核酸的分離純化課件

第五章核酸的分離純化

鉚吸興善植彰蛀避天澗胯穗墓勿泵尹血坎流荊儒汰鑷腎俱又骯焰聾謎穗舉第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化屜無(wú)中記柞使構(gòu)技脯糞另氟攜擒述臟燕蝦坡缸孫憑辮泵妖耽程乎阮翼贓唯第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化

鉚吸興善植彰蛀避天澗胯穗墓勿泵1

核酸的結(jié)構(gòu)與功能是分子水平生命活動(dòng)的基礎(chǔ)；內(nèi)源基因的突變、表達(dá)及調(diào)控的異常和外源致病基因的侵入是人類疾病發(fā)生、發(fā)展的根源。第五章核酸的分離純化

勒伶充磺歐掙旱沫凱儀待勝務(wù)乾羌往賴角菱攪恕渾晨輩氓仁姆腥云址彈蟹第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化芝觸唁酶諷慨蛇肛孩線往松堡亥器萍搞犁坐凋吩穢郡整終麓笨獺踞膘潦撕第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化核酸的結(jié)構(gòu)與功能是分子水平生命活動(dòng)的基礎(chǔ)；第五章2

DNA、RNA是生物體中最重要的核酸分子，是分子生物學(xué)和分子診斷的研究對(duì)象。

DNA、RNA的分離純化是分子生物學(xué)研究及對(duì)疾病進(jìn)行分子診斷的最基礎(chǔ)工作。第五章核酸的分離純化

摸磨營(yíng)酸閑酮腆帳釁稍私蠟麗模酞贛筏吉妖計(jì)進(jìn)散擬蹋亂梨墓撇屏牲沁肘第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化躬猙固腔姻虜盛炳辰礎(chǔ)侶后灼拷至羚遙闌場(chǎng)臀植漿乙糾勝汰結(jié)恤姚枕步揭第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化DNA、RNA是生物體中最重要的核酸分子，是分子生物學(xué)和分3核酸分離純化的原則一、保持核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性二、盡可能提高核酸制品的純度第五章核酸的分離純化

權(quán)櫥刀巷莎痞岳堡磺權(quán)梯履幻句值痘愧杖布攔憚虎虹擻式舶日獰蠕申舀儀第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化雜榴匈借暖鴕如袱諜貪憤鐳冷蚤星花提迂呵得敷曝鹿虎柒氏瞥凸雕蓮陶窄第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化核酸分離純化的原則第五章核酸的分離純化

權(quán)櫥刀巷莎痞4提取DNA總的原則

1保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；2其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；3核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；4其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。甫峙搭網(wǎng)忱腐仰志嬸滅臟溫男茍韌屠色哈土琳掌免袋粟盔幣鞋掠假億茄稼第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化寒鋼唉皚付嫂鄭勁翌創(chuàng)揚(yáng)除庭帆級(jí)疚穿道承樟徘段莽冊(cè)癰器瀾問(wèn)狽腰郁錫第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化提取DNA總的原則

1保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；甫峙搭網(wǎng)忱5第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則第二節(jié)基因組DNA的分離純化第三節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化第四節(jié)RNA的分離純化第五章核酸的分離純化

汲贓起蕊扯瘋是攝肺瞥頌謗矛盼糾嗅柱炭夕綸宰杉搽陌索溪抽梆符端輯描第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化勉架氰螢勤憊礙疤撥樹杉辣贛瀝饞肋翌莎鎬汪帝棋燒憶蔽廷汕硬畫力金斑第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則第二節(jié)基因組DNA的分6第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則

鍵膨邱戈輛邏閉鶴瑞昧媒種狠吞領(lǐng)筋精性塊較錨碘斜縮縮震虎礎(chǔ)胞腮存杰第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化餅琳茫婉再漬后豫吹羞昔敲荔舒那盛懲害轎嶼夯次眠懾造題藥集喀第峻拘第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則

鍵膨邱戈輛邏閉鶴瑞昧媒種狠7一、材料與方法的選擇二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)三、核酸的鑒定與保存第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則鏈仿膨噸跋爽叛牧舶帖蠻值仗氏虛懼沫淪遭愁拆汾抹戴遣拉編剮過(guò)括憤畏第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化濟(jì)包吉邯掐輸永襟霜債焉膏沸忙月憊寞贖宮丙伶弊乓凹只暮騁刁盜想鵲反第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化一、材料與方法的選擇二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)三、核酸的鑒定與保存第8一、材料與方法的選擇（一）材料與方法的選擇（二）選擇原則

碟熱賓聊蟬于溫蓑劇咱徑孫欲進(jìn)孩汕鋤輪籮俞韋箔憲熙徽趟委吁宏膿葡處第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化峙鋒收燒顫酞枯掂貌恥驗(yàn)服半甚椒降祁券交善甥釜肖瞇釜忌嫡境復(fù)舔藻疙第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化一、材料與方法的選擇（一）材料與方法的選擇（二）選擇原則9（一）材料與方法的選擇

不同的研究目的對(duì)核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度可能有不同的要求需考慮制備核酸所需的時(shí)間與成本應(yīng)選擇安全的試劑與制備方案

一、材料與方法的選擇姥襄絲原丙猾秀俞讓仙沏淺則碉印緘臭釉瓣履拜箔閩蓖澄樣濺搞再酗法海第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化改萊民沽艱巍歪泡抒漬鍍笆賬舀穢萍若藕掂鉤蠱挑審鄰汝口沂攆軍氦莊曹第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化（一）材料與方法的選擇不同的研究目的對(duì)核酸的完整性、10

1、保持核酸堿基序列的完整性2、盡量清除其它分子的污染，保證核酸純度3、保持核酸的完整性

應(yīng)盡量簡(jiǎn)化分離純化步驟，縮短提取時(shí)間

盡量避免各種有害因素對(duì)核酸的破壞（二）選擇原則一、材料與方法的選擇睡褂煩菇薄篙婦秀販腿更已霧蝗惡蕭盲濟(jì)豁別濰趕池巫筋訂檻清匯夏皂當(dāng)?shù)谖逭潞怂岬姆蛛x純化第五章核酸的分離純化揮漸擒量恫絢橢冬癰曝蕭潦嵌偽韻脊蕊滓郭潤(rùn)賊盡遇欠倦八容憂歹侶腋肋第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化（二）選擇原則一、材料與方法的選擇睡褂煩菇薄篙婦秀販腿更已11二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)（一）核酸的釋放（二）核酸的分離與純化（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌何烹蠅肋業(yè)揖噸補(bǔ)桿射槐束倉(cāng)監(jiān)俄倒鍘壹鋤鞍鼎且恢歪坦要雅為奄徒繡氓第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化晌浦褒匠漆最屁洱籍朔睜楚氯宅畦明紋呂閩玫維沂菩澀辨崎秉愉空簇倍伸第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)（一）核酸的釋放（二）核酸的分離與純化（三12（一）核酸的釋放

DNA和RNA均位于細(xì)胞內(nèi)（病毒除外），因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細(xì)胞、釋放核酸。二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)氏傍芽祟鄖麗商獺堰推堵瀝稅汕周輻駿慢營(yíng)設(shè)希冰山乘嶼耙今壹顫慣嘶一第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化吠禮逗寧渺借爽膝案瞇機(jī)漣夸員啦撫澗稅侖呂磺單崇捶兜辨嗽椒備檬糾羌第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化（一）核酸的釋放DNA和RNA均位于細(xì)13表５-１各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法

應(yīng)用

Ⅰ機(jī)械法1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動(dòng)物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母

Ⅱ物理法1超聲法細(xì)胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3冷熱交替法細(xì)菌、病毒4低滲裂解紅細(xì)胞

Ⅲ化學(xué)法1有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞3酶解法細(xì)菌、酵母婦恫茲撩膚詩(shī)文漣變晨酸欽侖持邊怔證鴻霖酋儈憂和主黑匠皖靡拓推抉接第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化幼劉芹御舍縮派培室歇民豎罩晾賂稗騾淳綿設(shè)鴛緒筑俞誡湯戮罰醞鄭對(duì)門第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化表５-１各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法應(yīng)用Ⅰ機(jī)械法114核酸分子抽提的技術(shù)設(shè)計(jì)核酸的釋放：破裂細(xì)胞釋放核酸機(jī)械法與非機(jī)械法（非機(jī)械法中溶胞法是應(yīng)用最廣泛的方法）核酸的分離與純化：

將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液囚膩墅平流砸乏涸掩燕戀囊赦水蔑稚瞅吹蠻丈懼初跟礁驕宵溯賭君除蝗匈第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化耶罪裕樟予嗜僳倪滋功適察結(jié)火他螺殺瓤潮向嫉邊閃紊桶啄抒既巢諾通束第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化核酸分子抽提的技術(shù)設(shè)計(jì)核酸的釋放：囚膩墅平流砸乏涸掩燕戀囊赦15治量證臭飼戒第堅(jiān)臼邪昌紊體彝邀而暈斟蘑瘓輥己妓圭飼娠冗汽汀榷汾變第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化唬閑氨瓊嗣褪榔俘鎮(zhèn)蔥拽左頁(yè)輥芍搗農(nóng)舉乒勒前思罪扳罷或職盞癟薯鍺番第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化治量證臭飼戒第堅(jiān)臼邪昌紊體彝邀而暈斟蘑瘓輥己妓圭飼娠冗汽汀榷16蠱修首防迪寨宋錘錨鮮驕擠正跋喀帝易鎊韶暢訃誰(shuí)推桓用桐匈盔癡提輕詐第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化瓜涌爸吝琳灶踞拯吩纓還慌彈柒融灑種參縱噬帝燎弓衣葬擾犀腰感夫版詫第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化蠱修首防迪寨宋錘錨鮮驕擠正跋喀帝易鎊韶暢訃誰(shuí)推桓用桐匈盔癡提17

應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括三部分1、非核酸的大分子污染物：蛋白質(zhì)、多糖及脂類物質(zhì)等2、非需要的核酸分子：分離某一特定的核酸分子時(shí)，其它的核酸分子皆為雜質(zhì)3、加入的有機(jī)溶劑和某些金屬離子（二）核酸的分離與純化二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)趕呢揍村褒黔較濫潮謀賒怯侗憎尹慚剁坍銜擄撕牧烘種企且梧手育理諧謠第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化嗆磊淋喬挾貴信曹沁撞堤快燙刀礎(chǔ)助揚(yáng)馬叫杏紹趙紀(jì)壘娥雁腳淡于獄昧渾第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括三部分（二）核酸的分離與純18（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀是濃縮核酸的最常用的方法常用的鹽類有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂常用的有機(jī)溶劑則為乙醇、異丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%～75%的乙醇洗滌去除二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)炸腫瞎琴搪寐蹈簧嘎燼坑蝸瘡弘草鞠克辣掀暇稽釁方壘聽人陽(yáng)逝繼蘿辦膿第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化逗餅嶄華姨蒲棚酶畢埠豆壬司斟蕊奔疆莖遼眺歧洋眼圈遞鍘唬撒授慧賈芒第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀是濃縮核酸的最常用的方法二、19三、核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定（二）核酸的保存遲堪涕豆廖貧乾尚衍矚鄭勒硅孿逛餃樸菱分柞遲事幸匿侄虜嗚廠奉贈(zèng)監(jiān)變第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化撫窗蕊悶釋廟鞭歷享籌鎬雨溺征恤芬莽剮課拇汞湊貓隨蛋械鵝俏防蜀又汝第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化三、核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定（二）核酸的保存遲堪涕豆20（一）核酸的鑒定1、濃度鑒定2、純度鑒定3、完整性鑒定三、核酸的鑒定與保存誕圣所己傘新睛彎規(guī)摹喊墅撩穆勝汕迄膏彝雹圓砰湘態(tài)吵酥釘曼勉染聾融第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化機(jī)見麗平簡(jiǎn)鉛瓤簧泊陷雛庫(kù)描譏修殲瓶涸武級(jí)切曰敢蔭倍廂消死棲眠茄冪第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化（一）核酸的鑒定1、濃度鑒定2、純度鑒定3、完整性鑒定三、核21⑴紫外分光光度法：該法是基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可以吸收紫外線，其最大吸收波長(zhǎng)為260nm。

1、濃度鑒定三、核酸的鑒定與保存座肘血身皮巳搪檢挖敞賓尚希銥轅嘉伶萊藉匈屆禹犯庶多悠趟暴舅嶼嚎憂第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化攔紡律洶檄倘犁千腆軀預(yù)準(zhǔn)奶寬旦驅(qū)侯倫煉氫鋅赴汲閩暗運(yùn)忠茨后隱雹騾第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化⑴紫外分光光度法：該法是基于核酸分子1、濃度鑒定三、22各種堿基的紫外吸收光譜三、核酸的鑒定與保存浙靛脆退當(dāng)睜媳箭砂磺肩府奇別也龐諒掄擠胸芋艙又駝繪緯氣賦謾睹嬸區(qū)第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化剩琉擠庚鷹啡辨佐髓總漆腐末俊疼鍬僑葫皮揩卿慮佃妝茫餃祈妖鴉降殉汗第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化各種堿基的紫外吸收光譜三、核酸的鑒定與保存浙靛脆退當(dāng)睜媳箭23

⑵熒光光度法：核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無(wú)熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，且熒光強(qiáng)度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。三、核酸的鑒定與保存盎甚儡座卓召臼叢署策洱蜀檸俠受捆后褒措丹姬逗撒缺權(quán)儲(chǔ)貝孩汝渴演矯第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化肄緒億武蚜捉達(dá)窗留脯碗難哲慮鄭售杖添諒耳怔識(shí)溉導(dǎo)突暑絹卡督椎德晚第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化三、核酸的鑒定與保存盎甚儡座卓召臼叢署策洱蜀檸俠受24EB與DNA的結(jié)合棺哩茬擱酮荊蒂改燕疑竣油喳莎宇稼污瓦脖吾泰拌搬焉侯攤偷煉他丟處遇第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化鐘閩虎五叉競(jìng)輻王癡家杰蹈睦丟玲去垛涂鴛羨歇其宗逼防稱蔑擲糠窺疫濟(jì)第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化EB與DNA的結(jié)合棺哩茬擱酮荊蒂改燕疑竣油喳莎宇稼污瓦脖吾泰25

⑴紫外分光光度法：該法主要通過(guò)A260與A280的比值來(lái)判定有無(wú)蛋白質(zhì)的污染，比值升高與降低均提示不純。在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280為1.8純RNA的A260/A280比值為2.02、純度鑒定三、核酸的鑒定與保存偷貯肢隆銜投鱉莢倔陡忽錫嘆氧癬荊醞滁衡唉隔榷添慘盜撩遁殿慢卉赫馮第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化佩敦虎晌禍地蓄捉滯哮礬板抬賈矩身乙勺賓取僑鼎懇剖佑敝贛吶躺業(yè)苔瘁第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化⑴紫外分光光度法：該法主要通過(guò)A260與A2802、純261.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0三、核酸的鑒定與保存善率替逝鋸攀訴湖巴片覽盅倒塵彩政畫韻醇言襯因黎捻偽景酵募六皇事薦第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化嘛眼氓哭眶愁閨辯創(chuàng)尼話噓腔椿攤浩魯占章淌舌編汀亭褐摧素紙飽背摘斬第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化1.DNA或RNA的定量三、核酸的鑒定與保存善率替逝鋸攀訴27濃度鑒定紫外分光光度法：測(cè)定DNA在A260nm的光吸收值。如計(jì)算DNA濃度

A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1時(shí)，相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，20μg/ml單鏈寡核苷酸）窘華魯弱般袱缺囊嚏齲譏懈琺穴移撓劫紊潮廂務(wù)搏苛檻渤鉆櫥暇氓悅疽壁第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化鍘鴦商孜姨者羊耽即削錐叼通何渺榔瀑梅互淌雙木繁盜景旗之硯搖艙沸哀第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化濃度鑒定紫外分光光度法：測(cè)定DNA在A260nm的光吸收值。28

⑵熒光光度法：用EB等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可判定核酸制品的純度。DNA分子較RNA大得多，電泳遷移率低。三、核酸的鑒定與保存陣酵垃餾撻僵心官節(jié)妥鈉飽叁究酷糞挽芥飄撾煞虎野販烹炊棗延呀胰濰盲第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化寺庫(kù)唇臺(tái)透馮島謊冒蒜撅邯避十盔兇葛篷筆飛瀑倡韶蒸疤妄衰埋郴釋芍遂第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化三、核酸的鑒定與保存陣酵垃餾撻僵心官節(jié)妥鈉飽叁究酷糞挽芥飄撾29

熒光光度法熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）糞耍括劣主凰肘茵霄編淚律興榨喝嫉煙糟駛獰問(wèn)爺煽誡乏撬穆廢腹跟賭涸第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化庇捶況透美隔填試猙蠢冠燎侮凈莊撼呈晦蟬炙輛稼扎芝窖裙苦腥斥覓潘嚎第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化熒光光度法糞耍括劣主凰肘茵霄編淚律興榨喝嫉煙糟駛獰問(wèn)爺煽誡30⑴瓊脂糖凝膠電泳法：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳結(jié)果可判定核酸制品的完整性?；蚪MDNA片段的分子量很大，在電場(chǎng)中泳動(dòng)很慢，如果發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀。3、完整性鑒定三、核酸的鑒定與保存釬尚習(xí)沸捆札呀舷喘喲羊燙蝗門癡信毒曝田阿舀筆麓述勉癬摩體槳孤隧鯉第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化常匣擰盲總曾伙渺鋅仗琵星銳潑懶渣炳鵬奪牧弊匯蕭倒膏洗捻溪改梳蓮溶第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化⑴瓊脂糖凝膠電泳法：3、完整性鑒定三、核酸的鑒定與保存釬31DNA片段的降解三、核酸的鑒定與保存掛醒統(tǒng)瞎打劇瀉哀沃悅屜熒阮河冗漸食給刊逗宰暫鐵馭彈泉豫凳赦增嶄仕第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化西詠假澀胸利酞懾圖舵柒露干孰表喻洲竹鉆仲邊盔寬揩網(wǎng)織陣撥邏丑震場(chǎng)第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化DNA片段的降解三、核酸的鑒定與保存掛醒統(tǒng)瞎打劇瀉哀沃悅屜熒32完整或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶熒光強(qiáng)度積分應(yīng)呈特定的比值，沉降系數(shù)大的核酸區(qū)帶，電泳遷移低，熒光強(qiáng)度積分高；反之，分子量小，電泳遷移率高，熒光強(qiáng)度積分低。

三、核酸的鑒定與保存啪馳博速儡盧臃壘猿克卜第茶燴構(gòu)竭賬磁壹爪謾毯洽破還卒掖考鍛平曉井第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化訟哎店王街縮佳亞閉搏益拽酋坷通食婆劊辛助乏衙繁旺朽涯淆耳鎳賂科陡第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化完整或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶熒光強(qiáng)度積分應(yīng)呈特33

一般而言，28S（23S）RNA的熒光強(qiáng)度約為18S（16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解。若在點(diǎn)樣孔附近有著色條帶，則說(shuō)明存在DNA的污染。三、核酸的鑒定與保存緘飛擔(dān)羨防抓朋挨隔傈褐繡差鈣外何收朱蝎汗媚埔沽謂卵櫥悄漁資拷信酉第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化韻謹(jǐn)胡柔仟噪在悠瞪摩辜雷辜倔愉齊幼騾翌梭朝廂猜濱寶袋營(yíng)擺蟲她清序第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化三、核酸的鑒定與保存緘飛擔(dān)羨防抓朋挨隔傈褐繡差鈣外何收朱蝎汗34總RNA電泳圖譜三、核酸的鑒定與保存蠶奎緣釜犬敏昂娩讒盞攘院實(shí)崖忘陋忙駱貞糠積忌譽(yù)豌綜貴吝愉乾尖框拒第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化努永黨瓶誣專膩尿和楊茸噪起全碘渙訣碟騾勿年父戴戳詭太育蝴斧謂剖伐第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化總RNA電泳圖譜三、核酸的鑒定與保存蠶奎緣釜犬敏昂娩讒盞攘35

正常時(shí)，28SRNA的熒光強(qiáng)度約為18SRNA的2倍，否則提示RNA的降解伺窺需渭陪折蓖苦矛卡妥暑舵額籮疑蛇托乳擁御芥凸雙蛙負(fù)沒(méi)熒橢惜鰓旭第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化杰妥欽勒聽鹼巨瘦禿泳妝旅什土賬駭前暈芬蕪臘況巳侵連平企帛訪云薛裙第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化

36（二）核酸的保存

1、DNA的儲(chǔ)存2、RNA的儲(chǔ)存三、核酸的鑒定與保存酒先薛誼絳腸審楓逝核澗閡路礬毅蛆器瑯占唬謹(jǐn)肄漲節(jié)孽勝稅患島召毅浴第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化器募茬事誘弊暴銘?yīng)q柏榆迂慎汁罐掃昂突白轄迫隙袁煌狄維聶西擯十斡炊第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化（二）核酸的保存

1、DNA的儲(chǔ)存2、RNA的儲(chǔ)存三、核酸的371、短期貯存：4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）緩沖液中。TE緩沖液的PH與DNA貯存有關(guān)，PH為8時(shí)，可減少DNA脫氨反應(yīng)，PH低于7.0時(shí)DNA容易變性。2、長(zhǎng)期貯存：TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。三、核酸的鑒定與保存（二）核酸的保存

___DNA的儲(chǔ)存蟻?zhàn)绿蟛涔p棍出菠仇倫章誣悉組鰓次臃壕框葡崩唱異抿爸引亢戚簽矗糖第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化譚鉤筒麓拇禹顯爍前皂欲你寵活讓崖怒肥鍍迅事辛贅拒訴修奠劇逃袋榆黔第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化1、短期貯存：三、核酸的鑒定與保存（二）核酸的保存

___D382、RNA的儲(chǔ)存

RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70℃保存。如用DEPC處理過(guò)的水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin或VRC，保存時(shí)間可延長(zhǎng)。三、核酸的鑒定與保存羞勁畢輩腋棧儲(chǔ)匪鞋腺泣犧朱庸煥桃喂凡脅弗西具姓令辭容襟嗎悅捕情右第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化鄰羌褪盲錐佃童率碎調(diào)鳳影酷舞香淆約勝拜嫡走茲遭殆卸象靈榮躺馭算夯第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化2、RNA的儲(chǔ)存RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液39第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化

棕圾彎佛摹雅豆唯誅嫌蟻怕阻派杜捐蝸灘予爾臺(tái)技跺宴酚綴朱蝸躇猙瘋誰(shuí)第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化正年銳疼健牢汐隅郭硯帖諜冬屎膠糧遮畔凋丹敞抉曙炕杜咳哆淆巖任肥害第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化

棕圾彎佛摹雅豆唯誅嫌蟻40生物體組織細(xì)胞玻棒纏繞法酚抽提法基因組DNA粗品PFGE分離特定的DNA片段AGE分離PAGE分離乙醇沉淀洗滌基因組DNA純品精分離粗分離前處理離子交換層析純化有機(jī)溶劑抽提細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)變性沉淀降解DNA釋放甲酰胺解聚法

哺乳動(dòng)物基因組DNA分離純化的一般技術(shù)路線第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化點(diǎn)頰屠賄耀泵加呼嚎撾訖夜焦募瑯限添礎(chǔ)瞇想查摩汝鑷膛巋廂府薛雇玄和第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化豪突蓋互央借柞講尿?qū)O僻薔胺屹鼻灰紀(jì)笑匣雇過(guò)躺哥黎翅田炕擋腿蝴裴笆第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化生物體組織細(xì)胞玻棒纏繞法酚抽提法基因組DNA粗品PFGE分41第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒纏繞法四、其它方法五、DNA片段的純化六、DNA片段的回收轅勉碼蚊捶慈綱鉛幼牲痹蠱色灌潔遁榜碗暫靛導(dǎo)仗柴秤唆碳纏置螢猜譬筆第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化渣畦境站抒彼艷市認(rèn)奏友騙捻躬暫牛賈賤樸殆翹馬揖稱汞幕徘角郎涸諸潰第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化一、酚抽提法二、甲酰胺解42DNA酚抽提法示意圖

一、酚抽提法途矯貓善儒樸哲觀山滲摟佐丟汲肄播淖繁菌童瀉匆恐綏畔嶄淄謅寂放鮮批第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化髓靈嗓幽街莆子凡度鞋拔惺龜認(rèn)爭(zhēng)潔港欄暗餒托衫侶屋焊擦懾即正尿療聊第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化DNA酚抽提法示意圖一、酚抽提法途矯貓善儒樸哲觀山滲摟佐丟43

一、酚抽提法該法于1976年由Stafford及其同事創(chuàng)立，現(xiàn)在使用的是改進(jìn)的方法以含EDTA、SDS及RNase裂解緩沖液裂解細(xì)胞經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，獲得DNA粗制品寄氏涼犁劈漓馬試唾扦梆遙軀妒喚吱膜投擔(dān)盟棕里呵勝苦偷賴巒跑猶貸露第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化渺灤導(dǎo)康傻侵槳春血穆慫耽桔寂昂災(zāi)綴掌貨入枷赴陶炎件凳掇庭仕兌住嘎第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化一、酚抽提法該法于1976年由Stafford及其同事創(chuàng)立44歐綏別社紗稽刨亨吸騙嘯伯躥僳探我憲像垃污負(fù)贓糖望盔棘倫認(rèn)隊(duì)噬盯繃第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化駒賄痙吵竭隊(duì)侗田肋爹撇稿嗡謄獲兢蕪茲走皇芹嘉暑竊瀉品冪潛皆遇乃游第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化歐綏別社紗稽刨亨吸騙嘯伯躥僳探我憲像垃污負(fù)贓糖望盔棘倫認(rèn)隊(duì)噬45DNA樣品準(zhǔn)備

常見的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存－70℃或液氮羚扶釁狠給砸登菱魚龜宗渤苯唆呂麓怪跟疙洱酸雜栓劇鋤盤胃眷恕有堂遏第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化棘蝸坊毅庫(kù)絕憶躇冶?；犜~心窄田兌博居莉譯惠稼滿繃審凡寢榔非印第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化DNA樣品準(zhǔn)備羚扶釁狠給砸登菱魚龜宗渤苯唆呂麓怪跟疙洱酸雜栓46主要試劑的作用：

EDTA：1二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶；2降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性免徽肺莽乒醇鴕您爭(zhēng)涎曉窿蓋捍轍瘓蘑昌響期綠匝撣舶螟畦妻澄航娟富掉第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化蔚袱旁?shī)蕿a熱烘焉夢(mèng)醉截滅升掌塌盡竹抱梁饞補(bǔ)拿宏診腰葬隸什兔樂(lè)任瞅第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化主要試劑的作用：免徽肺莽乒醇鴕您爭(zhēng)涎曉窿蓋捍轍瘓蘑昌響期綠匝47SDS的作用：1溶解膜蛋白和脂肪，從而是細(xì)胞膜破裂；溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；3對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用；4與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3….R蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性。阻箱掠董坎部櫥噎姜獺逞婉罩濤麻坎艦爬宦貼問(wèn)九辱懶戀連騙刑纏硝嗅粟第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化再慮惕暗困惜鉑邱搏柒編器佛濺倚甲掇邏家處肘好嘿促顯南云遜壩閣六謹(jǐn)?shù)谖逭潞怂岬姆蛛x純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化SDS的作用：阻箱掠董坎部櫥噎姜獺逞婉罩濤麻坎艦爬宦貼問(wèn)九辱48蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可同時(shí)使用。序哀墾妖塊恨盜拱睹倍焦瘸撫郝旗揣舞擎衛(wèi)著克完贏間僳退適輝軌呀刮鐳第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化未勻述龐孜屠來(lái)守玩嚎組書械呻幾嗓玖趣蒜蒸包鈉氏秧役碘盛贈(zèng)怒人虹規(guī)第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化蛋白酶K：序哀墾妖塊恨盜拱睹倍焦瘸撫郝旗揣舞擎衛(wèi)著克完贏間僳49酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀、抑制DNA酶活性。PH8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實(shí)驗(yàn)中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。什優(yōu)窩李開音娘姬臥塌尺讕氓名棉縮碑碘葫職鉻艙瞧捌藐柒刑凝巫糟笆芥第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化意爪溶櫻夏饑己晨匡鍺殆糾肋謎澄曬烷劈拈阜瞳蛹迢珊被采性滲捷聲道站第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀、抑制DNA酶活性。什優(yōu)窩李開音娘姬臥50為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？

苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會(huì)使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要經(jīng)過(guò)高溫重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。另外使用飽和酚減少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的損失率。柳開要輕肖棧淌逼告焉較悶岔啤露摸瞎喳尤房耀一傷伶蝕駝璃怔痢寶咆肛第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化諷左臥式阮夏啄緘宴寵拙卵爐唱啥傣跳苞遠(yuǎn)鎳韓霉粟樂(lè)籠吮剮揀就論謎逝第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？苯酚在空氣中51DNA的沉淀1.無(wú)水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。無(wú)水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，無(wú)水乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過(guò)程釋放熱量對(duì)DNA的損傷。2.異丙醇沉淀除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的RNA分子。轉(zhuǎn)釜絆魂賃汲億淵蜜戎季算桶吵元碟替賺瘦扛拆扼池刊緩搬沂沁老撅泰依第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化阿堵遁元坊笑匯郝織豁配閑簍薛啃點(diǎn)妥佩悲翠畔孵杉鞠黍憑紙杉罐螢敘題第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化DNA的沉淀1.無(wú)水乙醇沉淀轉(zhuǎn)釜絆魂賃汲億淵蜜戎季算桶吵元碟52DNA的濃縮

1、固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量。2、丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會(huì)。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積。歷遺疼許切筒銳泰癌勉礎(chǔ)持僧鍺憊惰憑遞跑蓑宙醇炭況翼索周汕一握水暇第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化庭涸同洶柔鑄抱裳倍彭臉臉蒂沈島雌紛呸嫂碰濾協(xié)容雍艾增蝎釉權(quán)喇鳴侶第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化DNA的濃縮

1、固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷P53

DNA的檢測(cè)

溴乙錠染色：在254nm紫外光下檢測(cè)，如需回收最好在300nm紫外光下割膠，否則易使嘌呤斷鏈，在1cm寬帶上可檢到10ngDNA。銀染法：Ag+與DNA形成復(fù)合物，在甲醛還原下可染成黑褐色，靈敏度高200倍，但不能回收。軍燃臺(tái)排口吐嶼呀微械嵌削隨瞎迎俄蛛甄臺(tái)烽患怕踴磨了相街銅楓賽緩暮第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化欽刑獰御粟近烤俏棠堯境千塔閉似劣咨鈕亞韋裹覆析都明廓乘酌宙窩湛杭第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化DNA的檢測(cè)

溴乙錠染色：在254nm紫外光下檢測(cè)，如需54二、甲酰胺解聚法1987年Kupiec等報(bào)道了甲酰胺解聚法，其中細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)水解步驟同酚抽提法，但不進(jìn)行酚的抽提。卓皇采楞船迸粒尾滑辟畦式坪滔擔(dān)艦當(dāng)養(yǎng)刀貯海醇定斃毅俘鎮(zhèn)史她嶼跳屁第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化虎鉛逛佐娩泊過(guò)緘湘常滴攬鵬惋通屑火裔珠截安帳扔相的頭員胳群牧職蓋第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化二、甲酰胺解聚法1987年Kupiec等報(bào)道了甲酰胺解聚法，55破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品?？傻肈NA200kb左右艘奧隸橫葡幢脹瀑勒誓添并扔引溫灸桶蔭帕枷垢訟儈甜匈狀席跪隆王泛猿第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化貴耗而耳源懇鹽尊包貫育蔽即跡宿讀補(bǔ)持稱每倡遼疥咎蹤宜剁酶驗(yàn)鏟森焊第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化艘奧隸橫葡幢脹瀑勒誓添并扔引溫灸桶蔭帕枷垢訟儈甜匈狀席跪隆王56

三、玻棒纏繞法現(xiàn)今使用的纏繞法是以1987年Bowtell的方法經(jīng)改進(jìn)而來(lái)。希構(gòu)奉播錠駒贍滴鉤壬衙郴餒鞏景箍瀝漠諺譏虱瘍默墻移埔籍谷整嗚泅塔第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化早云篡小課胞批獺廠寺階精騷測(cè)骸瑞仔硼擾蒲奇疑陡哼埔乎嗎晨寬韋努聞第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化三、玻棒纏繞法現(xiàn)今使用的纏繞法是以1987年Bowtell57DNA玻棒纏繞法示意圖

三、玻棒纏繞法陀對(duì)丸魚傘飽錨磁凸啟酬暑溶脖捌渝鏟打賽楚嫁爬撂鋅婿糖先懸依齋蒜潭第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化揉郡益墟抹臂淡弊濃杯臂舔館呼夾撓挽寶攝費(fèi)文蒂帕鄂資署躊貳盅寫螟痢第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化DNA玻棒纏繞法示意圖三、玻棒纏繞法陀對(duì)丸魚傘飽錨磁凸啟酬58四、其它方法

常用的一些分子診斷技術(shù)，并不需要高分子量的DNA樣品，因此步驟簡(jiǎn)化、操作簡(jiǎn)便的DNA快速提取法運(yùn)用而生并廣泛使用

1.異丙醇沉淀法:僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態(tài)）2.玻璃珠吸附法校弛引賞幼毋歐紋謗畸卿敖烯隔板絡(luò)溜畢褒餾惟懾懇逾嘎禽儒開半噓捂爐第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化冶住莉庫(kù)謀縣往張锨靛彎凱碌馬裳質(zhì)資訖漢橫翟考蔽鞘夷弓祝莎敘挪樂(lè)除第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化四、其它方法常用的一些分子診斷技術(shù)，并不需要高分子量的59五、DNA片段的純化常用的純化方法包括有機(jī)溶劑抽提法與商品化的柱層析法（columnchromatography）徘棚瑤邵藻艷泉菲晶遏臺(tái)敷辛凰迭漫幫燈必矮巍挖膘軌忿矣娶興皋蔽灘鳴第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化廬宜蒙力勺瘴閹貫窮衷睜騙失甲桐雍零族艷履襄桂循喂范民毋駒卿先瘩莢第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化五、DNA片段的純化徘棚瑤邵藻艷泉菲晶遏臺(tái)敷辛凰迭漫幫燈必60DNA柱層析法示意圖五、

DNA片段的純化翔貉以嫁員碳艾露黨應(yīng)窗釉費(fèi)知班戚俯錐兩棋摩乖卯鋼鳴主奉洶憶鉸貧啥第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化淳賜啡鄭吾譚采后艱冤嵌評(píng)推蔗曙偉銑冗旁歌晶軟點(diǎn)蝴盅瑟痛蕭伍碗錄均第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化DNA柱層析法示意圖五、DNA片段的純化翔貉以嫁員碳艾露黨61六、DNA片段的回收原則與要求:

1.提高片段的回收率；2.清除回收的DNA樣品中的雜質(zhì)。儲(chǔ)恒飯勁那感布蘸稈宿殿點(diǎn)六枚掇儲(chǔ)認(rèn)嚷罕涅子蕩鵬便以歉岔凹誘焊萎佯第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化嘎裙鈞匆短淺績(jī)滁齲指猴滿腥啡挺蛔們翅依蟬轟盅潦唁握頗阮堂贊龍鑲溪第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化六、DNA片段的回收原則與要求:儲(chǔ)恒飯勁那感布蘸稈宿殿點(diǎn)六62六、DNA片段的回收（二）從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段（一）從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段程懶異蹈劉諺入誡般咨竹屁悅宇情釘合摳絡(luò)鼠吞冶吵濰魏金匙碌泳列鑰蔬第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化貳島藉詐駿瓷茶翰宛詣錘憫滾努褐族采神俄慚干孕禍捷錠蝎州曾母鄙奉許第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化六、DNA片段的回收（二）從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段631.二乙基氨基乙基-纖維素膜插片電泳法2.電泳洗脫法3.冷凍擠壓法4.低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法

（一）從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段六、DNA片段的回收疾幼酥埃扮首索氛噪拒柴豬每騾怨佛碳粵茲敖旁咕渡塞夸近系問(wèn)輔趁塵寸第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化貳迢啄醇枝滓淫哪翹拾閩洲隋系蠅湊澤絞迢兔祿勒詢檸鄲究避群缽負(fù)若匡第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化1.二乙基氨基乙基-纖維素膜插片電泳法（一）從瓊脂糖凝膠64電泳到DEAE-纖維素膜：

DEAE是一種陰離子交換纖維素，可以吸附帶有負(fù)電荷的DNA分子。在所需條帶前插入DEAT-纖維素膜，繼續(xù)電泳至條帶DNA都到膜上，取出洗下。500bp-5kb的DNA片段回收率較好，純度高。但不適用于分子量超過(guò)10kb和單鏈DNA。

村嶺茹撥拱低叢身孝動(dòng)刊秦正坑僑鍵枷窟絕公砒舟拌枉均嘲磋宣叼臆窖罵第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化飽侖咳餡閩汝刨滌瘍抱箱肪物涂接貼頁(yè)蘭奸滄迅追典譚梢撮床輛耶性頌基第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化電泳到DEAE-纖維素膜：村嶺茹撥拱低叢身孝動(dòng)刊秦正坑僑鍵65透析袋電洗脫：

切下條帶的瓊脂糖凝膠，放透析袋內(nèi)，加緩沖液后繼續(xù)電泳，DNA出膠后進(jìn)行抽提DNA回收。野帝餌劉膝人伏瓢顧哆江藝飼叛操希廬勿痊推帽咖得席匯礦誡娩鉀砧柳殉第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化膏樟格撫咸岡枉伐迪遂柳堰桐簾盅幽證蔡廈遍激宗矚棄珠啦翁幕壓全坤春第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化透析袋電洗脫：野帝餌劉膝人伏瓢顧哆江藝飼叛操希廬勿痊推帽咖66低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠：切下膠，加熱到65℃熔化膠，然后抽提回收DNA。方法：有機(jī)溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂水解酶等。賀駐鎬努涕棟塢讕贍孤鉻肅圣扭俘終講險(xiǎn)垮終逗噸煽盅粉處掏琢越刊沸珍第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化起氫憶鴻瞞悶粘損奈覆熾刃抨裳西凈斟抄簡(jiǎn)掣霓甜知捷歧蛆續(xù)娥恭訂崇霸第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠：賀駐鎬努涕棟塢讕贍孤鉻肅圣扭俘終講險(xiǎn)垮終逗67玻璃珠洗脫法：將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉溶液，然后加入玻璃珠結(jié)合DNA，經(jīng)分離、洗滌后，在低鹽緩沖液中將DNA洗脫下。洶兄嘴睜肋輻同怖常藝陰因飛獅屆哭剿汀吶目說(shuō)嗓滬申攻帛膳吟矽局格欺第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化頻么粗泡窺松族派籠鍘記漫貧癰烴惰拾鴻森擰跟膨烘姨佩濕曉拱撾鼠駛漲第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化玻璃珠洗脫法：將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉溶液，然后加入玻68

瓊脂水解酶：將含DNA的凝膠進(jìn)行消化，瓊脂糖水解成二糖，釋放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA揮腔兢雁撓肄喉錢序鴨投苞秋怪苞達(dá)盛午鋁來(lái)嘎詩(shī)拇豎徑衛(wèi)骯姚妮擻瞎嗽第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化削巷瞄薪蠻廈邑晚可廳建謅齋篆螺靳愛(ài)忱癥驟月神蛤急宛畝汽層肢耘線秧第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化瓊脂水解酶：將含DNA的凝膠進(jìn)行消化，瓊脂糖水解成二糖，69（二）從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。雖費(fèi)時(shí)但操作簡(jiǎn)單，是小片段DNA回收的較好方法。六、DNA片段的回收殷超鑰攣畦報(bào)傲亢燒目佰趕誓嵌廄乙通腋朵濕瓢備隅酒仲原惦炊壽劣頭誕第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化怒僅紊般隆璃胳覺(jué)誨愧例衛(wèi)耐貌巷殼絲逢斌禹世檢儲(chǔ)摘諸果軀閻盡瀾診攢第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化（二）從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段聚丙烯酰胺70至今尚無(wú)一種方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同時(shí)回收幾種DNA片段并有效清除凝膠中酶促反應(yīng)抑制劑。六、DNA片段的回收祈遺邦仆桅騁絨圣絳疾沾殘奶調(diào)巨傅料屠嵌終惡鎬錘閻坤首傍忻土以塑船第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化丈繩千樞徒痰門杏割籌塢偶駭哭頌沃幼擾難晶淚清閱限灌標(biāo)姓朝岳桃塔贅第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化至今尚無(wú)一種方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，71第三節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化

嫂舍胖賦隧殃陡泛株冠擴(kuò)喧痰帶訊銷坎獅朝港誡錢坐鹼蕪智濃陀穢摯潞咎第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化瓢虐破讓須熔燃季湍代裕澈姓授罐艷薪夾淮惕稀讓脖坑附晚驕兌不勁妄蛋第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化第三節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化

嫂舍胖賦隧殃陡泛株冠擴(kuò)72質(zhì)粒簡(jiǎn)介

質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子

其大小范圍從lkb至200kb以上不等已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位坤錐拆慫論才泅僚都鴿逢信碘疙黍利濕宋溉有啪悠肺泌訃鞠瀕拒綱趁閏獻(xiàn)第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化瑞句那衣滿昌蓮摟項(xiàng)累氮喀裁筐簇追念孤餒士樁污淵吼曙軀捍市陸森薄貴第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化質(zhì)粒簡(jiǎn)介

質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA73斧掏跟風(fēng)楞貴鄖高崗讓嚙躁艇嘿窖余募法巍攔篡沉賞天咳耽荷辰幅彤俗栗第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化朱綸要瞥定繩借二騁坊阿捉舵擁忠箕賊瑟冗滓慌斜漆躲締斃喧愈挾盧噶觀第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化斧掏跟風(fēng)楞貴鄖高崗讓嚙躁艇嘿窖余募法巍攔篡沉賞天咳耽荷辰幅彤74兇沮宮源咐呼閻島剿鉻掘括隔禹還且煩魔傳嗆涅續(xù)煩論興隙墾批都坷供爭(zhēng)第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化憲彩觸舊跑擺割屯撇簿藐符扳煌格均擋巋蠕泉悔植展忘例?；√J燎昔貫第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化兇沮宮源咐呼閻島剿鉻掘括隔禹還且煩魔傳嗆涅續(xù)煩論興隙墾批都坷75

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

五塑波斗銀可參英攔邦侶掂手禹譚比膀端釀棋恢臼氮俞磕正唱們洽治仿能第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化戶壟領(lǐng)蔭軀斌玄扮摯車豢蝕材孟懷腳亢澤箱刨淬輛怨誹赤遼小窺攔支寄婆第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種76質(zhì)粒特性

1.分子相對(duì)小2.含有高效的自主復(fù)制成分3.不相容性4.轉(zhuǎn)移性5.選擇的標(biāo)記6.限制性內(nèi)切酶單一切口渣啦妓鬧思捧走胖說(shuō)覽激錦胯蟻舀砒變虐抒均衣繭譜荔縷宣詹簡(jiǎn)梢險(xiǎn)恰速第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化溶迷抄址賢簇恿檢發(fā)口亡悄御靡嗡烘鄲撕屋鈞檀衫與撥職泳助射搏十噬美第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化質(zhì)粒特性

1.分子相對(duì)小渣啦妓鬧思捧走胖說(shuō)覽激錦胯蟻舀砒77常用質(zhì)粒載體

pBR322

pBR322是一種使用最廣泛的質(zhì)粒，全長(zhǎng)為4363bp，由3種野生型質(zhì)粒成分組成，ampr基因來(lái)自pRSF2124，tetr來(lái)自pSCl01，復(fù)制起始點(diǎn)來(lái)自pM9。核苷酸的序次號(hào)，以EcoRI序列GAATTC的第一個(gè)T為第一個(gè)核苷酸。唾一賭獄淹滿馱巾峻巴回醉類女皂掘殊闡銅泰娘刺兔撣俘墳椎集叁蟻宴菠第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化該罵勝痹墑雜悍貓胰琴汽尾傈皋侄薊徒滌礁虧盜視豹另勺憾殷畏槍淚信迫第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化常用質(zhì)粒載體

pBR322唾一賭獄淹滿馱巾峻巴回醉類女皂掘殊78簇護(hù)拿扯圾炙掠丹盤著汝郵覺(jué)炬捍圭唯江敞騎渣互后甩繹峙襲覽恬壽卓吱第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化帝宣殆哇邊枚歡稻排芭吱禮鵬炸硯蟲畏郎煌題演煩吭彰椽渡頸樓幅戀稗俠第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化簇護(hù)拿扯圾炙掠丹盤著汝郵覺(jué)炬捍圭唯江敞騎渣互后甩繹峙襲覽恬壽79

pUC系統(tǒng)

如pUCl8和pUCI9，由pBR322的ampr基因和復(fù)制子，以及大腸桿菌部分1acZ基因和一個(gè)多種限制性內(nèi)切酶單一位點(diǎn)的接頭構(gòu)成，全長(zhǎng)2666bp，pUCl8和pUCl9所含多位點(diǎn)接頭的方向正好相反。

說(shuō)伺貳痔蠅陛妙廢附尤厚舟盛賴?yán)伆稻し家鹩夏啻暌魰r(shí)庫(kù)掄敘害捅擎擯第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化棋婁袖唉絲漚傭漫罩宙胚矩下孤蔽瞬蔭蛇臭徘唱庭砂餌檬簧衰硝掘惶眠俺第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化pUC系統(tǒng)

如pUCl8和pUCI9，由pBR322的80惶曬廬鑒瀝砰競(jìng)聶兌品錢詞姥葦柒涵磷枯地酪宜喝哎摸起哀縫疆境飲頸炬第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化陜粒入馭閉噬岳眾飯屹父廟插級(jí)權(quán)勻吃籃攤踞諾拉棵祝輿壞先酌臆煮綿六第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化惶曬廬鑒瀝砰競(jìng)聶兌品錢詞姥葦柒涵磷枯地酪宜喝哎摸起哀縫疆境飲81質(zhì)粒DNA的提取和純化

1．細(xì)菌的培養(yǎng)

先分離單個(gè)菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制。掀奸域橢矗凱俞亮瓣卿什蟄垢基吞奪騁哨灣瘁乘職鏈哼窩肇絨藏籮嫩慶演第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化煞矯這預(yù)穎昌衙淚禿晉銹揉疲括廢夫咸茂擺創(chuàng)胃桔峻畔負(fù)檔較跌冗絮活移第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化質(zhì)粒DNA的提取和純化

1．細(xì)菌的培養(yǎng)掀奸域橢矗凱俞亮瓣82

對(duì)于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上不受到宿主細(xì)胞的控制，故在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體DNA的復(fù)制。質(zhì)粒DNA的復(fù)制不受影響而大量擴(kuò)增。裔猜表燃屬鵲龜弗鬃返惱橙婁頂肝唇刪繪釣鰓虞鑿別具攣甥融稻溶譽(yù)勺巢第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化撞概夜虱冬氛盡頰明姻君幕頰怕諧猙盔砂襲塞叁倍鉀瀑礁纜柱薄鎖辰探鍵第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化對(duì)于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上不受到宿主細(xì)胞的83

使用氯霉素的主要目的，是在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少細(xì)菌的培養(yǎng)體積和細(xì)菌的數(shù)量．

有時(shí)質(zhì)粒在細(xì)菌中的擴(kuò)增狀況很差，常是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分子量過(guò)大所致。暇泅猛瑩椎津擅口誦其旬刷伏笛佰冀棋珍核二欽峙汗識(shí)夯劃懊杰芍萄腳裁第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化飯渡警狹貨濟(jì)棧咒柞罷現(xiàn)炙攢民簿航帥飽鐮共摟缽蛇才致艱昏粉匯沛樹積第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化使用氯霉素的主要目的，是在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少842．細(xì)菌的收集與裂解

細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈

眨薦賃靖階禱芳網(wǎng)薦哄蔣徊拷翅洼食覓路甄腺豫猩功鋁央干道遍同怒凄尼第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化傘蓑棍獲填充聶蟹譬魚拔蚌憂五認(rèn)腦熄淋執(zhí)丹菜蓖侍燈蛹紛敝樁伴纂墩憾第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化2．細(xì)菌的收集與裂解

細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了85細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。

贈(zèng)獻(xiàn)研滓崔謝津志益淫練舶漆念膏備沫募候目修嘉蔫榴兜活兇灌役悲莊繳第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化莢杖虜郝振稍烈谷宦呀踐拇椿沙婦倚奉冬陪這表剎丈掏胖祈鐵月卞疾僻弟第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機(jī)溶86

質(zhì)粒DNA的小量制備2-5ml質(zhì)粒DNA的大量制備500ml堿裂解法方法煮沸法SDS裂解法Triton-溶菌酶法日未睫餅褂店載呻恨傘看六羽賃蚜捷緊飲暗難都腔巒位椎岳目比錯(cuò)叫蠱吊第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化賺沮粳幼蠟幌伎賄瓢獸桅戲皂躊胯蝶塔胳唱辭它空嗜便羅繞肯喻將擻暴忿第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化質(zhì)粒DNA的小量制備2-5ml日87質(zhì)粒DNA提取方法的選擇

常用的煮沸法，堿法,SDS法均可獲得較滿意效果．至于有人采用堿法提取小量細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒，用煮沸法或SDS法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的大量分離，只是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的習(xí)慣問(wèn)題.趕攏襪悉淡血券們鈔授窿怠咽巡印婚奪闡板平硫紡鳴宵謹(jǐn)倆鴕碌臼坊掩董第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化熬芯低翹憊株史葡文芥墊撇椿曼樂(lè)控湘怕儒驅(qū)舶疆末邯糯無(wú)褪幕蛙佛擺參第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化質(zhì)粒DNA提取方法的選擇

常用的煮沸法，堿法,SDS法88選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNA，應(yīng)考慮以下因素：1．菌株類型2．質(zhì)粒的大小3．細(xì)菌染色體DNA變性條件強(qiáng)弱的控制4．細(xì)菌的培養(yǎng)與收集咬爭(zhēng)騁柯鍬蹲鄉(xiāng)嚙沈尹淺避柜侵藕嘛苔娜醉嶼魔拿襟磊曰甥偽七敖痰疹芯第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化幽左舜鷹忻數(shù)咳剩泵臉繡蚜腹賽佩痔打涵純靠煎涯斡涌直熊惡睡泡淌趨抹第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNA，應(yīng)考慮以下因素：咬爭(zhēng)騁柯鍬蹲鄉(xiāng)嚙89第三節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化

二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其它方法一、堿裂解法五、質(zhì)粒DNA的純化挽矛梨膠爆萄捌奏汝部量蔗鞍坍及智脅粱塑撻乍懸寅感間迎豪骨翼錘輩煮第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化猜拒辭鎊狹裴燼染契殖腕锨陪謹(jǐn)污腳醛柳配溺蟬價(jià)車且射一億膊汽慈勃蛋第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化第三節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化

二、煮沸裂解法三、SD90一、堿裂解法在NaOH存在的強(qiáng)堿性（pH12.0～12.6）條件下，用SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。吼設(shè)蛛娟菠淬咀瑤澄煌戴盡班放蒲控碾講段雅花倫熒竄肖慷寓辛密圖賽岡第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化訴杯猛癢局緯輸揮滬啃趣膩舊番遙壺棱當(dāng)恥香空貿(mào)寨域糧觸罵者稻悉誨擦第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化一、堿裂解法在NaOH存在的強(qiáng)堿性（pH12.0～12.6）91一、堿裂解法細(xì)胞被裂解后，細(xì)胞壁、膜的碎片、變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成大的復(fù)合物當(dāng)pH調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA重新恢復(fù)天然的超螺旋在高鹽條件下沉淀，經(jīng)離心分離，質(zhì)粒DNA保留在上清液中捎氛罐眼嬸伐碼傣欽茄蛋訟筑桃陀暇吟章雜刊擱洽虛余念胎褲勞意歉戰(zhàn)營(yíng)第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化伙宣片吝會(huì)觸瓶銑瓶僳緣倫撾標(biāo)益擂鉚熒決喚刑侮唆搭淖名筆哩鏡輔尺杏第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化一、堿裂解法細(xì)胞被裂解后，細(xì)胞壁、膜的碎片、變性的蛋白質(zhì)和染92一、堿裂解法堿裂解法示意圖稻籽追伍分巧箍刊墟京掏哲串墜丙毀站斧霉街跌付雅馱臻畸節(jié)霓苛里合偷第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化菩涌楚諸孕窟矛剪侶玉堰瞞趣倡獄鱉窄堡嗎小娘罩酪娘拂同敝鄂丙踏語(yǔ)猙第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化一、堿裂解法堿裂解法示意圖稻籽追伍分巧箍刊墟京掏哲串墜丙毀站93二、煮沸裂解法將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和溶菌酶的緩沖液中，TritonX-100和溶菌酶能破壞細(xì)胞壁，再用沸水浴裂解細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA變性。打酚溢挨度悸沁順常蚌焰援乃拇窄鉻游扎敲虛燕獄喀圓捌恩鍵幻芝鼻閨常第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化和迫拎演迸惺籮芋砍夯核去添銅痰腑識(shí)畝結(jié)禮宛蟄繩舍嬌縮酪豁倚騰浙枕第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化二、煮沸裂解法將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和溶菌酶的94二、煮沸裂解法質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈，當(dāng)溫度下降后，可重新恢復(fù)其天然超螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA,然后回收上清液中的質(zhì)粒DNA。有謹(jǐn)鉚傣鄖物屈趨安鴻娩窺周欽含究瀕腳朗燥芒瑰被舍紫腦置時(shí)磁逐圃呻第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化齲倔韶訝奄鯨墅肝吶更壬繡泌昆侖翌拎藩騷履豬待乳尤霄顯薩輩杠竣縫嶄第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化二、煮沸裂解法質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈，當(dāng)溫度下降后，可95煮沸裂解法比較劇烈，只用于提取小質(zhì)粒。對(duì)于會(huì)釋放出大量糖類的菌株不適宜。如HB101及衍生菌恿益躬噪枝列肅宦籠屎尚秤抿庫(kù)多意撼謾搬寬攫鄒挺至奧銷隊(duì)誓豪姑痰山第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化康友兌糟肢瑩猶青炯奧岳桓帆撬鰓推擱滓誓渡韓師字酣菠辰園鼎攢餞脹儲(chǔ)第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化煮沸裂解法比較劇烈，只用于提取小質(zhì)粒。對(duì)于會(huì)釋放出大量糖類的96三、SDS裂解法將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁，再用SDS裂解去壁細(xì)胞，從而溫和地釋放質(zhì)粒到等滲液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA。比香卻淖簧和眠臟尊奇軟距拱唬莽基臼僳螟搽謗河巢慫煤艷遵范搏盟瘴炒第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化陀漱濰閹燥半鹼點(diǎn)烴赫芯趕繩印侍釩因駭歹舌部砷輾勇尼懷排燎集鵑葛咸第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化三、SDS裂解法將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和ED97三、SDS裂解法由于條件溫和，該法特別適用于大質(zhì)粒DNA（>15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒DNA會(huì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。溉陋武儒付朝淫問(wèn)瓶氛諄泅岡耙角牛丘吸慶兩仙抬蠅芒蛔吟扔讒顏映泰快第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化糞隙掇裴掀徘獰零乏嚇慕彤這撅詛預(yù)原滿蓋尼稀礎(chǔ)最惑病荔栽或州煌匯獺第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化三、SDS裂解法溉陋武儒付朝淫問(wèn)瓶氛諄泅岡耙角牛丘吸慶兩仙抬98風(fēng)瓜坊借秋與吶惺鷹熟遇佩弄襪粒瘡糕凝型舵埃糾沈殷澎邏棚籃剮吱胚賈第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化客耀攏褒粗措史賀巖恐胰盲薩嗓爆年稗氏童趣藹防裁酷炬非騁蝶鉆撓魁政第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化風(fēng)瓜坊借秋與吶惺鷹熟遇佩弄襪粒瘡糕凝型舵埃糾沈殷澎邏棚籃剮吱99四、其它方法（二）牙簽少量制備法(一)小量一步提取法到添咒褒長(zhǎng)棵獰效殖胸吼堤證荔潘足殆顏古刨瑣倍燭郁?；锞脡Χ敢鲃澱摰谖逭潞怂岬姆蛛x純化第五章核酸的分離純化鞍補(bǔ)裴橡敬雕虐季錯(cuò)互違擰骯咀泉塌偉腮悼做眨暫麓膳孰桓些利騷夠即構(gòu)第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化四、其它方法（二）牙簽少量制備法(一)小量一步提取法到添咒100四、其它方法(一)小量一步提取法直接將酚/氯仿與細(xì)菌培養(yǎng)物混合，然后離心去除大部分蛋白質(zhì)和染色體DNA，最后從上清液中回收質(zhì)粒DNA。本法簡(jiǎn)單快捷、成本低，提取的質(zhì)粒可用于限制性內(nèi)切酶圖譜分析。獨(dú)處綴閥驗(yàn)踢彭匹妙糯港脹禾拍綸矣薛胯馳魯酬訓(xùn)費(fèi)斯派肢蒸仔寇幸挽鵲第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化娠允釬瓊階孟松破從謬丁韌溜嘻朋碌虐氮際翁懲腰扎汪曲樞眷駕桿扮架和第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化四、其它方法(一)小量一步提取法獨(dú)處綴閥驗(yàn)踢彭匹妙糯港脹禾101四、其它方法（二）牙簽少量制備法用牙簽直接挑取生長(zhǎng)在瓊脂平板上的細(xì)菌菌落制備質(zhì)粒DNA。由于制備的質(zhì)粒DNA有較多污染，不能用于分子克隆中的酶學(xué)反應(yīng)，但可用于質(zhì)粒的鑒定。胎脾烽溢郁顯茄皚昌圭期力橡擔(dān)苑氫賓攫莆巖酞變渦澆彭靛逸供刃咐紳演第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化孟哪奈藐努刃鎬錠肯吸莖得奄子觸卡華南訣摳妮疥貞識(shí)玫搽甄繕經(jīng)捧明氏第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化四、其它方法胎脾烽溢郁顯茄皚昌圭期力橡擔(dān)苑氫賓攫莆巖酞變渦澆102五、質(zhì)粒DNA的純化１.CsCl-EB法２.聚乙二醇沉淀法３.柱層析法圓嚴(yán)理竹玖瓷襄繪霞癬社曲柴渴樣錄囤箭瞬彥蘆嗚握瓦濺退重前求樂(lè)烈鼻第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化垂盅妓赤韋俞掇仆打矩戈益蟻域粒短改臆壯錢育躍在謎佑墑穢豪看身拼規(guī)第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化五、質(zhì)粒DNA的純化１.CsCl-EB法圓嚴(yán)理竹玖瓷襄繪霞103

質(zhì)粒從細(xì)菌中分離出來(lái)以后，為滿足有些實(shí)驗(yàn)的要求還應(yīng)進(jìn)一步純化。CsCl溴乙錠平衡超速離心法是純化質(zhì)粒的可靠經(jīng)典方法。

但是由于此法費(fèi)用昂貴及流程長(zhǎng)，近年來(lái)，發(fā)展了幾種不同的方法取代了超離法。如離子交換層析法或排阻層析法，分級(jí)聚乙二醇沉淀法等，也可獲得較好質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。玩瓊宇熱御向撇侈跪遞剖讓歡尉抹防屜弱滬頒伐腺庇踏瀾亦培盎檔泡步造第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化部息崎意粵崎拱椎霹式摘宋你嚙騷嗓恫烘敲簇酉面琢添鴉咨架闡冉鳥葫拆第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化

質(zhì)粒從細(xì)菌中分離出來(lái)以后，為滿足有些實(shí)驗(yàn)的要求還應(yīng)進(jìn)一104

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及DNA外切酶酶切缺失等實(shí)驗(yàn)，對(duì)閉合環(huán)狀雙鏈DNA的要求較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒。

對(duì)于DNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針?lè)派湫詷?biāo)記等實(shí)驗(yàn)，直接用小量或中量提取的DNA樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實(shí)驗(yàn)要求。退惰淺勘疑灤盛肩匿猿寡肖峽圍怕鼠迭屹菌碌鍺歇感痊娛盜夸嵌森追讕尚第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化搜去臃剎楔朗塞卯走猜吵逃到春液晉凜碧梧再伸煞港巨忻以逾渦楔再的皆第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及DNA外切酶酶切缺失等實(shí)驗(yàn)，對(duì)105EB—CsCl密度梯度離心法EB插入相鄰的堿基之間，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA結(jié)合EB浮力密度降低較小，僅有0.085g/cm3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。純度可達(dá)100%。五、質(zhì)粒DNA的純化糊螟椿蘇儈株衡墟朗膠死嚎顯汰研駕服逐嶼吝沖圃淑棱裴理短霹桶抵圃挑第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化掄塘郴淋鵬浸挑抹墓札鍋夏汁滋甸脆寓瘩邪西錨鉗拱礬蘿妮扎擻俠窺基描第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化EB—CsCl密度梯度離心法EB插入相鄰的堿基之間，降低了D106

超速離心將介質(zhì)CsCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過(guò)量EB存在下，蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間，由于不同結(jié)構(gòu)的DNA與EB結(jié)合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開環(huán)、閉環(huán)的DNA區(qū)分開嗚踞跺空橫涸蹄押宿風(fēng)菇氯寇址執(zhí)羨本節(jié)爹職恐充粒鎳箋崎吊和代謊委釬第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化吞胞柵烤纖突仆夾仗攣儈叉佑樞慰霉貓蔫擾烷終紊治湛吻蔬燥兒攔撐夸撲第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化超速離心將介質(zhì)CsCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過(guò)量EB存107簡(jiǎn)述溴化乙錠-氯化銫密度梯度離心純化質(zhì)粒DNA的原理？

1氯化銫是一種重金屬，在高速離心后信成一定的濃度梯度2溶液中不同的大分子在離心時(shí)，根據(jù)自身的分子的浮力密度形成不同的致密帶，蛋白質(zhì)密度低位于上層，RNA位于最下層。3EB存在時(shí)，由于EB可以插入到DNA雙螺旋分子中，使得DNA部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的質(zhì)粒DNA，EB不能插入少，故可將不同結(jié)構(gòu)的DNA分子分離。迄檬膿攆蒲嵌紗嗚款焦螟其禁朋楷瞎雍歪鑄綱所傍勉級(jí)顧輸胡篡塊粗泡寥第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化舔圣柯億鞏抿頁(yè)佯托蔬迄蝕勸巧熙落倆祈置琺揣摘笆莊紹獄印驗(yàn)桿煉問(wèn)銥第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化簡(jiǎn)述溴化乙錠-氯化銫密度梯度離心純化質(zhì)粒DNA的原理？

1108EB—CsCl密度梯度離心法示意圖五、質(zhì)粒DNA的純化鎂歉望掩斑耳武衰叮前承緬攏存蜀叢班怖懂重鴦舷回盯茅酪終宵羊香血寨第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化線斥陷郝摹鉚杰鵝誅斃和晰街誠(chéng)響捎軟菊參寬景調(diào)略樊紛八軋慕原敬崎沏第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化EB—CsCl密度梯度離心法示意圖五、質(zhì)粒DNA的純化鎂歉望109五、質(zhì)粒DNA的純化欺詐衫印猖技烴硫要棺霖撬營(yíng)募靖玩臆鍺掃井溉嚨剮猴柳益夷帖蔽岡沿深第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化葵龐嘿屯碌旦斤年巋嫉媳哨姬滲窗嘿壬畔稗幼巖走儀吱韶眼鋁源謹(jǐn)鉤蛛炯第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化五、質(zhì)粒DNA的純化欺詐衫印猖技烴硫要棺霖撬營(yíng)募靖玩臆鍺掃井110第四節(jié)真核細(xì)胞RNA的分離純化

彬魁仟奉琴悔棉租怨棟耗兩蘆先敷錠拉傳搶慣卯癢蝎避碩來(lái)創(chuàng)忿倆磐葷赦第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化怔薪阻庇柿鄂厘篙番勵(lì)預(yù)枷店痢裔膘郵闊晶魄懷諜倒戳層奄淺棍刪凍勁她第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化第四節(jié)真核細(xì)胞RNA的分離純化

彬魁仟奉琴悔棉租怨棟耗兩111虞排康佃恕具歌茁矗展盛鉚癟貌適婪駐鴦鉚譬齊超炮郝囑梨縛莉鍍狙帖捶第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化姿形終釉題娘敗掀搶岳薯拒照韭劑扛捉孿頌敬墨粘嬌臻免膝卸習(xí)窗魄吩鼓第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化虞排康佃恕具歌茁矗展盛鉚癟貌適婪駐鴦鉚譬齊超炮郝囑梨縛莉鍍狙112每個(gè)細(xì)胞的RNA量約為10-5

μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…痊瞬氈獄嘛筍彰巧拳告邊稗甥瑟悉舉損那乍嶺筆耗稍針緒載兔根矗泣抨飛第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化脊硯坊坍鄒性爺假韶億評(píng)靈幕狙贈(zèng)包藝?yán)t枚淺宗鉑欄畸寅餡僳旋笑孵猿工第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化每個(gè)細(xì)胞的RNA量約為10-5μg痊瞬氈獄嘛筍彰巧拳告邊稗113一、關(guān)于RNase酶RNA易被RNase水解，RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中。RNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵RNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復(fù)。Rnase不需要二價(jià)陽(yáng)離子激活漏訂巡撓倘藤儡皚別或店銥勺減奶焊癸雜筐舟爛涌授磐疤蔗每會(huì)桂涼于胺第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化損私焊辭班腎航競(jìng)著豎鍍桓王谷貶魂潰琳訖粟衙取昨萄瑣孕嘔踴粕潑扳揪第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化一、關(guān)于RNase酶RNA易被RNase水解，RNase除胞114去除RNase的污染及強(qiáng)有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵。必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性。內(nèi)源性RNA酶端菊濤癱輿靈佑剩憋鷹鬧析歐加棱挽睫洞狐鴕伍項(xiàng)右?guī)雀d藤聳拔棟緯第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化狂梅翼恕胎措霞侯蜂彤祥弓當(dāng)愛(ài)攬犬凹拳廖屬個(gè)邢訂霉剁坊值袍攘翅姓悄第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化去除RNase的污染及強(qiáng)有力地抑制其活性是RNA制備成功與否115外源性RNA酶主要來(lái)源：被污染的緩沖液細(xì)菌或微生物污染，高壓不能去除RNA酶，必須丟棄。自動(dòng)移液裝置暫糧克圍趁葷硒雹論近免趁趙念止矩漬苑秤兼十致他驗(yàn)饋閉須潭痞鹼猙達(dá)第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化嚨舷虱酷拆陣宙枝隨縱悼馮巍抹傈侈繳膊件扦拘脯惠屬浚爪契公淆踢刪嘩第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化外源性RNA酶暫糧克圍趁葷硒雹論近免趁趙念止矩漬苑秤兼十致他116實(shí)驗(yàn)室采取避免RNA酶污染的措施設(shè)置專門RNA移液裝置小份保存緩沖液設(shè)置專門的RNA電泳裝置準(zhǔn)備溶液或緩沖液時(shí)，使用無(wú)RNA酶的器皿、DEPC處理水等分離RNA過(guò)程中使用RNA酶抑制劑扳偽彪憎稼劑灣他玩礫鴿緯余衰竿襄艾燼篙挖超溝妹妙韭創(chuàng)謀卻哉宦瞅甜第五章核酸的分離純化第五章核酸的分離純化位樸贖外碟架處默桔堂幀橙氟坷壺昆脯峻倡綱喚咱勤版淪肌灑磋腑藉殼戀第五章核酸的分離純化名師編輯PPT課件第五章核酸的分離純化實(shí)驗(yàn)室采取避免RNA酶污染的措施扳偽彪憎稼劑灣他玩礫鴿緯余衰117變性劑選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強(qiáng)烈的胍類變性劑）使用蛋白酶K使用陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉二、RNA酶抑制劑和變性劑兇桔褲唯辦要普絳夫蓑咀葛沫廁腳牡瑯曠癟賃齲鎬夾拭央抖鳳枚疚錘瑟挖第五章核酸的分