生物催化劑課件

第二章生物催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)與篩選第三節(jié)國內(nèi)外酶制劑的工業(yè)概況第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產(chǎn)

第二章生物催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性1第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性一、基本概念定義：是生物反應(yīng)過程中起催化作用的游離細(xì)胞、游離酶、固定化細(xì)胞或固定化酶的總稱。（一）分類：1、按結(jié)構(gòu)形態(tài)：細(xì)胞、酶、多細(xì)胞生物體2、按形式：游離型催化劑、固定化型催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性一、基本概念2（二）分離純化酶和微生物整細(xì)胞體系的優(yōu)缺點(diǎn)生物催化劑存在形式優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)分離純化酶任意形式設(shè)備簡(jiǎn)單；產(chǎn)物易分離；由于能忍受較高濃度，產(chǎn)率較高需要進(jìn)行輔助因子再循環(huán)溶于水酶活性高可能發(fā)生副反應(yīng)；親油底物不溶；產(chǎn)物分離時(shí)需要萃取懸浮于有機(jī)溶劑容易操作；產(chǎn)物易分離；親油底物可溶；酶的回收容易酶活性降低固定化酶的回收容易固定化過程中損失酶活性微生物細(xì)胞任意形式不需要輔助因子再循環(huán)設(shè)備昂貴；產(chǎn)物分離過程冗長；產(chǎn)率低；對(duì)有機(jī)溶劑忍受力差；可能有副反應(yīng)生長培養(yǎng)活性高生物量大；副產(chǎn)物多；操作控制困難休止細(xì)胞產(chǎn)物分離較容易；副產(chǎn)物較少活性較低固定化細(xì)胞細(xì)胞可再利用活性較低（二）分離純化酶和微生物整細(xì)胞體系的優(yōu)缺點(diǎn)生物催化劑存在形式3酶催化劑（酶反應(yīng)過程）活細(xì)胞催化劑（發(fā)酵過程）用途單酶系統(tǒng)時(shí)，用于單一反應(yīng)；多酶系統(tǒng)時(shí)，可用于若干串聯(lián)反應(yīng)系列的串聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)物可以是簡(jiǎn)單以及復(fù)雜的代謝產(chǎn)物來源和價(jià)格從細(xì)胞中提取，技術(shù)較為困難，除若干商品酶制劑外，價(jià)格昂貴發(fā)酵開始時(shí)，接入少量種子液，價(jià)格低廉穩(wěn)定性較差，只有高穩(wěn)定性的或經(jīng)穩(wěn)定性修飾的，才能工業(yè)應(yīng)用略高，但須不斷保持其穩(wěn)定性輔酶再生在需要進(jìn)行輔酶再生的反應(yīng)中，技術(shù)和經(jīng)濟(jì)問題難以解決在新陳代謝過程中自行解決原料要求簡(jiǎn)單，但要求較高純度的化合物作底物可用粗原料，但要考慮菌體生長和產(chǎn)物形成的必要成分作培養(yǎng)基反應(yīng)時(shí)間短，數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)長，一天左右至一周以上反應(yīng)器體積較小，但較復(fù)雜，體積較大，但較簡(jiǎn)單過程控制簡(jiǎn)單復(fù)雜，過程常分菌體生長和產(chǎn)物形成兩個(gè)階段；物料成分性質(zhì)復(fù)雜，反應(yīng)途徑易于失控。產(chǎn)品分離簡(jiǎn)單復(fù)雜，反應(yīng)終了時(shí)產(chǎn)物含量低，副產(chǎn)物較多，且含有菌體工業(yè)應(yīng)用較少，目前用于工業(yè)生產(chǎn)的不超過10種較多，常見的有數(shù)十種酶催化劑（酶反應(yīng)過程）活細(xì)胞催化劑（發(fā)酵過程）用途單酶系統(tǒng)時(shí)4二、生物催化劑的來源與多樣性生物催化劑來源的多樣性體現(xiàn)在微生物的多樣性。土壤、水域、動(dòng)植物、極端環(huán)境、特殊環(huán)境二、生物催化劑的來源與多樣性生物催化劑來源的多樣性體現(xiàn)在微生5第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)和篩選對(duì)于一個(gè)特定的生物轉(zhuǎn)化過程，生物催化劑的篩選和制備是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，因?yàn)槠浠钚?、選擇性和穩(wěn)定性的高低將直接影響生物催化過程的效率，也是關(guān)系將來能否實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。要獲得一個(gè)具有潛在工業(yè)化應(yīng)用前景的優(yōu)良生物催化劑，往往要經(jīng)過微生物菌種的自然分離、誘變育種或定向改造，酶的發(fā)酵、提取和純化，以及酶或細(xì)胞的固定化等一系列環(huán)節(jié)。有時(shí)還要采用基因克隆、蛋白質(zhì)工程和定向進(jìn)化等分子生物學(xué)方法進(jìn)一步提高菌種的產(chǎn)酶水平或者改變酶的催化性能。

第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)和篩選對(duì)于一個(gè)特定的生物轉(zhuǎn)化過程，生6第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)和篩選一方面，我們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)新的酶促反應(yīng)過程時(shí)，必須找到一個(gè)適合這個(gè)反應(yīng)的酶，另一方面，新酶的發(fā)現(xiàn)也為設(shè)計(jì)新的酶促過程提供新的思路。發(fā)現(xiàn)新酶最有效和成功的方法之一，就是從微生物生活的自然界篩選獲得一定數(shù)量的微生物菌種。第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)和篩選一方面，我們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)新的酶促7微生物酶篩選的策略常規(guī)生物催化劑發(fā)現(xiàn)的一般過程：（一）設(shè)計(jì)反應(yīng)過程（二）選擇合適的酶或產(chǎn)酶微生物（三）建立有效且方便的分析方法。微生物酶篩選的策略常規(guī)生物催化劑發(fā)現(xiàn)的一般過程：8（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)在設(shè)計(jì)目標(biāo)化合物合成的酶促反應(yīng)過程中，選擇合適的反應(yīng)底物、合適的反應(yīng)途徑以及目標(biāo)化合物的性質(zhì)都非常重要。（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)9（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)

酰胺烷基化D-脫酰胺酶D-海因酶自發(fā)消旋化

5-單取代海因

（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)

酰胺烷基化D-脫酰胺酶10（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)

產(chǎn)生多種副產(chǎn)物Rhodococcusrhodochrous（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)

產(chǎn)生多種副產(chǎn)物Rhod11微生物酶篩選的策略（二）選擇合適的酶或產(chǎn)酶微生物1、途徑和方法（1）從國內(nèi)外市售的商品酶和菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的相關(guān)微生物中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)催化劑；（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催化劑；（3）從已有的酶中發(fā)現(xiàn)新的非天然催化活力；（4）利用新的反應(yīng)條件、改變反應(yīng)介質(zhì)或?qū)ふ倚碌挠绊懸蜃?；?）采用基因工程、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)獲取新的催化劑。微生物酶篩選的策略（二）選擇合適的酶或產(chǎn)酶微生物12（二）酶或產(chǎn)酶微生物的篩選一般產(chǎn)酶微生物篩選的原則1、能夠通過發(fā)酵在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)高產(chǎn)目標(biāo)酶2、微生物應(yīng)該盡可能地利用便宜和方便的原料生產(chǎn)酶3、微生物所產(chǎn)生的酶最好有比較高的專一性4、所采用的微生物應(yīng)該是不產(chǎn)生有害物質(zhì)的非致病性的安全微生物5、微生物的遺傳穩(wěn)定性應(yīng)該比較高（二）酶或產(chǎn)酶微生物的篩選一般產(chǎn)酶微生物篩選的原則131、途徑和方法（1）從國內(nèi)外市售的商品酶和菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的相關(guān)微生物中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)催化劑；只能提供少數(shù)幾個(gè)有限的催化劑來源

世界主要酶制劑公司公司名國家公司名國家Amano日本NovoNordisk丹麥Genecor美國Sigma美國1、途徑和方法（1）從國內(nèi)外市售的商品酶和菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的14丹麥novonordisk諾和諾德：世界著名生物制藥和生化制品集團(tuán)公司，成立于1923年，憑借自身的研發(fā)實(shí)力成為世界糖尿病治療領(lǐng)域先導(dǎo)，在行業(yè)內(nèi)擁有為廣泛的糖尿病治療產(chǎn)品，生產(chǎn)的胰島素和酶制劑分別占世界市場(chǎng)份額的50%和40%以上。

丹麥novonordisk諾和諾德：世界著名生物制藥和15我國主要菌種保藏單位及其隸屬機(jī)構(gòu)保藏單位（縮寫）保藏單位名稱隸屬機(jī)構(gòu)ACCC(AgriculturalCultureCollectionofChina)

中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所CFCC(ChinaForestryCultureCollectionCenter)中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國林業(yè)科學(xué)院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所CGMCC

中國普通微生物菌種保藏管理中心中國科學(xué)院微生物研究所CICC(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國食品發(fā)酵工業(yè)研究所CMCC中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心中國藥品生物制品檢定所、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院南京皮膚病研究所、中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所CPCC中國藥用微生物菌種保藏管理中心中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所、四川抗生素工業(yè)研究所、華北制藥廠抗生素研究所CVCC中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心中國獸藥監(jiān)察所我國主要菌種保藏單位及其隸屬機(jī)構(gòu)保藏單位（縮寫）保藏單位名稱16著名的國際菌種保藏機(jī)構(gòu)菌種保藏機(jī)構(gòu)網(wǎng)站美國典型菌種保藏中心：ATCC(AmericanTypeCultureCollection）德國微生物和細(xì)胞收藏中心DSMhttp://www.dsmz.de/dsmzhome.htmNRRL(ARS)美國農(nóng)業(yè)服務(wù)菌種中心CBS荷蘭菌種收藏中心著名的國際菌種保藏機(jī)構(gòu)菌種保藏機(jī)構(gòu)網(wǎng)站美國典型菌種保藏中心：17（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催化劑；（3）從已有的酶中發(fā)現(xiàn)新的非天然催化活力；（4）利用新的反應(yīng)條件、改變反應(yīng)介質(zhì)或?qū)ふ倚碌挠绊懸蜃?；?）采用基因工程、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)獲取新的催化劑。（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催18（三）建立有效和方便的篩選分析方法高溫是篩選嗜熱酶嗜熱菌的有效方法；目標(biāo)底物是最好的篩選因素；（三）建立有效和方便的篩選分析方法高溫是篩選嗜熱酶嗜熱菌的有19第三節(jié)：國內(nèi)外酶制劑工業(yè)概況一．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀二．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用差異三．我國酶制劑工業(yè)的若干對(duì)策建議第三節(jié)：國內(nèi)外酶制劑工業(yè)概況一．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀20一．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀1世界三大酶制劑公司NovoNordisk（丹麥）GenencorInternational(美國）Cuitor(芬蘭）三大公司銷售額占世界總額的70%一．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀1世界三大酶制劑公司212、國際市場(chǎng)酶制劑銷售額比例

2001年工業(yè)酶制劑的世界市場(chǎng)約為15億美元用于制藥工業(yè)與精細(xì)化學(xué)工業(yè)約1.2億~1.5億美元2、國際市場(chǎng)酶制劑銷售額比例223、我國酶工業(yè)發(fā)展階段11965無錫酶制劑廠淀粉酶21979糖化酶3堿性蛋白酶4中性蛋白酶51993耐高溫淀粉酶61998國外大公司紛紛入駐1999年投產(chǎn)3、我國酶工業(yè)發(fā)展階段11965無錫酶制劑廠淀粉酶23國內(nèi)酶制劑銷售額比例國內(nèi)酶制劑銷售額比例24二．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用差異1．規(guī)模：國外多公司重組國內(nèi)重復(fù)建設(shè)、效益低2投入：國外：開發(fā)經(jīng)費(fèi)高達(dá)15%，甚至19%銷售額國內(nèi)：研究、開發(fā)投入不足，占1%銷售額3開發(fā)重點(diǎn)國外：大力研制、開發(fā)新酶種和新用途國內(nèi)：品種少、劑型少二．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用差異1．規(guī)模：國外多公司重組25三、工業(yè)用生物催化劑的要求減少不必要的副反應(yīng)，有利于選擇性生物催化反應(yīng)的專一性；穩(wěn)定性好，包括操作穩(wěn)定性與貯存穩(wěn)定型批次之間的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好能夠反復(fù)實(shí)驗(yàn)。三、工業(yè)用生物催化劑的要求減少不必要的副反應(yīng)，有利于選擇性生26四、商品酶的劑型液體酶制劑固體粗酶制劑純酶制劑固定化酶制劑四、商品酶的劑型液體酶制劑27第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產(chǎn)一、微生物產(chǎn)酶菌種二、產(chǎn)酶培養(yǎng)基三、種子培養(yǎng)與發(fā)酵產(chǎn)酶四、微生物生長與發(fā)酵產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)五、發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶的影響第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產(chǎn)一、微生物產(chǎn)酶菌種28一.常用的產(chǎn)酶微生物Escherichia

coli

PseudomonasBacillussubtilis

StreptomycesAspergillusnigerAspergillusoryzaePenicilliumTrichodermaRhizopusMucorSaccharomycescerevisiaeCandida第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產(chǎn)一.常用的產(chǎn)酶微生物Escherichiacoli29Escherichiacoli：谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、半乳糖苷酶Bacillussubtilis：α-淀粉酶、中性蛋白酶Escherichiacoli：谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、30二、產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種選育1.自然育種：未經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過程稱為自然選育。

2.誘變育種：利用誘變劑處理微生物細(xì)胞，提高基因突變頻率，再通過適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。

(1)使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型——選育組成型突變株

培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)酶抑制劑，使組成型菌株被富集。

β-半乳糖苷酶的抑制劑鄰硝基-β-D-巖藻糖苷交替培養(yǎng)法：乳糖培養(yǎng)基葡萄糖培養(yǎng)基乳糖培養(yǎng)基顯色反應(yīng)：不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種后，β-半乳糖苷酶酶解鄰硝基苯半乳糖苷

二、產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種選育31(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜虯.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：解除反饋?zhàn)瓒?降低末端產(chǎn)物濃度）B.選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變

(代謝失調(diào)，抗反饋?zhàn)瓒敉蛔冎?(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?2A.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

在直線式生物合成途徑中積累中間代謝產(chǎn)物；利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑中的末端產(chǎn)物

A.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

在直線式生物合成途徑中積累中間代33在直線式生物合成途徑中：典型的例子是利用精氨酸缺陷型突變株進(jìn)行鳥氨酸發(fā)酵

L-Glu乙酰谷氨酸激酶L-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶瓜氨酸精氨酸？由于合成途徑中酶6(轉(zhuǎn)氨甲酰酶)的缺陷，必須供應(yīng)精氨酸和瓜氨酸，菌株才能生長，但是這種供應(yīng)要維持在亞適量水平，使菌體達(dá)到最高生長，又不引起終產(chǎn)物對(duì)酶②(N—乙酰谷氨酸激酶)的反饋抑制，從而使鳥氨酸得以大量分泌累積。在直線式生物合成途徑中：典型的例子是利用精氨酸缺陷型突變株進(jìn)34L-谷氨酸脫氫酶

谷氨酰胺合成酶

酮戊二酸衍生類型利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑中的末端產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸谷氨酰胺酮戊二酸衍生類型利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝35選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

紫外和化學(xué)試劑誘變后，在篩選培養(yǎng)基（添加脯氨酸）中生長，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不長的為缺陷型。

選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

紫外和化學(xué)試劑誘變后，在篩選培養(yǎng)基（36選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變：篩選抗反饋?zhàn)瓒艉头答佉种仆蛔冎?。這種突變屬于代謝失調(diào)，即在細(xì)胞中已有大量的末端產(chǎn)物，仍不斷合成這一代謝產(chǎn)物。例子：L-精氨酸的生產(chǎn)篩選培養(yǎng)基(g/L):基本培養(yǎng)基添加少量D-Arg和脯氨酸。篩選營養(yǎng)缺陷型和結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株可結(jié)合使用。選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變：篩選抗反饋?zhàn)瓒艉头答佉种仆蛔冎?。這種37

三、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)

（一）酶生物合成的模式

根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長之間的關(guān)系，可將酶的生物合成分為四種模式，即：同步合成型生長偶聯(lián)型——中期合成型部分生長偶聯(lián)型——延續(xù)合成型非生長偶聯(lián)型——滯后合成型三、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)381.生長偶聯(lián)型（又稱同步合成型）

酶的生物合成與細(xì)胞生長同步。特點(diǎn)：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。如利用米根霉生產(chǎn)脂肪酶。

當(dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對(duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。1.生長偶聯(lián)型（又稱同步合成型）392、生長偶聯(lián)型中的特殊形式——中期合成型

酶的合成在細(xì)胞生長一段時(shí)間后才開始，而在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點(diǎn)：酶的合成受產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。

枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線

枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲403.部分生長偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型）

酶的合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長一段時(shí)間。特點(diǎn)：可受誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線3.部分生長偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型）黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成414.非生長偶聯(lián)型（又稱滯后合成型）

只有當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點(diǎn)：受分解代謝物的阻遏作用。所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線

4.非生長偶聯(lián)型（又稱滯后合成型）黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線42總結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素高：可在細(xì)胞停止生長后繼

1）mRNA的穩(wěn)定性續(xù)合成酶差：隨著細(xì)胞停止生長而終止酶的合成2）培養(yǎng)基中阻遏物的存在不受阻遏：隨著細(xì)胞的生長而開始酶的合成。受阻遏：細(xì)胞生長一段時(shí)間或平衡期后，酶才開始合成?？偨Y(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素43

酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開始生長就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時(shí)間。對(duì)于：同步合成型：提高對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：44第二章生物催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)與篩選第三節(jié)國內(nèi)外酶制劑的工業(yè)概況第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產(chǎn)

第二章生物催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性45第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性一、基本概念定義：是生物反應(yīng)過程中起催化作用的游離細(xì)胞、游離酶、固定化細(xì)胞或固定化酶的總稱。（一）分類：1、按結(jié)構(gòu)形態(tài)：細(xì)胞、酶、多細(xì)胞生物體2、按形式：游離型催化劑、固定化型催化劑第一節(jié)生物催化劑的來源與多樣性一、基本概念46（二）分離純化酶和微生物整細(xì)胞體系的優(yōu)缺點(diǎn)生物催化劑存在形式優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)分離純化酶任意形式設(shè)備簡(jiǎn)單；產(chǎn)物易分離；由于能忍受較高濃度，產(chǎn)率較高需要進(jìn)行輔助因子再循環(huán)溶于水酶活性高可能發(fā)生副反應(yīng)；親油底物不溶；產(chǎn)物分離時(shí)需要萃取懸浮于有機(jī)溶劑容易操作；產(chǎn)物易分離；親油底物可溶；酶的回收容易酶活性降低固定化酶的回收容易固定化過程中損失酶活性微生物細(xì)胞任意形式不需要輔助因子再循環(huán)設(shè)備昂貴；產(chǎn)物分離過程冗長；產(chǎn)率低；對(duì)有機(jī)溶劑忍受力差；可能有副反應(yīng)生長培養(yǎng)活性高生物量大；副產(chǎn)物多；操作控制困難休止細(xì)胞產(chǎn)物分離較容易；副產(chǎn)物較少活性較低固定化細(xì)胞細(xì)胞可再利用活性較低（二）分離純化酶和微生物整細(xì)胞體系的優(yōu)缺點(diǎn)生物催化劑存在形式47酶催化劑（酶反應(yīng)過程）活細(xì)胞催化劑（發(fā)酵過程）用途單酶系統(tǒng)時(shí)，用于單一反應(yīng)；多酶系統(tǒng)時(shí)，可用于若干串聯(lián)反應(yīng)系列的串聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)物可以是簡(jiǎn)單以及復(fù)雜的代謝產(chǎn)物來源和價(jià)格從細(xì)胞中提取，技術(shù)較為困難，除若干商品酶制劑外，價(jià)格昂貴發(fā)酵開始時(shí)，接入少量種子液，價(jià)格低廉穩(wěn)定性較差，只有高穩(wěn)定性的或經(jīng)穩(wěn)定性修飾的，才能工業(yè)應(yīng)用略高，但須不斷保持其穩(wěn)定性輔酶再生在需要進(jìn)行輔酶再生的反應(yīng)中，技術(shù)和經(jīng)濟(jì)問題難以解決在新陳代謝過程中自行解決原料要求簡(jiǎn)單，但要求較高純度的化合物作底物可用粗原料，但要考慮菌體生長和產(chǎn)物形成的必要成分作培養(yǎng)基反應(yīng)時(shí)間短，數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)長，一天左右至一周以上反應(yīng)器體積較小，但較復(fù)雜，體積較大，但較簡(jiǎn)單過程控制簡(jiǎn)單復(fù)雜，過程常分菌體生長和產(chǎn)物形成兩個(gè)階段；物料成分性質(zhì)復(fù)雜，反應(yīng)途徑易于失控。產(chǎn)品分離簡(jiǎn)單復(fù)雜，反應(yīng)終了時(shí)產(chǎn)物含量低，副產(chǎn)物較多，且含有菌體工業(yè)應(yīng)用較少，目前用于工業(yè)生產(chǎn)的不超過10種較多，常見的有數(shù)十種酶催化劑（酶反應(yīng)過程）活細(xì)胞催化劑（發(fā)酵過程）用途單酶系統(tǒng)時(shí)48二、生物催化劑的來源與多樣性生物催化劑來源的多樣性體現(xiàn)在微生物的多樣性。土壤、水域、動(dòng)植物、極端環(huán)境、特殊環(huán)境二、生物催化劑的來源與多樣性生物催化劑來源的多樣性體現(xiàn)在微生49第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)和篩選對(duì)于一個(gè)特定的生物轉(zhuǎn)化過程，生物催化劑的篩選和制備是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，因?yàn)槠浠钚?、選擇性和穩(wěn)定性的高低將直接影響生物催化過程的效率，也是關(guān)系將來能否實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。要獲得一個(gè)具有潛在工業(yè)化應(yīng)用前景的優(yōu)良生物催化劑，往往要經(jīng)過微生物菌種的自然分離、誘變育種或定向改造，酶的發(fā)酵、提取和純化，以及酶或細(xì)胞的固定化等一系列環(huán)節(jié)。有時(shí)還要采用基因克隆、蛋白質(zhì)工程和定向進(jìn)化等分子生物學(xué)方法進(jìn)一步提高菌種的產(chǎn)酶水平或者改變酶的催化性能。

第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)和篩選對(duì)于一個(gè)特定的生物轉(zhuǎn)化過程，生50第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)和篩選一方面，我們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)新的酶促反應(yīng)過程時(shí)，必須找到一個(gè)適合這個(gè)反應(yīng)的酶，另一方面，新酶的發(fā)現(xiàn)也為設(shè)計(jì)新的酶促過程提供新的思路。發(fā)現(xiàn)新酶最有效和成功的方法之一，就是從微生物生活的自然界篩選獲得一定數(shù)量的微生物菌種。第二節(jié)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)和篩選一方面，我們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)新的酶促51微生物酶篩選的策略常規(guī)生物催化劑發(fā)現(xiàn)的一般過程：（一）設(shè)計(jì)反應(yīng)過程（二）選擇合適的酶或產(chǎn)酶微生物（三）建立有效且方便的分析方法。微生物酶篩選的策略常規(guī)生物催化劑發(fā)現(xiàn)的一般過程：52（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)在設(shè)計(jì)目標(biāo)化合物合成的酶促反應(yīng)過程中，選擇合適的反應(yīng)底物、合適的反應(yīng)途徑以及目標(biāo)化合物的性質(zhì)都非常重要。（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)53（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)

酰胺烷基化D-脫酰胺酶D-海因酶自發(fā)消旋化

5-單取代海因

（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)

酰胺烷基化D-脫酰胺酶54（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)

產(chǎn)生多種副產(chǎn)物Rhodococcusrhodochrous（一）生物催化劑篩選中的反應(yīng)過程設(shè)計(jì)

產(chǎn)生多種副產(chǎn)物Rhod55微生物酶篩選的策略（二）選擇合適的酶或產(chǎn)酶微生物1、途徑和方法（1）從國內(nèi)外市售的商品酶和菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的相關(guān)微生物中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)催化劑；（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催化劑；（3）從已有的酶中發(fā)現(xiàn)新的非天然催化活力；（4）利用新的反應(yīng)條件、改變反應(yīng)介質(zhì)或?qū)ふ倚碌挠绊懸蜃樱唬?）采用基因工程、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)獲取新的催化劑。微生物酶篩選的策略（二）選擇合適的酶或產(chǎn)酶微生物56（二）酶或產(chǎn)酶微生物的篩選一般產(chǎn)酶微生物篩選的原則1、能夠通過發(fā)酵在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)高產(chǎn)目標(biāo)酶2、微生物應(yīng)該盡可能地利用便宜和方便的原料生產(chǎn)酶3、微生物所產(chǎn)生的酶最好有比較高的專一性4、所采用的微生物應(yīng)該是不產(chǎn)生有害物質(zhì)的非致病性的安全微生物5、微生物的遺傳穩(wěn)定性應(yīng)該比較高（二）酶或產(chǎn)酶微生物的篩選一般產(chǎn)酶微生物篩選的原則571、途徑和方法（1）從國內(nèi)外市售的商品酶和菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的相關(guān)微生物中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)催化劑；只能提供少數(shù)幾個(gè)有限的催化劑來源

世界主要酶制劑公司公司名國家公司名國家Amano日本NovoNordisk丹麥Genecor美國Sigma美國1、途徑和方法（1）從國內(nèi)外市售的商品酶和菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的58丹麥novonordisk諾和諾德：世界著名生物制藥和生化制品集團(tuán)公司，成立于1923年，憑借自身的研發(fā)實(shí)力成為世界糖尿病治療領(lǐng)域先導(dǎo)，在行業(yè)內(nèi)擁有為廣泛的糖尿病治療產(chǎn)品，生產(chǎn)的胰島素和酶制劑分別占世界市場(chǎng)份額的50%和40%以上。

丹麥novonordisk諾和諾德：世界著名生物制藥和59我國主要菌種保藏單位及其隸屬機(jī)構(gòu)保藏單位（縮寫）保藏單位名稱隸屬機(jī)構(gòu)ACCC(AgriculturalCultureCollectionofChina)

中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所CFCC(ChinaForestryCultureCollectionCenter)中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國林業(yè)科學(xué)院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所CGMCC

中國普通微生物菌種保藏管理中心中國科學(xué)院微生物研究所CICC(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國食品發(fā)酵工業(yè)研究所CMCC中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心中國藥品生物制品檢定所、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院南京皮膚病研究所、中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所CPCC中國藥用微生物菌種保藏管理中心中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所、四川抗生素工業(yè)研究所、華北制藥廠抗生素研究所CVCC中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心中國獸藥監(jiān)察所我國主要菌種保藏單位及其隸屬機(jī)構(gòu)保藏單位（縮寫）保藏單位名稱60著名的國際菌種保藏機(jī)構(gòu)菌種保藏機(jī)構(gòu)網(wǎng)站美國典型菌種保藏中心：ATCC(AmericanTypeCultureCollection）德國微生物和細(xì)胞收藏中心DSMhttp://www.dsmz.de/dsmzhome.htmNRRL(ARS)美國農(nóng)業(yè)服務(wù)菌種中心CBS荷蘭菌種收藏中心著名的國際菌種保藏機(jī)構(gòu)菌種保藏機(jī)構(gòu)網(wǎng)站美國典型菌種保藏中心：61（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催化劑；（3）從已有的酶中發(fā)現(xiàn)新的非天然催化活力；（4）利用新的反應(yīng)條件、改變反應(yīng)介質(zhì)或?qū)ふ倚碌挠绊懸蜃?；?）采用基因工程、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)獲取新的催化劑。（2）從土壤、污染區(qū)等自然環(huán)境中分離篩選具有新的催化活力的催62（三）建立有效和方便的篩選分析方法高溫是篩選嗜熱酶嗜熱菌的有效方法；目標(biāo)底物是最好的篩選因素；（三）建立有效和方便的篩選分析方法高溫是篩選嗜熱酶嗜熱菌的有63第三節(jié)：國內(nèi)外酶制劑工業(yè)概況一．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀二．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用差異三．我國酶制劑工業(yè)的若干對(duì)策建議第三節(jié)：國內(nèi)外酶制劑工業(yè)概況一．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀64一．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀1世界三大酶制劑公司NovoNordisk（丹麥）GenencorInternational(美國）Cuitor(芬蘭）三大公司銷售額占世界總額的70%一．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀1世界三大酶制劑公司652、國際市場(chǎng)酶制劑銷售額比例

2001年工業(yè)酶制劑的世界市場(chǎng)約為15億美元用于制藥工業(yè)與精細(xì)化學(xué)工業(yè)約1.2億~1.5億美元2、國際市場(chǎng)酶制劑銷售額比例663、我國酶工業(yè)發(fā)展階段11965無錫酶制劑廠淀粉酶21979糖化酶3堿性蛋白酶4中性蛋白酶51993耐高溫淀粉酶61998國外大公司紛紛入駐1999年投產(chǎn)3、我國酶工業(yè)發(fā)展階段11965無錫酶制劑廠淀粉酶67國內(nèi)酶制劑銷售額比例國內(nèi)酶制劑銷售額比例68二．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用差異1．規(guī)模：國外多公司重組國內(nèi)重復(fù)建設(shè)、效益低2投入：國外：開發(fā)經(jīng)費(fèi)高達(dá)15%，甚至19%銷售額國內(nèi)：研究、開發(fā)投入不足，占1%銷售額3開發(fā)重點(diǎn)國外：大力研制、開發(fā)新酶種和新用途國內(nèi)：品種少、劑型少二．國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用差異1．規(guī)模：國外多公司重組69三、工業(yè)用生物催化劑的要求減少不必要的副反應(yīng)，有利于選擇性生物催化反應(yīng)的專一性；穩(wěn)定性好，包括操作穩(wěn)定性與貯存穩(wěn)定型批次之間的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好能夠反復(fù)實(shí)驗(yàn)。三、工業(yè)用生物催化劑的要求減少不必要的副反應(yīng)，有利于選擇性生70四、商品酶的劑型液體酶制劑固體粗酶制劑純酶制劑固定化酶制劑四、商品酶的劑型液體酶制劑71第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產(chǎn)一、微生物產(chǎn)酶菌種二、產(chǎn)酶培養(yǎng)基三、種子培養(yǎng)與發(fā)酵產(chǎn)酶四、微生物生長與發(fā)酵產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)五、發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶的影響第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產(chǎn)一、微生物產(chǎn)酶菌種72一.常用的產(chǎn)酶微生物Escherichia

coli

PseudomonasBacillussubtilis

StreptomycesAspergillusnigerAspergillusoryzaePenicilliumTrichodermaRhizopusMucorSaccharomycescerevisiaeCandida第四節(jié)生物催化劑的發(fā)酵生產(chǎn)一.常用的產(chǎn)酶微生物Escherichiacoli73Escherichiacoli：谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、青霉素?；?、半乳糖苷酶Bacillussubtilis：α-淀粉酶、中性蛋白酶Escherichiacoli：谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、74二、產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種選育1.自然育種：未經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過程稱為自然選育。

2.誘變育種：利用誘變劑處理微生物細(xì)胞，提高基因突變頻率，再通過適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。

(1)使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型——選育組成型突變株

培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)酶抑制劑，使組成型菌株被富集。

β-半乳糖苷酶的抑制劑鄰硝基-β-D-巖藻糖苷交替培養(yǎng)法：乳糖培養(yǎng)基葡萄糖培養(yǎng)基乳糖培養(yǎng)基顯色反應(yīng)：不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種后，β-半乳糖苷酶酶解鄰硝基苯半乳糖苷

二、產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種選育75(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜虯.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：解除反饋?zhàn)瓒?降低末端產(chǎn)物濃度）B.選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變

(代謝失調(diào)，抗反饋?zhàn)瓒敉蛔冎?(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?6A.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

在直線式生物合成途徑中積累中間代謝產(chǎn)物；利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑中的末端產(chǎn)物

A.選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

在直線式生物合成途徑中積累中間代77在直線式生物合成途徑中：典型的例子是利用精氨酸缺陷型突變株進(jìn)行鳥氨酸發(fā)酵

L-Glu乙酰谷氨酸激酶L-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶瓜氨酸精氨酸？由于合成途徑中酶6(轉(zhuǎn)氨甲酰酶)的缺陷，必須供應(yīng)精氨酸和瓜氨酸，菌株才能生長，但是這種供應(yīng)要維持在亞適量水平，使菌體達(dá)到最高生長，又不引起終產(chǎn)物對(duì)酶②(N—乙酰谷氨酸激酶)的反饋抑制，從而使鳥氨酸得以大量分泌累積。在直線式生物合成途徑中：典型的例子是利用精氨酸缺陷型突變株進(jìn)78L-谷氨酸脫氫酶

谷氨酰胺合成酶

酮戊二酸衍生類型利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑中的末端產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸谷氨酰胺酮戊二酸衍生類型利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝79選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

紫外和化學(xué)試劑誘變后，在篩選培養(yǎng)基（添加脯氨酸）中生長，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不長的為缺陷型。

選育營養(yǎng)缺陷型突變株：

紫外和化學(xué)試劑誘變后，在篩選培養(yǎng)基（80選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變：篩選抗反饋?zhàn)瓒艉头答佉种仆蛔冎?。這種突變屬于代謝失調(diào)，即在細(xì)胞中已有大量的末端產(chǎn)物，仍不斷合成這一代謝產(chǎn)物。例子：L-精氨酸的生產(chǎn)篩選培養(yǎng)基(g/L):基本培養(yǎng)基添加少量D-Arg和脯氨酸。