狀粉紅色黑色較少2曲4-1-1白色絲狀白色黑色豐富3曲6-2-1米白色有輪紋絮狀桔黃色有輪紋黑色豐富4曲5-1-1米白色有輪紋絲狀白色黑色豐富5曲5-1-2白色絲狀桔黃色有輪紋黑色較少6曲2-2-2白色有輪紋絲狀黑黃相間有輪紋黑色豐富7曲2-1-2黑白相間有輪紋絮狀黑黃相間有輪紋黑色豐富8曲5-2-1黑白相間有輪紋絲狀黑黃相間黑色豐富9曲3-1-1黑白相間有輪紋絲狀黑黃相間有輪紋黑色豐富圖1菌株在PDA平板上的形態(tài)A、菌株在PDA平板上的正面形態(tài)B、菌株在PDA平板上的背面形態(tài)Figure1strainceonthePDAplatinginformA.StrainsonthePDAplatinginpositiveformB.StrainsonthebackofthePDAplatingform孢子形態(tài)觀察結(jié)果表明（表3，圖2），1號菌株孢子很小形狀為橢圓形，光滑，近無色，成堆時綠色，長在1.64um-2.30um之間，寬在0.84um-1.38um之間，初步鑒定為亞木霉（Trichodermakoningii）。2號菌株子囊殼扁球形生于分生孢子器的周圍，子囊孢子紡錘形或橢圓形，有1個隔膜，無性世代的分生孢子器扁球形，分生孢子紡錘形，長橢圓形或卵形，無色，9～14×2.5～4um，初步鑒定為桑幹枯病（Phomopsissp）。3、8、9號菌株桑樹病菌孢子形狀為棒狀，有尾和須。本體被隔膜隔開成4個黑褐色的細(xì)胞，本體長在11.83um-15.11um之間，須長在5.43um-9.84um之間，尾長在2.02um-4.93um之間，孢子寬在2.30um-3.63um之間，初步鑒定為擬盤多毛孢（Pestalotiopsis）。4號菌株分生孢子梗欖褐色，不常分枝，有隔膜0～7個，上部屈曲，有顯著孢子痕，14～48×6～13um；分生孢子單生或形成4個孢子的短鏈，長卵形或倒棍棒形，33～147×9～33um，有橫隔膜和縱隔膜，初步鑒定為甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternariabrassicae）。5號菌株子囊殼散生，壁深藍(lán)色或深紫色，子囊棍棒形，無側(cè)絲，子囊孢子梭形，無色，有3個隔膜，無性階段為禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum)，大型分生孢子聚集時呈淡紅色，鐮刀形或梭形，有性態(tài)為玉蜀黍赤霉(Gibberellazeae(Schw.)Petch.),屬于子囊菌亞門球殼菌目赤霉屬，多有3個隔膜，孢子長在9.55um-15.19um之間，寬在1.89um-2.69um之間，初步鑒定為禾赤霉菌（Gibberellazeae）。6號菌株子囊殼深藍(lán)色或深紫色，表面光滑，子囊棍棒形至圓筒形，子囊孢子長卵形、橢圓形或紡錘形，有隔膜3個，16～25×4.5～6um，無性世代為桑牙枯鐮孢霉（Fusariumlateritium），初步鑒定為桑牙枯?。‵usariumcerealis）[12]。7號菌株屬子囊菌亞門真菌。無性態(tài)瓜葉單隔孢菌（AscocbcucumisFautr．etRoum），屬半知菌亞門真菌。分生孢子器埋生在寄主表皮下，球形至扁球形，褐色，大小95～137.5微米；內(nèi)壁密生簡單的分生孢子梗，單孢無色，大小7.5～15.5×2.5～4微米，器孢子具兩型：一類是小型孢子，特豐富，橢圓形或卵形，單胞無色，大小5.3～10.5×2.8～5微米。另一類是大型孢子，橢圓形至長卵形，具1隔膜，個別2～3個隔膜，隔膜縊縮，大小7.5～17×2.5～5.5微米。該菌在PDA平板上菌落初白色，擴(kuò)展后呈圓形，除邊緣白色外，內(nèi)絲暗黑色，氣生菌絲稠密發(fā)達(dá)，白色至灰白色，初步鑒定為蔓枯病菌（Didymellabryoniae）[13]。表3桑樹病菌孢子形態(tài)Table3mulberrygermssporeform序號采樣地點(diǎn)孢子形狀孢子顏色孢子長（um）孢子寬（um）1保山孢子很小橢圓形近無色，成堆時綠色1.64～2.300.84～1.382曲靖紡錘形、長橢圓形或卵形無色長：9～142.5～43曲靖棒狀中間4色胞同色，有尾和須。黑褐色身體長：11.83～15.11須長：5.43～9.84尾長：2.02～4.932.30～3.634曲靖長卵形或倒棍棒形欖褐色孢子痕長：14～48孢子長：33～147孢子痕寬：6～13孢子寬：9～335曲靖鐮刀形或梭性無色9.55～15.191.89～2.696曲靖長卵形、橢圓形或紡錘形深藍(lán)色或深紫色16～254.5～6表3桑樹病菌孢子形態(tài)Table3mulberrygermssporeform7曲靖小型孢子橢圓形或卵形大型孢子橢圓形至長卵形無色小型孢子5.3～10.5大型孢子7.5～17小型孢子2.8～5大型孢子2.5～5.58曲靖棒狀中間4色胞同色，有尾和須。黑褐色身體長：11.83～15.11須長：5.43～9.84尾長：2.02～4.932.30～3.639曲靖棒狀中間4色胞同色，有尾和須。黑褐色身體長：11.83～15.11須長：5.43～9.84尾長：2.02～4.932.30～3.63圖2桑樹病菌孢子形態(tài)A、3號菌株孢子形態(tài)B、1號菌株孢子形態(tài)C、5號菌株孢子形態(tài)Figure2mulberrygermssporeformA.No3wassporeformB.No1wassporeformC.No5wassporeform3.1.3分子鑒定結(jié)果對上述9個菌株做ITS測序，其結(jié)果與GeneBank比對，結(jié)果顯示（表4），1號為亞木霉（Trichodermakoningii）在GeneBank上的編號為AF218790.1，相似度為99%。2號為桑幹枯菌（Phomopsissp）在GeneBank上的編號為AB302247.1，相似度為99%。3號為細(xì)極鏈格孢（Alternariatenuissima）在GeneBank上的編號為HM467832.1，相似度為99%。4號為甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternariabrassicae）在GeneBank上的編號為JF439449.1，相似度為99%。5號為禾赤霉菌（Gibberellazeae）在GeneBank上的編號為HQ671191.1，相似度為99%。6號為桑牙枯菌（Fusariumcerealis）在GeneBank上的編號為GU584950.1，相似度為99%。7號為蔓枯病菌（Didymellabryoniae）[14]在GeneBank上的編號為EU167573.1，相似度為99%。8號為細(xì)極鏈格孢（Alternariatenuissima）在GeneBank上的編號為JQ417902.1，相似度為100%。9號為天竺葵鏈格孢（Alternariaporri）在GeneBank上的編號為JF422727.1，相似度為99%。表4分離菌株在GeneBank比對結(jié)果Table4inseparatestrainsGeneBankthantheresults序號菌種AccessionMaxidentDescriptionGenebank比對結(jié)果1保2-2AF218790.199%Trichodermakoningii亞木霉2曲4-1-1AB302247.199%Phomopsissp桑干枯菌3曲6-2-1HM467832.199%Alternariatenuissima細(xì)極鏈格孢4曲5-1-1JF439449.199%Alternariabrassicae甘藍(lán)長尾交鏈孢霉5曲5-1-2HQ671191.199%Gibberellazeae禾赤霉菌6曲2-2-2GU584950.199%Fusariumcerealis桑牙枯菌7曲2-1-2EU167573.199%Didymellabryoniae蔓枯病菌8曲5-2-1JQ417902.1100%Alternariatenuissima細(xì)極鏈格孢9曲3-1-1JF422727.199%Alternariaporri天竺葵鏈格孢3.2云南桑樹病原菌對咪酰胺的敏感性3.2.1實驗結(jié)果表明（表5）咪酰胺對桑樹病菌的抑制率較強(qiáng)，咪酰胺濃度越高對桑樹病菌的抑制率越高。咪酰胺濃度為10ug/ml時抑制率最高的是3號為0.5566，最低的7號為-0.365。咪酰胺濃度為30ug/ml時抑制率最高的是3號為0.7211，最低的是8號為0.0588。咪酰胺濃度為50ug/ml時抑制率最高的是4號為0.7756，抑制率最低的是2號為0.2271。咪酰胺濃度為100ug/ml時抑制率最高的是4號為0.8424，最低的是3號為0.2961。咪酰胺濃度為150ug/ml時抑制率最高的是6號為0.881，最低的是9號為0.4471。表5桑樹病菌對咪酰胺的抑制率Table5mulberrygermstomicrophonesamideinhibitionrate序號菌株抑制率濃度10ug/ml濃度30ug/ml濃度50ug/ml濃度100ug/ml濃度150ug/ml1保2-20.50710.66140.70390.66930.6222曲4-1-10.30940.25880.22710.30350.50243曲6-2-10.55660.72110.70390.29610.80134曲5-1-10.52030.66440.77560.84240.85255曲5-1-20.4950.63830.71670.79670.80836曲2-2-20.50.55560.59520.73810.8817曲2-1-2-0.3650.19570.47830.44780.66098曲5-2-10.19650.05880.28590.44710.51419曲3-1-10.27650.25880.30240.30590.4471咪酰胺對桑樹病菌的抑制效果圖咪酰胺對桑樹病菌的抑制效果圖0.000000.200000.400000.600000.800001.00000147101316192225283134374043菌株抑制率圖3咪酰胺對桑樹病菌的抑制效果圖Figure3microphonesamidetotheinhibitionofmulberrygermsdepicted圖4桑樹病菌對不同濃度的咪酰胺的抑制率效果圖Figure4mulberrygermstodifferentconcentrationsmicrophonesamideinhibitioneffect圖5桑樹病菌對不同濃度的咪酰胺的抑制效果圖Figure5mulberrygermstodifferentconcentrationsmicrophonesamideinhibitioneffect3.2.2咪酰胺對桑樹病菌的抑制效果從表6可以看出，云南桑樹病菌對咪酰胺的EC50存在一定的差異，而且不同菌株對同濃度咪酰胺的敏感性差異較大。咪酰胺對桑樹病菌的EC50從0.012774ug/ml-17.815ug/ml。EC50＞17的菌株有兩株是桑干枯?。?號）和天竺葵鏈格孢（9號）咪酰胺對這兩個菌株不敏感。0.5＜EC50＜2有兩株是蔓枯病菌（7號）和細(xì)極鏈格孢（8號），咪酰胺對這兩株病菌不太敏感。0.1＜EC50＜0.5的菌株是桑牙枯?。?號）此菌株對桑樹葉斑病病菌較敏感。EC50＜0.1的菌株有3個分別是細(xì)極鏈格孢（3號）、甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（4號）和禾赤霉菌（5號）這4個菌株對咪酰胺的敏感性最強(qiáng)。證明咪酰胺能有效防治亞木霉、細(xì)極鏈格孢、甘藍(lán)長尾交鏈孢霉和禾赤霉菌所引起的桑樹病害。表6咪酰胺對桑樹病菌的EC50Table6microphonesamidetomulberrygermsEC50序號菌株EC50ug/ml1保2-20.0431672曲4-1-117.8153曲6-2-10.0127744曲5-1-10.0808465曲5-1-20.0990046曲2-2-20.1375857曲2-1-20.9441328曲5-2-11.6770019曲3-1-117.025048個菌株對咪酰胺的EC50分布有一個單峰，其中6號（桑牙枯病菌）、3號（細(xì)極鏈格孢）、4號霉（甘藍(lán)長尾交鏈孢）和5號（禾赤霉菌）這四個菌株的EC50<0.5，1.5＜EC50＜2的菌株是8號（細(xì)極鏈格孢）。2號（桑干枯?。┖?號（天竺葵鏈格孢）的EC50>2。即除了EC50＞2的這兩菌株外，其余6個菌株菌落對咪酰胺敏感。EC50分布圖EC50分布圖012345670-0.50.5-1.01.0-1.51.5-2>2EC50區(qū)域頻率圖6咪酰胺對桑樹病菌的EC50分布圖Figure6microphonesamidetomulberrygermsEC50ofmap4討論4.1桑樹病害的病原本文鑒定表明，云南省引起桑樹真菌病害的病原有：細(xì)極鏈格孢（Alternariatenuissima）、甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternariabrassicae）、禾赤霉菌（Gibberellazeae）、桑牙枯?。‵usariumcerealis）、蔓枯病菌（Didymellabryoniae）、天竺葵鏈格孢（Alternariaporri）。前人研究表明云南桑樹病害主要是侵染性病害，而引起桑樹侵染性病害的病原物主要是真菌，屬于子囊菌綱（Ascomycetes）、擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）和半知菌類（Fungiimperfecti）。菌絲體發(fā)達(dá)，有隔膜和分枝，菌絲體可構(gòu)成菌核、子座、子囊果等組織體。此外，本文還分離到一株亞木霉（Trichodermakoningii），亞木霉（Trichodermakoningii）是否對桑樹的其它病原有防治效果，需進(jìn)一步研究。4.2咪酰胺可以有效防止桑樹病害本文中，咪酰胺可以有效防治桑樹真菌病害，在供試的8個菌株中有三個菌株：細(xì)極鏈格孢（Alternariatenuissima）、甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternariabrassicae）和禾赤霉菌（Gibberellazeae）的EC50<0.1，表明咪酰胺對桑樹上的這些病菌抑制和殺菌作用很顯著。2007年仇鐵燁用咪酰胺防治水稻惡苗病的效果顯著，每hm2用咪酰胺60ml，對秧苗期和分蘗末期惡苗病防治效果達(dá)到90％左右，齊穗期防效達(dá)到98％以上[11]；2010年郭雙義、郭漠鎂、羅曉新等用20％咪酰胺防治水稻紋病在水稻破口前施用750kg/hm2效果最好，防效達(dá)76．1％，水稻產(chǎn)量為6552．08kg/hm2[8]；2010年楊昌法用60ml／hm2的咪酰胺防治早稻惡苗病防效達(dá)98．8％[10]；2011年張金花、韓潤亭、劉明一等用20％咪酰胺防治水稻稻瘟病取得了良好的成效[7]。前人研究結(jié)果表明，咪鮮胺是一種咪唑類殺菌劑，對大田作物、水果、蔬菜、皮革及觀賞植物上的多種病害具有治療和鏟除作用由于它具有選擇性高、殺菌譜廣、高效、安全等特點(diǎn)，而且咪鮮安屬低毒殺菌劑，未發(fā)現(xiàn)致畸、致突變和致癌作用[6]。對鳥低毒，對魚和水生物中等毒性，在不同類型土壤中的半衰期為3—5個月不等。在本文中咪鮮胺也可以有效防治桑樹病害，因此，以后對桑樹真菌病害的防治可以采用咪鮮胺。參考文獻(xiàn)[1]黃君霆.栽桑養(yǎng)蠶技術(shù)大全[M].中國農(nóng)業(yè)出版社,1995:3-10.[2]華德公,胡必利.蠶桑病蟲害防治,北京金盾出版社出版[M].2006:156-168.[3]柴建萍,余凌翔,謝道燕,等.桑褐斑病,桑里白粉病在云南省不同地域桑園的發(fā)生危害及防控要點(diǎn)[J].云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所,2011,(3):15-18.[4]朱運(yùn)華.春季桑樹的病蟲防治[J].蠶桑茶葉通訊,1999,(1).[5]鄭聲鏞.桑樹病蟲害防治學(xué)[J].中國農(nóng)業(yè)出版社出版,1990.[6]何紅東.新型殺菌劑咪酰胺的合成與應(yīng)用[J].杭州農(nóng)藥總廠,2000,(6).[7]張金花,韓潤亭,劉明一,等.20％咪酰胺·三環(huán)唑可濕性粉劑防治水稻稻瘟病效果研究[J].吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,2011,(5).[8]郭雙義,郭漠鎂,羅曉新,等.20％戊唑醇·井岡霉素·咪酰胺防治水稻紋枯病試驗研究[J].江兩省永修縣農(nóng)業(yè)局,2010,(24).[9]王三勝.多茵靈防治桑樹褐斑病的試驗調(diào)查[J].武鄉(xiāng)縣蠶桑開發(fā)服務(wù)中心,2009,122.[10]楊昌法.咪酰胺防治早稻惡苗病試驗研究[J].安徽省廬江縣萬山鎮(zhèn)農(nóng)技站,2010,(27).[11]仇鐵燁.咪酰胺和浸種靈防治水稻惡苗病的效果及應(yīng)用技術(shù)[J].通州市東社鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,2007,(13).[12]中國真菌志[M].科學(xué)出版社,1998.256-278[13]李英,張永兵,等.甜瓜蔓枯病菌子實體法分離及A型菌株產(chǎn)孢條件研究[J].果樹學(xué)報,2007,(1).[14]郭富民,劉少華,等.西瓜蔓枯病分子診斷技術(shù)研究[J].上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所上海市設(shè)施園藝重點(diǎn)實驗室,2006,(3).[15]錢大志,陳偉,廖安武.桑樹褐斑病的發(fā)生規(guī)律及綜合防治[J].四川西昌市繭絲調(diào)公司,2005,(1).[16]王忠陽.桑樹褐斑病的發(fā)生及其防治技木[J].浙江省東陽市農(nóng)技推廣中心,2002,(9).[17]解國文.桑樹褐斑病的防治[J].云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所,2008.致謝非常感謝杜飛老師，每個實驗細(xì)節(jié)和每個數(shù)據(jù)，都離不開您的細(xì)心指導(dǎo)。在我寫論文期間，老師對我的論文進(jìn)行了詳細(xì)的修改和指正，并給予我許多寶貴的建議。在此，我非常感謝她一直以來的精心指導(dǎo)。還要感謝實驗室所有師兄師姐的照顧和幫助。本篇論文已經(jīng)完成，還有許多的地方需要更全面的改進(jìn)，但總的來說，在撰寫的過程中，我真實地學(xué)到了許多東西，也積累了不少經(jīng)驗，更進(jìn)一步豐富了自己的知識。但由于個人能力不足，加之時間和精力有限，在許多內(nèi)容表述、論證上存在著不當(dāng)之處，與老師的期望還有差距，許多問題還有待進(jìn)行一步思考和探究，借此答辯機(jī)會，希望各位老師能夠提出寶貴的意見，指出我的錯誤和不足之處，我將虛心接受，從而進(jìn)一步深入學(xué)習(xí)，使該論文得到完善和提高。最后，再次對關(guān)心、幫助我的老師和同學(xué)表示衷心地感謝！內(nèi)容總結(jié)

（1）參考文獻(xiàn)

[1]黃君霆.栽桑養(yǎng)蠶技術(shù)大全[M].中國農(nóng)業(yè)出版社,1995:3-10.

[2]華德公,胡必利.蠶桑病蟲害防治,北京金盾出版社出版[M].2006:156-168.

[3]以保證藥品質(zhì)量為前提，以服務(wù)業(yè)務(wù)經(jīng)營需要為目標(biāo)"的原則，針對重點(diǎn)養(yǎng)護(hù)品種建立藥品重點(diǎn)養(yǎng)護(hù)品種建立藥品養(yǎng)護(hù)檔案。藥品養(yǎng)護(hù)檔案是在一定的經(jīng)營周期內(nèi)，對藥品儲存質(zhì)量的穩(wěn)定性進(jìn)行連續(xù)觀察與監(jiān)控，總結(jié)養(yǎng)護(hù)經(jīng)驗，改進(jìn)養(yǎng)護(hù)方法，積累技術(shù)資料的管理手段。其內(nèi)容包括藥品的基本質(zhì)量信息、觀察周期內(nèi)對藥品儲存質(zhì)量的追蹤記錄、有關(guān)問題的處理情況等。藥品養(yǎng)護(hù)檔案的品種應(yīng)根據(jù)業(yè)務(wù)經(jīng)營活動的變化，及時調(diào)整，一般應(yīng)按年度調(diào)整確定。

2、養(yǎng)護(hù)質(zhì)量信息

按照GSP規(guī)定，藥品養(yǎng)護(hù)人員應(yīng)定期匯總、分析和上報養(yǎng)護(hù)檢查、近效期或長時間儲存的藥品的質(zhì)量信息。以便質(zhì)量管理部門和業(yè)務(wù)部門及時、全面地掌握儲存藥品質(zhì)量信息，合理調(diào)節(jié)庫存藥品的數(shù)量，保證經(jīng)營藥品符合質(zhì)量要求，其報告內(nèi)容應(yīng)匯總該經(jīng)營周期內(nèi)經(jīng)營品種的結(jié)構(gòu)、數(shù)量、批次等項目，統(tǒng)計并分析儲存養(yǎng)護(hù)工程中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量問題的相關(guān)指標(biāo)，如質(zhì)量問題產(chǎn)生的原因、比率，進(jìn)而提出養(yǎng)護(hù)工作改進(jìn)的措施及目標(biāo)。

（四）、影響藥品質(zhì)量的因素

1、影響藥品質(zhì)量的內(nèi)在因素

a、易水解的藥品當(dāng)藥品的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有酯、酰胺、酰肼、醚、苷鍵時，易發(fā)生水解反應(yīng)。如青霉素的分子中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)，在酸性、中性或堿性溶液中易發(fā)生分解反應(yīng)和分子重排反應(yīng)，其分解產(chǎn)物與分子重排物均無抗菌作用。故青霉素只能制成粉末，嚴(yán)封于容器中貯藏。

b、易被氧化的藥品當(dāng)藥品的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有酚羥基、巰基、香胺、不飽和碳鍵、醇、醚、醛、吡唑酮、吩噻嗪等基團(tuán)時，易發(fā)生氧化反應(yīng)。如氯丙嗪屬于吩噻嗪類化合物，在日光、空氣、濕氣的作用下易變質(zhì)失效，故應(yīng)遮光，密封保存。

2、藥品的物理性質(zhì)與質(zhì)量的關(guān)系

a、揮發(fā)性系指液態(tài)藥品能變?yōu)闅鈶B(tài)擴(kuò)散到空氣中的性質(zhì)。具有揮發(fā)性的藥品如果包裝不嚴(yán)或貯存時的溫度過高，可造成揮發(fā)減量，如乙醇、薄荷等在常溫下即有強(qiáng)烈的揮發(fā)性，還可以引起燃燒和爆炸。

b、吸濕性系指藥品自外界空氣中不同程度地吸附水蒸氣的性質(zhì)。藥品的吸濕性并不限于水溶性藥品，某些高分子藥品和水不溶性藥品同樣可以吸濕,但當(dāng)含有少量的氯化鎂等雜質(zhì)時，則表現(xiàn)出顯著的吸濕性。

c、吸附性藥品能夠吸收空氣中的有害氣體或特殊臭氣的性質(zhì)被稱為藥品的吸附性。例如淀粉、藥用碳、滑石粉等因表面積大而具有顯著的吸附作用從而使本身具有被吸附氣體的氣味，亦稱"串味"。

d、凍結(jié)性以水或乙醇作溶劑的一些液體藥品遇冷可凝結(jié)成固體，這種固體會導(dǎo)致藥品的體積膨脹而引起容器破裂。

e、風(fēng)化性有些含結(jié)晶水的藥品在干燥空氣中易失去全部或部分結(jié)晶水，變成白色不透明的晶體或粉末，稱為"風(fēng)化"。風(fēng)化后的藥品的藥效雖然未變，但影響使用的準(zhǔn)確性,尤其是一些毒性較大的藥品可因此而超過劑量，造成醫(yī)療事故。

f、色、嗅、味藥品色、嗅、味是藥品重要的外觀性狀，也是藥品的物理性質(zhì)之一，當(dāng)色、嗅、味發(fā)生變化時，經(jīng)常意味著藥品性質(zhì)發(fā)生了變化，所以它們是保管人員實施感官檢查的重要根據(jù)。如維生素C片由白變黃，是由于發(fā)生了氧化反應(yīng)；阿司匹林片出現(xiàn)針狀結(jié)晶或濃厚的醋酸味，是由于因吸濕而發(fā)生水解反應(yīng)，產(chǎn)生了水楊酸和乙酸；某些藥品的異臭、異味