國內(nèi)外流感病毒蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)進(jìn)展簡述,SCI醫(yī)學(xué)論文

國內(nèi)外流感病毒蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)進(jìn)展簡述,SCI醫(yī)學(xué)論文構(gòu)造生物學(xué)致力于研究生命系統(tǒng)中的大分子及其復(fù)合物的三維原子構(gòu)造細(xì)節(jié)，它所提供的構(gòu)造信息給生物學(xué)帶來了宏大革命，給相應(yīng)的生物學(xué)功能提供了原子水平的分子機(jī)理和愈加深切進(jìn)入可靠的認(rèn)識，讓人們戴上了一副特殊眼鏡來看到生命經(jīng)過。1953年DNA雙螺旋原子模型是其標(biāo)志性成果，其深遠(yuǎn)影響直到今天仍在繼續(xù)。通觀構(gòu)造生物學(xué)的發(fā)展歷程，也是諸多科學(xué)領(lǐng)域穿插融合、科學(xué)家精誠合作的成功典范，物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、計算機(jī)科學(xué)及其他學(xué)科的互相穿插浸透與合作成就了今天的構(gòu)造生物學(xué)，使其不僅停留在學(xué)術(shù)活動層面，而且已經(jīng)成為藥物研究及生物技術(shù)領(lǐng)域的重要基礎(chǔ)。中國構(gòu)造生物學(xué)的發(fā)展歷程能夠回溯到20世紀(jì)70年代對胰島素的晶體學(xué)研究所做的出色工作。隨著構(gòu)造生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，中國構(gòu)造生物學(xué)領(lǐng)域也是蓬勃發(fā)展，在多個生命科學(xué)分支都有精彩工作呈現(xiàn)。近年來，在流感病毒研究領(lǐng)域，更是走在世界前沿。本文將對國內(nèi)外流感病毒蛋白的構(gòu)造生物學(xué)進(jìn)展做個簡述，為各個學(xué)術(shù)領(lǐng)域的同仁們提供一個視野。1、流感病毒簡述。流感病毒屬于正黏病毒科，根據(jù)其核蛋白的抗原性，可分為甲〔A〕、乙〔B〕、丙〔C〕三型，是流行性感冒〔流感〕的病原體。在核蛋白抗原性的基礎(chǔ)上，流感病毒還根據(jù)血凝素HA和神經(jīng)氨酸酶NA的抗原性分為不同的亞型，如H1N1和H3N2,H代表血凝素HA,N代表神經(jīng)氨酸酶NA,數(shù)字代表不同亞型。流感病毒構(gòu)造由外而內(nèi)能夠分為囊膜、基質(zhì)蛋白及核心三部分。流感病毒的遺傳物質(zhì)為單股負(fù)鏈核糖核酸〔ssRNA〕，分節(jié)段組成，與核蛋白NP和RNA聚合酶共同組成了病毒的核心。甲型和乙型流感病毒的遺傳物質(zhì)由8個節(jié)段組成，而丙型流感病毒的遺傳物質(zhì)由7個節(jié)段組成。第1、2、3節(jié)段編碼的是RNA聚合酶，包括PA、PB1和PB2,負(fù)責(zé)病毒遺傳物質(zhì)RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制；第4節(jié)段編碼血凝素蛋白HA,負(fù)責(zé)病毒侵入；第5節(jié)段編碼核蛋白NP,負(fù)責(zé)與遺傳物質(zhì)RNA組裝；第6節(jié)段編碼的是神經(jīng)氨酸酶NA,負(fù)責(zé)病毒釋放；第7節(jié)段編碼基質(zhì)蛋白M1和離子通道蛋白M2,負(fù)責(zé)組成病毒的基質(zhì)蛋白層；第8節(jié)段編碼非構(gòu)造蛋白〔包括NS1和NS2〕，其功能當(dāng)下已經(jīng)知道與RNA出核和拮抗宿主抗病毒反響等有關(guān)。丙型流感病毒缺少第6節(jié)段，其第4節(jié)段編碼的血凝素酯酶融合蛋白HEF,兼具行使病毒侵入和釋放兩種功能。除此之外，陸續(xù)有新的甲型流感病毒蛋白被發(fā)現(xiàn)，如PA-X、PA-N155、PA-N182、PB1-F2、N40、M42,這些蛋白都是上述10個蛋白的轉(zhuǎn)錄水平的不同剪輯形式[1-3].2、流感病毒的囊膜外表蛋白。流感病毒的HA蛋白晶體構(gòu)造于1981年被DonCWiley等美國科學(xué)家所解析，是第一個三維構(gòu)造信息清楚的流感病毒蛋白[4].HA蛋白存在HA0前體形式，成熟后會被蛋白酶從中間切成由二硫鍵相連的HA1和HA2兩個亞基。HA蛋白是病毒外表介入受體結(jié)合、膜融合和病毒侵入宿主細(xì)胞的主要膜蛋白，HA蛋白介導(dǎo)的受體結(jié)合是流感病毒跨種間傳播的主要決定因素之一。X射線晶體構(gòu)造表示清楚，HA單體蛋白在三維構(gòu)造上可分成兩個構(gòu)造域，包括頂端的球形構(gòu)造域和下部的莖部構(gòu)造域〔圖1〕。其受體結(jié)合位點(diǎn)位于頂端的球形構(gòu)造域，為一淺坑狀區(qū)域，區(qū)域周圍主要由3個二級構(gòu)造元件組成，包括130環(huán)、190螺旋和220環(huán)，而底部則由高度保守的4個氨基酸組成，包括98位、153位、183位和195位氨基酸〔ShiY,etal.NatRevMicrobiol,2020,待發(fā)表〕。3個二級構(gòu)造元件上的氨基酸組成情況決定了HA蛋白的受體結(jié)合特性。HA蛋白結(jié)合的受體為唾液酸受體，可分成-2,3和-2,6兩種受體類型〔圖1〕。病毒外表的HA蛋白以同源三聚體形式存在，由莖部構(gòu)造域的螺旋通過疏水互相作用穩(wěn)定三聚體的構(gòu)成。而在低pH值下，莖部構(gòu)造域的螺旋發(fā)生變構(gòu)是導(dǎo)致病毒與宿主細(xì)胞膜互相融合的關(guān)鍵步驟，進(jìn)而實現(xiàn)病毒的入侵[5].在第一個HA蛋白構(gòu)造被解析之后，科學(xué)家們陸續(xù)解析了幾種不同亞型HA蛋白的三維構(gòu)造，發(fā)現(xiàn)整體構(gòu)造類似，盡管不同亞型之間的氨基酸類似性在50%左右。最最近幾年來，HA蛋白的構(gòu)造生物學(xué)研究主要集中在兩個領(lǐng)域，不同亞型HA蛋白與受體互相作用的構(gòu)造基礎(chǔ)和廣譜性中和抗體與HA蛋白互相作用的構(gòu)造基礎(chǔ)，前者說明流感病毒跨種間傳播機(jī)制研究，而后者說明廣譜性中和抗體的中和機(jī)制。流感病毒跨種間傳播機(jī)制研究是流感疫情科學(xué)預(yù)判和科學(xué)防控的理論基礎(chǔ)。中國科學(xué)院高福課題組利用構(gòu)造生物學(xué)技術(shù)和生物物理技術(shù)等手段對H1N1、H5N1、H7N9、H10N8、H13N6和H16N3等流感病毒的受體結(jié)合特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，在跨種間傳播分子機(jī)制研究領(lǐng)域獲得重大突破性進(jìn)展。在國際上，率先說明了H7N9禽流感病毒能夠感染人是由于獲得人源受體結(jié)合能力及其構(gòu)造基礎(chǔ)[6];揭示了HA蛋白上的幾個突變使高致病性H5N1禽流感病毒獲得空氣傳播能力的分子機(jī)制[7].概括地講，禽流感病毒受體結(jié)合特性為禽源受體偏好性，而人流感病毒為人源受體偏好性；禽流感病毒要突破種間屏障感染人必須發(fā)生受體結(jié)合偏好性轉(zhuǎn)變，這種偏好性轉(zhuǎn)變是由病毒外表血凝素蛋白HA受體結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸決定，其關(guān)鍵氨基酸在不同亞型之間存在差異，這一概念的說明對于流感病毒的防控具有重要理論價值。流感病毒外表還有另外一個重要膜蛋白，就是神經(jīng)氨酸酶NA蛋白，在流感病毒侵染末期通過催化宿主細(xì)胞外表唾液酸受體水解以協(xié)助新生病毒顆粒從被感染宿主細(xì)胞外表釋放，以便進(jìn)一步感染其他細(xì)胞，因而，在流感病毒的復(fù)制和傳播經(jīng)過中具有重要作用。NA蛋白在病毒外表是同源四聚體形式，晶體構(gòu)造表示清楚其功能域為一球形構(gòu)造域，主體部分是由多個折疊片組成的螺旋槳式構(gòu)造，酶活性位點(diǎn)就位于螺旋槳的中心。常用的達(dá)菲等抗流感藥物就是基于NA蛋白與唾液酸的復(fù)合物構(gòu)造設(shè)計，為唾液酸類似物。高福課題組長期以來從事流感病毒外表神經(jīng)氨酸酶NA抑制劑對抗流感病毒感染的分子基礎(chǔ)研究，說明了NA抑制劑抑制不同亞型流感病毒時，存在組別特異性，并且對NA蛋白酶活中心周邊的150環(huán)特性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，以及提出共價結(jié)合抑制劑的概念，為新型NA抑制劑的開發(fā)設(shè)計提供了必要的理論指導(dǎo)[8-12].除此之外，國際上也在研究針對NA蛋白的中和性抗體，為抗流感藥物研發(fā)提供了一個新的視角。3、流感病毒的基質(zhì)蛋白及離子通道蛋白。流感病毒的基質(zhì)蛋白M1為多功能蛋白，已經(jīng)知道具有兩個功能：a.幫助病毒遺傳物質(zhì)出核，能夠結(jié)合RNA;b.結(jié)合病毒囊膜，構(gòu)成基質(zhì)蛋白層。當(dāng)下M1蛋白只要N端構(gòu)造，尚無全長構(gòu)造。NMR數(shù)據(jù)表示清楚M1蛋白的C端柔性很大，存在多種構(gòu)象[13].M1蛋白N端的晶體構(gòu)造表示清楚，它具有一塊由帶正電荷氨基酸組成的外表區(qū)域，能夠用于結(jié)合RNA,同時它還具有一塊疏水面，可用于結(jié)合病毒囊膜，而這塊疏水面通過構(gòu)象調(diào)整，既能夠暴露也能被包埋起來。表示出M1蛋白的基因節(jié)段同時也表示出另外一種蛋白M2,它是一類離子通道，也是金剛胺和金剛乙胺等烷胺類抗流感藥物的靶點(diǎn)。大量的生物化學(xué)、生物物理和構(gòu)造生物學(xué)研究表示清楚M2蛋白由N端一段疏水相的跨膜區(qū)螺旋和C端一段親水相的細(xì)胞質(zhì)區(qū)螺旋組成，而跨膜區(qū)螺旋會在細(xì)胞膜中構(gòu)成四聚體形式[14].當(dāng)下多個課題組解析過M2蛋白跨膜區(qū)螺旋三維構(gòu)造以及與烷胺類藥物的復(fù)合物構(gòu)造，其構(gòu)象存在差異不同，這種不一致性可能是由于所截取的蛋白長度以及不同的實驗條件引起的，需要進(jìn)一步驗證。烷胺類抗流感藥物如今市場上已經(jīng)不常用，由于當(dāng)下流行的流感病毒對烷胺類藥物產(chǎn)生了耐藥性。華而不實最流行的突變位點(diǎn)為S31N突變，該突變位點(diǎn)位于四螺旋束的核心通道上，在烷胺類藥物結(jié)合位點(diǎn)的附近，會對烷胺類藥物的結(jié)合產(chǎn)生空間位阻，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥性[14].4、流感病毒復(fù)制相關(guān)蛋白。流感病毒的NP蛋白負(fù)責(zé)與病毒遺傳物質(zhì)RNA結(jié)合，構(gòu)成核糖核蛋白復(fù)合物。NP蛋白同時介入核糖核蛋白復(fù)合物的入核和出核經(jīng)過，以及病毒的復(fù)制。晶體構(gòu)造表示清楚NP蛋白的整體構(gòu)造呈現(xiàn)月牙形，可分成頭部區(qū)和莖部區(qū)兩個構(gòu)造域[15-16].RNA結(jié)合槽在NP蛋白兩個構(gòu)造域之間的外外表上，位于月牙形的內(nèi)環(huán)。NP蛋白莖部區(qū)有一段由12個氨基酸組成的柔性環(huán)能夠緊緊插入另外一個月牙形NP分子外環(huán)面的結(jié)合槽中，構(gòu)成NP多聚體。這個經(jīng)過包含親水和疏水互相作用，尤其重要的是R416和E339介導(dǎo)的強(qiáng)鹽橋互相作用。根據(jù)這個柔性環(huán)能夠設(shè)計小分子類藥物，毀壞NP多聚體的構(gòu)成，進(jìn)而毀壞病毒遺傳物質(zhì)的構(gòu)成，起到抗病毒效果。前面提到過，NP也介入病毒的復(fù)制，其與流感病毒聚合酶的互相作用分子基礎(chǔ)，當(dāng)下還不是很清楚明晰，需要進(jìn)一步的探尋求索。解析流感病毒聚合酶復(fù)合物的三維構(gòu)造對于我們了解流感病毒復(fù)制機(jī)制具有重要科學(xué)意義，而且對開發(fā)抗流感藥物具有重要理論價值。中國科學(xué)院饒子和院士與劉迎芳研究員領(lǐng)銜的聯(lián)合研究組在這一領(lǐng)域獲得了突破性進(jìn)展〔圖2〕，他們在國際上率先揭示了聚合酶關(guān)鍵部分PA亞基的功能和構(gòu)造基礎(chǔ)，解析了PA亞基的羧基端與PB1亞基氨基端多肽的復(fù)合物晶體構(gòu)造，發(fā)現(xiàn)多肽上的殘基組合對于兩者結(jié)合特別重要，而且PA亞基上負(fù)責(zé)與PB1結(jié)合的氨基酸殘基在流感病毒中高度保守，并且集中在蛋白分子中很小的區(qū)域[17];緊接著他們解析了PA亞基的氨基端構(gòu)造，通過構(gòu)造預(yù)測并證實其具有內(nèi)切酶活性[18];隨后，他們解析了PA亞基內(nèi)切酶構(gòu)造域與底物單磷酸核苷的復(fù)合物構(gòu)造[19],這些成果為研究流感病毒的復(fù)制機(jī)制和設(shè)計抗流感藥物提供了真實有用的模型。除此之外，高福課題組近期解析了蝙蝠來源流感樣病毒的PA亞基的N端構(gòu)造，結(jié)果表示清楚其構(gòu)造與經(jīng)典甲型流感病毒很類似，同時證明其具有內(nèi)切酶活性，固然如今并沒有從蝙蝠中分離出活病毒，但是得警覺蝙蝠流感樣病毒基因組會與經(jīng)典甲型流感病毒發(fā)生重組進(jìn)而產(chǎn)生新型病毒[20].除此之外，中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院劉勁松在國外工作期間解析了流感病毒NS1蛋白RNA結(jié)合域的高精度三維晶體構(gòu)造，回國后也在繼續(xù)相關(guān)工作[21].5、結(jié)束語。新的流感病毒蛋白不斷被發(fā)現(xiàn)，如PA-X等[2],同時，部分已經(jīng)知道流感病毒蛋白缺乏高精度三維構(gòu)造信息，如完好聚合酶復(fù)合物〔PA/PB1/PB2〕和全長NS2蛋白等，流感病毒的構(gòu)造生物學(xué)研究將要在將來幾年面臨新的挑戰(zhàn)，等待越來越多的中國構(gòu)造生物學(xué)家能夠加盟該領(lǐng)域。以下為以下為參考文獻(xiàn)：[1]MuramotoY,NodaT,KawakamiE,etal.IdentificationofnovelinfluenzaAvirusproteinstranslatedfromPAmRNA.JVirol,2020,87〔5〕：2455-2462.[2]JaggerBW,WiseHM,KashJC,etal.Anoverlappingprotein-codingregionininfluenzaAvirussegment3modulatesthehostresponse.Science,2020,337〔6091〕：199-204.[3]WiseHM,FoegleinA,SunJ,etal.Acomplicatedmessage:IdentificationofanovelPB1-relatedproteintranslatedfrominfluenzaAvirussegment2mRNA.JVirol,2018,83〔16〕：8021-8031.[4]WilsonIA,SkehelJJ,WileyDC.Structureofthehaemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavirusat3Aresolution.Nature,1981,289〔5796〕：366-373.[5]WileyDC,SkehelJJ.Thestructureandfunctionofthehemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavirus.AnnuRevBiochem,1987,56:365-394.[6]ShiY,ZhangW,WangF,etal.Structuresandreceptorbindingofhemagglutininsfromhuman-infectingH7N9influenzaviruses.Science,2020,342〔6155〕：243-247.[7]ZhangW,ShiY,LuX,etal.AnairbornetransmissibleavianinfluenzaH5hemagglutininseenattheatomiclevel.Science,2020,340〔6139〕：1463-1467.[8]LiQ,QiJ,ZhangW,etal.The2018pandemicH1N1neuraminidaseN1lacksthe150-cavityinitsactivesite.NatStructMolBiol,2018,17〔10〕：1266-1268.[9]VavrickaCJ,LiQ,WuY,etal.StructuralandfunctionalanalysisoflaninamiviranditsoctanoateprodrugrevealsgroupspecificmechanismsforinfluenzaNAinhibition.PLoSPathogens,2018,7〔10〕：e1002249.[10]LiQ,SunX,LiZ,etal.Structuralandfunctionalcharacterizationofneuraminidase-likemoleculeN10derivedfrombatinfluenzaAvirus.ProcNatlAcadSciUSA,2020,109〔46〕：18897-18902.[11]VavrickaCJ,LiuY,KiyotaH,etal.Influenzaneuraminidaseoperatesviaanucleophilicmechanismandcanbetargetedbycovalentinhibitors.NatCommun,2020,4:1491.[12]WuY,BiY,VavrickaCJ,etal.Characterizationoftwodistinctneuraminidasesfromavian-originhuman-infectingH7N9influenzaviruses.CellRes,2020,23〔12〕：1347-1355.[13]ShishkovA,BogachevaE,FedorovaN,etal.SpatialstructurepeculiaritiesofinfluenzaAvirusmatrixM1proteininanacidicsolutionthatsimulatestheinternallysosomalmedium.FEBSJ,2018,278〔24〕：4905-4916.[14]DasK,AraminiJM,MaLC,etal.StructuresofinfluenzaAproteinsandinsightsintoantiviraldrugtargets.NatStructMolBiol,2018,17〔5〕：530-538.[15]YeQ,KrugRM,TaoYJ.ThemechanismbywhichinfluenzaAvirusnucleoproteinformsoligomersandbindsRNA.Nature,2006,444〔7122〕：1078-1082.[16]NgAK,ZhangH,TanK,etal.StructureoftheinfluenzavirusAH5N1nucleoprotein:implicationsforRNAbinding,oligomerization,andvaccinedesign.FASEBJ,2008,22〔10〕：3638-3647.[17]HeX,ZhouJ,BartlamM,etal.CrystalstructureofthepolymerasePA〔C〕-PB1〔N〕complexfromanavian