花椒麻味素含量的常規(guī)檢測

花椒麻味素(酰胺類)含量的常規(guī)檢測李菲菲;李孟樓;崔俊;高錦明【摘要】花椒中的8種鏈狀不飽和脂肪酸酰胺是花椒特有的麻味成分，建立花椒麻味素(總酰胺)含量的快速測定方法對評定花椒及其產(chǎn)品質(zhì)量有實際意義.通過三水平四因素正交試驗，確定總酰胺浸膏的最佳超聲波輔助提取條件為50°C、花椒粉末樣品：95%乙醇=1:10、提取2.5h；經(jīng)過高效液相色譜法與甲醛快速滴定法檢測花椒總酰胺含量的比較研究，得出甲醛快速滴定法檢測結(jié)果的校正系數(shù)為2.2696(R2=0.9781).同時應(yīng)用甲醛快速滴定法檢測來自不同產(chǎn)地14種花椒中的總酰胺含量,結(jié)果表明高山區(qū)紅花椒的總酰胺含量〉竹葉花椒＞低山區(qū)紅花椒.【期刊名稱】《林業(yè)科學(xué)》【年(卷)，期】2014(050)002【總頁數(shù)】6頁(P121-126)【關(guān)鍵詞】花椒;麻味素;酰胺;超聲波輔助提取;甲醛滴定法【作者】李菲菲;李孟樓;崔俊;高錦明【作者單位】西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院楊凌712100;西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院楊凌712100;西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院楊凌712100;西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院楊凌712100【正文語種】中文【中圖分類】S713花椒屬(Zanthoxylum)植物全世界約250種，分布于亞洲、美洲、非洲及大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)(Porter，1976;郭靜，2008)。研究表明:花椒的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、生物堿、脂肪酸酰胺、木質(zhì)素、香豆素和脂肪酸等;以花椒素為代表的鏈狀不飽和脂肪酸酰胺是花椒特有的辛麻味成分，該類具有麻味的酰胺有8種，并統(tǒng)稱為麻味素(Kashiwadaetal.，1997;Bafi-Yeboaetal.，2005;Yang，。長期以來，花椒品質(zhì)的界定沒有一個統(tǒng)一、科學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)，其原因就在于未能找到一種快速、準(zhǔn)確的麻味素檢測方法。因此，研究花椒麻味素含量的快速檢測方法，并針對不同產(chǎn)地不同花椒品種麻味素含量特征建立數(shù)據(jù)庫，對建立花椒的質(zhì)量評價體系、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及品質(zhì)的地理區(qū)劃有著重要意義。花椒酰胺類物質(zhì)的測定和分析方法包括高效液相色譜分析、分光光度法、反相高效液相色譜法、GC-MC測定法、紅外光譜法、薄層層析法、色差儀技術(shù)、微生物法等(Bayeretal.，1976;Yudkoffetal.，1982;Salehetal.，1991;Stolcovaetal.，1995;Barth，2007;Bilyketal.，1991;Rose-Sallinetal.，2001)。但或因需要8種麻味酰胺的標(biāo)準(zhǔn)樣、或分析儀器昂貴、或提取與檢測操作繁瑣、或穩(wěn)定性與可靠性差等原因，而難以在花椒質(zhì)量的常規(guī)檢測中使用。為此，本文對紅花椒(Z.bungeanum)和竹葉花椒(Z.armatum)麻味成分即脂肪酸酰胺總量的常規(guī)檢測進行了研究。1材料與方法1.1測定原理花椒中含氮的成分有麻味素酰胺、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、生物堿等，在提取麻味素酰胺時為避免或減少同時提取出其他含氮成分，應(yīng)選用乙醇作為提取溶劑(Varneretal.，1953;Routetal.，2007;Vilkhuetal.，2008)。提取出浸膏后，用濃硫酸進行反應(yīng)可將酰胺態(tài)氮轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚴褂玫味ǚz測的銨態(tài)氮，而浸膏中其他含氮成分如氨基酸、蛋白質(zhì)中的氮則被濃硫酸分解為，不會對下一步測定花椒總酰胺含量產(chǎn)生影響。但由于酸性太弱(Ka=5.6x10-10)，不能用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定，而應(yīng)采用甲醛法進行測定(Bremner,1960;Campins-Falcoetal.,2008)。甲醛法常用于測定銨鹽的含氮量，而采用甲醛法滴定花椒總酰胺的原理在于，甲醛與弱酸性酰胺的NH4+(Ka=5.6x10-10)相作用，生成質(zhì)子化的六亞甲基四胺和H+，即4NH4++6HCHO=(CH2)6N4H++3H++6H20。在反應(yīng)中4molNH4+生成了4mol的銨鹽(CH2)6N4H+,而(CH2)6N4H+的Ka為7.1x10-10,酸性得到了強化，故(CH2)6N4H+可被NaOH準(zhǔn)確滴定°(CH2)6N4H+中的氮與NaOH的化學(xué)計量數(shù)比為1,即NaOH所滴定出的(CH2)6N4H+量與花椒中總酰胺的含量相等。由于所提取的樣品中可能含有游離酸和H+,在加入甲醛滴定之前應(yīng)先以甲基紅為指示劑，用NaOH將溶液中和至甲基紅變?yōu)辄S色(pH必6),然后在提取液中加入甲醛，以酚酞為指示劑后方可用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定?；ń仿槲端睾吭?.12%-0.87%，而酸堿分析方法的理論準(zhǔn)確度可達10-3-10-7(劉雄，2003；王克強等，1989;徐剛等，1992)?；ń贩勰┨崛〗嘀械幕ń仿槲段镔|(zhì)含量與花椒粉末樣相比較，濃縮率至少在10倍以上，因此，采用甲醛測定法的準(zhǔn)確度完全能夠滿足花椒麻味物質(zhì)含量檢測的需要。1.2樣品、主要試劑和儀器儀器CHJ-1磁力恒溫攪拌器，KQ-100數(shù)控超聲波清洗器(超聲頻率40kHz,功率100W，溫度范圍20~80°C),萬分之一電子天平，RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，PHS-3B酸度計，300mL/14*2球型冷凝器一套。LC-10A分析型高效液相色譜儀(日本島津公司)。試劑令鄰苯二甲酸氫鉀(KHC8H4O4，相對分子質(zhì)量204.23),1mol-L-1NaOH溶液，95%乙醇，18%甲醛溶液，50%濃H2SO4,準(zhǔn)確標(biāo)定0.0982mol-L-1的NaOH溶液，18%(1+1)除酸甲醛，酚酞指示劑，甲基紅指示劑，pH=5.0-7.0的顆粒狀活性炭，蒸餾水?；ń仿槲端?江津、蘭州、茂汶)及花椒樣品花椒麻味素由重慶四面山花椒公司提佻14個產(chǎn)地的花椒樣品:紅花椒分別來自山西芮城陽城鎮(zhèn)，陜西洛南城關(guān)、寶雞鳳縣、韓城，山東淄博博山、青島嶗山，甘肅積石山縣、隴南康縣，湖北恩施來鳳縣，云南昆明，西藏朗縣甲格;竹葉花椒產(chǎn)自云南永善、麗江永順洲，重慶江津。測定前于50~55°C下恒溫干燥4h，再定量取樣?；ń仿槲段镔|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(8種酰胺的混合物)由西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院提供。1.3花椒中總酰胺含量的測定總酰胺浸膏的提取筆者研究證實:花椒的粉碎顆粒越細碎，浸膏相對提取率越低;液料比越大，浸膏相對提取率越高(郭新榮等，2000)。預(yù)試驗表明，在30C下用95%乙醇浸泡花椒粉碎樣1.5h，浸膏提取率只要達到9%，其所含的花椒麻味物質(zhì)就可完全被提凈;提取率再高，只能增加提取浸膏中的雜質(zhì)含量。資料顯示，在30~80C溫度范圍內(nèi)，溫度越高、浸膏提取率也越高(仝其根等，2008)。盡管花椒浸膏提取率與提取時間、液料比和溫度的關(guān)系已散見于不同文獻，但過去的研究未能進行該4因素的綜合研究;因而參考預(yù)試驗及文獻中的研究結(jié)果，在保證完全提凈花椒麻味物質(zhì)的前提下，設(shè)置了3水平4因素正交試驗提取試驗，以確定最優(yōu)提取條件。具體步驟如下。粉碎待測花椒，18目篩網(wǎng)過篩。提取溶劑用95%乙醇，每處理稱取花椒粉末樣10.00g(T1)、放入500mL三角瓶中，按照液料比加入溶劑。設(shè)置9個處理的L9(34)正交設(shè)計，即提取時間A(1,2.5,4h),液料比B(1:5,1:10,1:15),提取溫度C(30,40,50C),以選擇最佳的超聲波輔助提取條件。提取物用布氏漏斗抽濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，稱量所得浸膏(T2,g)留用。試驗結(jié)果采用方差分析方法及SPASS統(tǒng)計軟件進行分析(Larsonetal.,2004)。酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)殇@態(tài)氮取上述浸膏3.00g(T3)，加入球型冷凝器的錐形瓶中后用15mL乙醇溶解，再加入20mL的50%濃H2SO4,120°C下用磁力攪拌器攪拌反應(yīng)25min。反應(yīng)完全后加2g顆粒狀活性炭，100°C下用球型冷凝器加熱回流脫色30min，趁熱過濾，濾液用蒸餾水定容至250mL（V1）留用。3）銨態(tài)氮含量測定采用甲醛法測定，但有改進（肖玲，2003；李榮志等，1999）。取上述濾液50mL（V2）放入250mL錐形瓶，加入2~3滴甲基紅指示劑，用1mol?L-1NaOH溶液滴定至呈現(xiàn)黃色（PHS-3B計酸度測定使pH%）,以除去濾液中的剩余酸;然后加入10mL的18%甲醛溶液、2~3滴酚酞指示劑后充分搖勻，靜置5min后用0.1mol-L-1NaOH滴定至橙紅色，并保持0.5min內(nèi)不褪色即為終點（PHS-3B酸度計測定使pH必9）,記錄所用0.1mol?L-1NaOH溶液體積（V3）。該測定重復(fù)3次。1.4驗證試驗分別對重慶四面山花椒公司提供的麻味素（產(chǎn)地為江津、蘭州、茂汶花椒），采用液相色譜和滴定法檢測其總酰胺含量，以驗證和校正滴定法檢測結(jié)果，得出甲醛滴定法的校正系數(shù)。1）液相色譜檢測以花椒麻味素標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣，采用高效液相色譜法檢測徐曉琴等，2009）。2）滴定法檢測稱取花椒麻味素（江津、蘭州、茂汶）約0.5g（T4）,加入45mL乙醇溶液，待溶解完全后，濾除不溶性雜質(zhì)。加入20mL的50%濃H2SO4，在120C下消化反應(yīng)25min，反應(yīng)完成后加入約1g活性炭，加熱回流脫色30min，濾紙過濾，定容至250mL（V1）o^25mL溶液（V'2）3份，各加入2~3滴甲基紅指示劑，其余方法與銨態(tài)氮含量測定方法相同。1.5不同產(chǎn)地的花椒的麻味物質(zhì)含量測定利用上述改進和校正后的甲醛滴定法，對來自不同地區(qū)的14種花椒的麻味成分含量進行測定。1.6花椒中酰胺類麻味物質(zhì)含量計算用滴定法測定時，每克花椒粉末樣品中總酰胺含量Q(mg?g-1)=a[QV3i/3)xCX14.0067xbxT2]/(T1xT3)；驗證試驗中，每克樣品中總酰胺含量Q'(mg-g-1)=a[VNaOH-ixCX14.0067xb']/T4。式中，V3i為銨態(tài)氮含量測定中消耗的NaOH溶液體積(mL),C為NaOH溶液的準(zhǔn)確標(biāo)定濃度，T1為花椒粉末樣質(zhì)量(g),T2為花椒粉末樣所得浸膏質(zhì)量(g),T3為酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)殇@態(tài)氮時的浸膏質(zhì)量(g),T4為驗證試驗中花椒麻味素質(zhì)量(g),VNaOH-i為驗證試驗中消耗的NaOH溶液體積(mL),14.0067為N的分子量，a為系統(tǒng)誤差矯正系數(shù)，b=V1/V2,b'=V1/V2',i為重復(fù)數(shù)。2結(jié)果與分析2.1花椒總酰胺超聲波輔助提取條件花椒總酰胺超聲波輔助提取的L9(34)正交試驗結(jié)果如表1所示。方差分析表明，A因素的顯著值P=0.318,B因素的顯著值P=0.341,C因素的顯著值P=0.046,即時間和料液比對花椒總酰胺的提取效果無顯著影響，溫度對提取效果影響顯著。因此，據(jù)表1的直觀分析，A因素應(yīng)選水平2,B因素應(yīng)選水平2,C因素應(yīng)選水平3，最佳提取條件為A2B2C3，即超聲波輔助提取花椒酰胺的最佳條件為:50°C,料液比為1:10,提取2.5h。表1花椒總酰胺超聲波輔助提取條件試驗方案及結(jié)果Tab.1Thetestschemeandresultsofultrasonic-assistedextractionconditionsoftotalacylamidesinpricklyash編號No.A時間ATime/hB料液比BRatioofsolidtoliquid/(g-mL-1)C溫度CTemperature/CD空白DBlank浸膏質(zhì)量Weightofconcrete/g提取率Extractionrate(%)1234567891(1.0)1(1.0)1(1.0)2(2.5)2(2.5)2(2.5)3(4.0)3(4.0)3(4.0)1(1:5)2(1:10)3(1:15)1(1:5)2(1:10)3(1:15)1(1:5)2(1:10)3(1:15)1(30)2(40)3(50)2(40)3(50)1(30)3(50)1(30)2(40)1233122313.05483.48334.78283.48255.35043.31813.99293.13993.453930.5534.8347.8334.8353.5033.1839.9331.4034.54，K1，K2，K311.320912.151010.586710.530211.973611.55489.512810.419714.126111.859110.794311.405234.0586平均值k1Averagek2valuek33.77364.05033.52893.51013.99123.85163.17093.47324.7087極差R0.52140.48111.5378P0.3180.3410.046*2.2驗證試驗結(jié)果滴定法與用液相色譜測定的花椒麻味素中的總酰胺含量如表2所示。由圖1可知，滴定法測定值W'與液相色譜測定值q之間存在系統(tǒng)誤差，其線型關(guān)系符合q=2.2696W'(R2=0.9781),即采用滴定法檢測花椒總酰胺含量時，應(yīng)使用校正系數(shù)2.2696對其測定值進應(yīng)校正。對表2中滴定法測定值進行校正后與液相色譜測定值采用t檢驗表明，t=0.018vt(0.05,16)=2.120，即液相色譜與滴定法校正測定值間無差異。圖1高效液相色譜測定值q與甲醛滴定法測定值W'擬合曲線Fig.1ThefittingcurveofHPLCdetectionvalueqandformaldehydetitrationdeterminationvalueW'表2甲醛滴定法與高效液相色譜測定結(jié)果比較Tab.2ComparisonofthetestresultsbetweenformaldehydetitrationmethodandHPLC花椒麻味素含量Numbingcomponentcontentinpricklyash/g消耗體積Consumptionvolume(0.1mol-L-1NaOH)/mL-1滴定法測定值W'FormaldehydetitrationdetectionvalueW'/(mg-g-1)高效液相色譜測定值qHPLCdetectionvalueq/(mg-g-1)滴定法校正值Q'AdjustedvalueoftitrationQ'/(mg-g-1)0.5054(江津Jiangjin)0.5115(茂汶Maowen)0.5099(蘭州Lanzhou)20.840.860.850.700.690.7031.297531.841830.481122.588223.126050.000050.000044.000045.000045.000071.032872.268169.179951.266252.486851.876542.855742.243642.85582.3不同產(chǎn)地花椒中的總酰胺含量據(jù)驗證試驗結(jié)果，滴定法測定時每克花椒粉末樣品中總酰胺含量Q(mg-g-1)=[(^V3i/3)xCx14.0067x2.2696xT2]/(T1xT3)o據(jù)此，來自全國各地14個花椒樣品的酰胺含量測定結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，不同花椒產(chǎn)區(qū)的花椒總酰胺的含量有較大差異，表現(xiàn)為高山區(qū)紅花椒(陜西韓城、山東青島嶗山、甘肅隴南康縣、陜西洛南、西藏朗縣)較高于低山區(qū)(山西芮城、云南昆明、寶雞鳳縣、湖北恩施來鳳縣、山東淄博博山)及竹葉花椒，竹葉花椒的總酰胺含量也以栽培區(qū)地勢較高的為高。3討論自花椒粉末樣中提凈含有麻味物質(zhì)的總酰胺浸膏，是精確檢測花椒中麻味物質(zhì)含量的前提。花椒總酰胺浸膏的提取有常規(guī)溶劑、微波、超臨界CO2等技術(shù)，但其提取率多在7.3%~24.2%(Routetal.,2007淳院斤榮等，2000;Wangetal.,；而采用50°C、料液比為1:10、提取2.5h超聲波輔助提取時，提取率達53.50%，為保障花椒麻味物質(zhì)含量檢測的可靠性提供了基礎(chǔ)?；ń返穆槲段镔|(zhì)為其所含的8種酰胺，目前在花椒麻味物質(zhì)總含量的測定主要采用高效液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用和分光光度法(Bayeretal.,1976;Yudkoffetal.,1982;Salehetal.,1991;Stolcovaetal.,1995;Barth,2007;Bilyketal.,1991;Rose-Sallinetal.,2001)，但均需要提取和分離技術(shù)較復(fù)雜的8種酰胺作標(biāo)準(zhǔn)品，因此該3種方法難以在花椒及其產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗中廣泛使用。本研究比較了甲醛法與液相色譜法測定花椒總酰胺含量的差異，結(jié)果表明甲醛法與液相色譜法間的系統(tǒng)誤差系數(shù)僅為2.2696，其原因可能在于:采用液相色譜法測定時對樣品質(zhì)量要求相對嚴(yán)格，在制樣過程中致使總酰胺損失較大;而甲醛法直接用總酰胺浸膏進行測定，測定過程幾乎完全是化學(xué)反應(yīng)過程，在花椒總酰胺轉(zhuǎn)化為最終測定物質(zhì)即銨鹽(CH2)6N4H+時損耗量很小。用甲醛法對來自全國14個花椒樣品的總酰胺含量測定說明，高山區(qū)紅花椒〉竹葉花椒＞低山區(qū)紅花椒。表3中國不同產(chǎn)地花椒中的總酰胺含量Tab.3ThecontentsoftotalacylamidesinpricklyashfromdifferentareasinChina產(chǎn)地Producingarea花椒粉末樣Pricklyashpowdersample/g總浸膏Totalextract/g測定浸膏Testingextract/g消耗體積Consumptionvolume(0.1mol-L-1NaOH)V3i/mL酰胺含量QAcylamidescontentsQ/(mg-g-1)紅花椒Z.bungeanum山西芮城陽城鎮(zhèn)YangchengTown,Ruicheng,Shanxi云南昆明Kunming,Yunnan陜西寶雞鳳縣FengxianCounty,Baoji,Shaanxi湖北恩施來鳳縣LaifengCounty,Enshi,Hubei山東淄博博山區(qū)BoshanDistrict,Zibo,Shandong甘肅積石山縣JishishanCounty,Gansu陜西韓城Hancheng,Shaanxi山東嶗山Laoshan,Shandong甘肅康縣KangxianCounty,Gansu陜西洛南城關(guān)Luonan-Chengguan,Shaanxi西藏朗縣甲格Jiage,Langxian,Tibet20.0020.00100.0020.0030.0050.0050.0020.0020.0030.0030.006.356.8026.306.0511.5015.3013.258.906.5010.0010.003.003.003.003.003.003.003.003.003.003.003.003.09±0.282.89±0.144.09±0.633.56±0.192.81±0.304.34±0.664.80±0.303.53±0.096.47±0.146.50±0.096.62±0.075.1044±0.46255.1124±0.24775.5966±0.86215.6030±0.29905.6044±0.59836.9097±1.05088.1165±0.50738.1730±0.208410.9404±0.236711.2729±0.156111.4811±0.1214竹葉花椒Z.armatum云南永善Yongshan,Yunnan重慶江津Jiangjin,Chongqing云南麗江永順洲Yongshunzhou,Lijiang,Yunnan30.0030.0050.0010.5011.0014.553.003.003.003.85±0.144.15±0.046.39±0.257.0109±0.25497.9171±0.07639.6747±0.3785花椒是我國傳統(tǒng)的烹飪和食品調(diào)味料，隨著中華餐飲文化逐漸被世界各國所認可，花椒調(diào)味料出口量的增加，為控制花椒及其產(chǎn)品質(zhì)量、明確花椒調(diào)味料在餐飲品中的確切用量，建立花椒調(diào)味主成分的檢測與檢驗方法已是需要解決的一個現(xiàn)實問題。在我國已建立的與花椒相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)中，僅規(guī)定了含水量和揮發(fā)油含量等理化指標(biāo)及測定方法，并無麻味物質(zhì)含量指標(biāo)及測定方法，其原因就在于未能確立切實可行的花椒麻味物質(zhì)含量的檢測與檢驗技術(shù)(LY/T1652—2005)。因此，本研究建立的花椒麻味物質(zhì)(酰胺類)總含量的快速檢測技術(shù)，即甲醛滴定法，與目前國內(nèi)外的花椒麻味物質(zhì)測定方法相比較，本方法所使用的設(shè)備易得、檢測成本較低廉，操作簡單、快捷，且能夠準(zhǔn)確檢測出花椒所含的總酰胺含量。與LY/T1652—2005氣相和液相色譜檢測技術(shù)相比較，盡管甲醛滴定法在花椒麻味物質(zhì)檢測中可能還存在靈敏度不高等問題，但在目前情況下本研究結(jié)果將能夠為花椒麻味物質(zhì)含量的快速檢測與檢驗提供較為科學(xué)的依據(jù)。參考文獻郭靜.2008.花椒麻味物質(zhì)的分析測定方法和功能作用研究.中國調(diào)味品，33(5):73-76.郭新榮，李孟樓，逢煥明，等.2000.花椒果皮提取超濃縮調(diào)味劑的試驗研究.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，(9):13-14.李榮志，李江南，劉金輝，等.1999.甲醛法測定化肥中氨態(tài)氮的研究.遼寧大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，26(1):69-73.劉雄.2003.花椒風(fēng)味物質(zhì)的提取與分離技術(shù)研究.重慶:西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文.仝其根，閆聃，周敏.2008.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