神秘果種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018神秘果種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標準規(guī)定了神秘果[Synsepalumdulcificum（Schumach.&Thonn.）Daniell]種子超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標準適用于神秘果種子的超低溫長期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程水分測定GB/T3543.7農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程其他項目檢驗術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。神秘果Synsepalumdulcificum（Schumach.&Thonn.）Daniell為山欖科（Sapotaceae）神秘果屬（Synsepalum）常綠灌木植物。果肉中含有稱為神秘果素（Miraculin）的糖蛋白，能催化蘋果酸、檸檬酸類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為果糖，改變?nèi)说奈队X，使酸的食物變甜。在加納、剛果等西非熱帶地區(qū)常用來調(diào)節(jié)食物味道。20世紀60年代，周恩來總理到西非訪問時，加納共和國把神秘果作為國禮送給周總理；此后，神秘果開始在我國栽培。神秘果是一種集趣味性、觀賞性和食用性于一體的珍貴植物。收載于《世界藥用植物速查辭典（2015）》。神秘果果實Synsepalumdulcificum（Schumach.&Thonn.）Daniellfruits果實為漿果，橢圓形，長1.5~2cm，果肉近果皮處有厚壁組織而成薄革質(zhì)至骨質(zhì)外皮。果皮成熟前綠色，成熟后鮮紅色，果肉較薄。神秘果種子Synsepalumdulcificum（Schumach.&Thonn.）Daniellseeds神秘果的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子種皮褐色，具1至數(shù)枚，通常具油質(zhì)胚乳或沒有，硬而光亮，富含單寧，有各種各樣的疤痕，子葉薄或厚，有時葉狀。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過前處理的神秘果種子置于液氮（-196℃）中保存。種子的選擇果實采收6月至7月以及11月至12月，當(dāng)果皮變?yōu)轷r紅色，果肉變軟后，即可采收，去除果皮和果肉，取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、結(jié)實、健康的種子，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r間不超過1個月）。種子前處理生活力檢測參照GB/T3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法檢測種子生活力。隨機抽取30粒種子，沿種脊小心將種子分成2瓣，放培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)側(cè)面向下，滴入TTC溶液浸沒種子，室溫（25℃）避光放置4h后觀察染色結(jié)果。生活力計算直接用肉眼對染色結(jié)果進行觀察鑒定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鮮紅色，且組織狀態(tài)正常的，為有活力的種子；否則為無生活力的種子。計算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的神秘果種子生活力應(yīng)≥90%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹神秘果種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為5000:1，室溫條件下干燥處理0~40h，在干燥過程中定期測定種子含水量，將種子含水量由35%~40%降至23%~35%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量神秘果種子保存量不少于240粒，以便后期的活力檢測使用。種子冷凍方式神秘果種子超低溫保存的冷凍方式為玻璃化冷凍法，即將裝有種子的15mL凍存管（每管12粒種子）置于裝載液（LS）中并于25℃處理種子25min，再用玻璃化保護溶液（PVS2）冰浴處理種子30min，換上預(yù)冷新鮮的PVS2后迅速投入液氮中進行超低溫保存。恢復(fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出2個凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍5min，而后用洗滌液（DS）浸泡15min，并用純凈水洗滌3次。凍后種子生活力檢測取出1管解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測方法，進行超低溫保存后的初始生活力檢測。當(dāng)種子生活力≥90%時視為保存成功。恢復(fù)培養(yǎng)將剩下1管解凍后的神秘果種子，播種到帶有無菌濾紙的帶蓋發(fā)芽盒中，溫度25℃~30℃，濕度70%~85%條件下培養(yǎng)，出芽周期大概30天。附錄[1]TTC的配制和保存方法精密稱取TTC1.00g，溶于100mL磷酸鹽緩沖液中，制成濃度為1%的TTC溶液，調(diào)pH至6.5~7.5，置棕色瓶內(nèi)4℃冰箱備用。磷酸緩沖液配置方法：溶液I：9.08g磷酸二氫鉀溶于1L無菌水中；溶液II：35.81g磷酸二氫鈉溶于1L無菌水中；I:II=2:3的比例混合制成磷酸鹽緩沖液）[2]裝載液（LS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖13.7g，稱量甘油11.9mL，溶于液體MS培養(yǎng)基中，調(diào)pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。[3]玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亞砜13.6mL，稱取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。注意：配置時需戴手套，并在通風(fēng)廚內(nèi)操作。[4]洗滌液（DS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖41.1g溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。參考文獻[1]肖培根，劉昌孝，江紀武等.世界藥用植物速查辭典[M].中國醫(yī)藥科技出版社.2015[2]中國科學(xué)院中國植物志委員會.中國植物志.[M].科學(xué)出版社，2004（1987），60（1）：047.[3]傅家瑞，宋松泉.頑拗性種子生物學(xué)[M].中國科學(xué)文化出版社，2004:1[4