酶促反應(yīng)進(jìn)程定時(shí)法三課件

第二十三章臨床酶學(xué)檢驗(yàn)的原理和方法第二十三章臨床酶學(xué)檢驗(yàn)的原理和方法1臨床酶學(xué)檢驗(yàn)基本特點(diǎn)基本方法1、項(xiàng)目多，應(yīng)用廣2、含量少，難度大3、高靈敏度4、高特異度1、活性測(cè)定法2、質(zhì)量測(cè)定法臨床酶學(xué)檢驗(yàn)基本特點(diǎn)基本方法1、項(xiàng)目多，應(yīng)用廣1、活性測(cè)定法2第一節(jié)酶活性測(cè)定的理論基礎(chǔ)一、酶促反應(yīng)進(jìn)程二、定時(shí)法三、連續(xù)檢測(cè)法第一節(jié)酶活性測(cè)定的理論基礎(chǔ)一、酶促反應(yīng)進(jìn)程3米-曼方程最大反應(yīng)速率底物濃度米氏常數(shù)反應(yīng)速度一、酶促反應(yīng)進(jìn)程K1K2E+SESE+PK-1酶底物酶-底物復(fù)合物酶產(chǎn)物

Vmax［S］V0=Km+［S］米-曼方程最大反應(yīng)速率底物濃度米氏常數(shù)反應(yīng)速度一、酶促反應(yīng)進(jìn)4（一）Km

Km是酶的特征性常數(shù)之一。若v=0.5Vmax，則Km=[S]，可見Km值等于酶促反應(yīng)的初速率為最大速率Vmax一半時(shí)的底物濃度。Km只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無(wú)關(guān)。1．1／Km可近似地表示酶對(duì)底物的親和力的大小，Km值越小，表示酶與底物的親和力越大，反之亦然。2．如果一個(gè)酶有幾種底物，則對(duì)每一種底物各有一個(gè)特定的Km值，其中Km值最小的底物大都是該酶的最適底物或天然底物。（一）Km5

3．如已知酶的Km，可計(jì)算某一底物濃度時(shí)反應(yīng)速率v和最大速率Vmax的比值，并可推知酶的活性中心被底物飽和的分?jǐn)?shù)。同樣，如要求v和Vmax有一定的百分比，也可算出所需底物濃度為其Km的多少倍4．利用工具酶來(lái)測(cè)定體液中某一成分的濃度或某一酶的催化活性濃度時(shí)，可根據(jù)米-曼方程或其衍變方程式來(lái)計(jì)算工具酶的用量。5．測(cè)定Km值可鑒別不同來(lái)源但催化相同反應(yīng)的酶是同一種酶或是同工酶。

6．如一個(gè)酶催化正逆兩個(gè)方向，測(cè)定正逆兩個(gè)方向底物的Km及底物濃度，可大體推測(cè)該酶在體內(nèi)催化反應(yīng)的方向及其催化效率。7．在代謝酶系中，當(dāng)一組酶催化連續(xù)的代謝反應(yīng)時(shí)，如已知各酶的Km及其相應(yīng)底物的濃度，有助于尋找代謝的限速步驟。一般Km值最大的酶所催化的反應(yīng)為該酶系的限速步驟。3．如已知酶的Km，可計(jì)算某一底物濃度時(shí)反應(yīng)速率v和最大速6（二）VmaxVmax表示在一定酶量下的最大反應(yīng)速率，即酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度呈正比。在酶的濃度不變時(shí)，對(duì)于特定底物而言，Vmax也是一個(gè)常數(shù)。（二）Vmax7零級(jí)一級(jí)[P][S]V＝dpdt時(shí)間延滯期線性期非線性期酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線零級(jí)一級(jí)[P][S]V＝dpdt時(shí)間延滯期線性期非線性期酶8（一）延滯期延滯期（lagphase）是指反應(yīng)初開始的一段時(shí)間，可以是幾秒至幾分鐘。此時(shí)[S]不斷下降，隨之有相應(yīng)[P]產(chǎn)生。由于多種因素的影響，該其酶促反應(yīng)速率比較慢。1、單一酶促反應(yīng)的延滯期：是指酶促反應(yīng)開始到達(dá)最大反應(yīng)速率所需要的時(shí)間。2、酶偶聯(lián)反應(yīng)的延滯期（一）延滯期延滯期（lagphase）是指反應(yīng)初開始的9（二）線性期延滯期后，在過量底物存在的條件下，酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率并保持相對(duì)恒定的一段時(shí)期，該期在時(shí)間進(jìn)程曲線中呈直線或接近直線狀態(tài)，稱為線性期(linearphase)。因底物量足夠，在線性期酶促反應(yīng)速率不受底物濃度的影響，產(chǎn)物[P]和底物[S]變化與時(shí)間t成直線關(guān)系，因此該期的酶促反應(yīng)速率能反映酶活性的大小。（二）線性期10（三）非線性期非線性期又稱底物耗盡期，是指線性期后反應(yīng)速度明顯下降，酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線偏離直線的一段時(shí)期。根據(jù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線中線性期的反應(yīng)速度才能準(zhǔn)確計(jì)算出酶活性濃度，因此，不論哪種酶活性濃度測(cè)定方法，都應(yīng)該盡量保證在酶促反應(yīng)進(jìn)程的線性期進(jìn)行檢測(cè)，否則將導(dǎo)致誤差。在延滯期、非線性反應(yīng)期所測(cè)得的結(jié)果往往不準(zhǔn)確。（三）非線性期根據(jù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線中線性期的反應(yīng)速度才能準(zhǔn)確11酶促反應(yīng)進(jìn)程定時(shí)法三課件12 二、定時(shí)法為了計(jì)算酶活性濃度，必須根據(jù)線性反應(yīng)期（零級(jí)反應(yīng)期）的反應(yīng)速率才能準(zhǔn)確計(jì)算出酶活性濃度，否則將導(dǎo)致誤差。酶活性濃度測(cè)定就是要使酶促反應(yīng)的初速度達(dá)到Vmax，即在過量底物存在下的零級(jí)反應(yīng)期的V，此時(shí)V與[E]之間有線性關(guān)系。 二、定時(shí)法為了計(jì)算酶活性濃度，必須根據(jù)線性反應(yīng)期（13酶活性濃度測(cè)定方法①量氣法其原理是通過測(cè)量一封閉反應(yīng)系統(tǒng)中氣體變化后的氣體體積或壓力，從而計(jì)算出氣體的變化量適用于測(cè)定在反應(yīng)中產(chǎn)生或消耗氣體的酶②分光光度法酶促反應(yīng)的底物與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同，光吸收譜也有差異，不僅能在可見光范圍測(cè)定有色溶液的濃度，還能在紫外光波長(zhǎng)范圍測(cè)定特異的帶有雙鍵或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的無(wú)色物質(zhì)③熒光法和放射性核素法通過熒光光度計(jì)測(cè)定酶促反應(yīng)生成熒光物質(zhì)的速率，此速率與酶濃度成正比④其它方法

1.按監(jiān)測(cè)方法分類2.按反應(yīng)時(shí)間分類(1)定時(shí)法（取樣法、終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法）(2)連續(xù)監(jiān)測(cè)法（動(dòng)力學(xué)法、速率法）酶活性濃度測(cè)定方法①量氣法其原理是通過測(cè)量一封閉反應(yīng)系統(tǒng)中氣14定時(shí)法（取樣法、終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法）定時(shí)法:早期測(cè)定酶活性濃度的方法，大多是使酶作用一段時(shí)間，然后加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應(yīng)，測(cè)定這段時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算酶促反應(yīng)的平均速度。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，測(cè)定時(shí)酶促反應(yīng)已被終止，故比色計(jì)或分光光度計(jì)無(wú)需保溫設(shè)備，顯色劑的選擇不考慮對(duì)酶活性的影響。（一）定時(shí)法的特點(diǎn)定時(shí)法（取樣法、終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法）定時(shí)法:早期測(cè)定酶活性濃度的15缺點(diǎn)：難以確定選定的反應(yīng)時(shí)間是否處于線性期反應(yīng)1反應(yīng)3反應(yīng)2定時(shí)法中可能引起的誤差缺點(diǎn)：難以確定選定的反應(yīng)時(shí)間是否處于線性期反應(yīng)1反應(yīng)3反應(yīng)216注意事項(xiàng)①用定時(shí)法測(cè)定酶活性濃度，必須了解不同酶促反應(yīng)速率和時(shí)間的關(guān)系，②應(yīng)先做預(yù)試驗(yàn)找出酶促反應(yīng)速率恒定的時(shí)期，確定線性時(shí)間，然后在這段時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，③避開延滯期和一級(jí)反應(yīng)。

在實(shí)際工作中，延滯期很難確定，而且一般很短，對(duì)酶活性測(cè)定產(chǎn)生的影響不大。但非線性期的影響不容忽視，隨著保溫時(shí)間的延續(xù)，酶變性失活加速，逆反應(yīng)加強(qiáng)，對(duì)活性測(cè)定產(chǎn)生的影響非常明顯。注意事項(xiàng)在實(shí)際工作中，延滯期很難確定，而且一般很短，對(duì)酶活性17（二）酶活性的計(jì)算根據(jù)測(cè)定方法的不同，可以利用標(biāo)準(zhǔn)比較法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法或吸光系數(shù)法計(jì)算出酶活性濃度單位。酶活性國(guó)際單位定義為每升樣品中每分鐘生成1μmol為1U/L（二）酶活性的計(jì)算根據(jù)測(cè)定方法的不同，可以利用標(biāo)18三、連續(xù)監(jiān)測(cè)法（動(dòng)力學(xué)法、速率法）

即指連續(xù)測(cè)定酶促反應(yīng)過程中某一產(chǎn)物或底物濃度隨時(shí)間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶促反應(yīng)初速度，間接計(jì)算出酶活性濃度的方法。其是臨床測(cè)定酶活性濃度最常用方法。三、連續(xù)監(jiān)測(cè)法（動(dòng)力學(xué)法、速率法）即指連續(xù)測(cè)定酶促反應(yīng)19（一）連續(xù)監(jiān)測(cè)法的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：連續(xù)觀測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，容易找到直線區(qū)域，選擇線性反應(yīng)期來(lái)計(jì)算酶活性，不需終止反應(yīng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，標(biāo)本和試劑用量少，可在短時(shí)間內(nèi)完成測(cè)定。缺點(diǎn)：連續(xù)監(jiān)測(cè)法在特定條件下進(jìn)行，要求足夠的底物濃度和精確控制溫度、PH等反應(yīng)條件，對(duì)儀器要求較高，需要具有恒溫裝置和連續(xù)記錄吸光度裝置。①自動(dòng)生化分析儀能自動(dòng)獲取規(guī)定時(shí)間內(nèi)的信號(hào)，自動(dòng)判斷非線性度，所以連續(xù)監(jiān)測(cè)法更適合于自動(dòng)化儀器。②目前已取代固定時(shí)間法而成為臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)定酶活性濃度最常用的方法。（一）連續(xù)監(jiān)測(cè)法的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：連續(xù)觀測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，容易找到直線區(qū)20（二）酶活性的計(jì)算用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行酶活性測(cè)定時(shí)，根據(jù)摩爾吸收系數(shù)可以進(jìn)行酶活性濃度的計(jì)算。（二）酶活性的計(jì)算用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行酶活性測(cè)定時(shí)，根據(jù)摩爾吸收21連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)酶活性濃度時(shí)，使用摩爾消光系數(shù)（ε）。其定義為：特定條件下，一定波長(zhǎng)的光，光徑為1.0cm時(shí)，通過所含吸光物質(zhì)的濃度為1.00mol/L時(shí)的吸光度。目前實(shí)驗(yàn)室常用的計(jì)算方式連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化（ΔA/min）U/L＝ΔAmin×V×106ε×v×LΔA—吸光度變化106—把mol換算成μmolv—樣品量（ml）L—比色杯光徑（cm）V—反應(yīng)體系體積（ml）ε—摩爾消光系數(shù)（cm2·mol-1）連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)酶活性濃度時(shí)，使用摩爾消光系數(shù)（ε）。其定義為22自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定同一酶，條件固定時(shí)，從理論上講V，v和L均為固定值，ε為常數(shù)，則可將公式簡(jiǎn)寫為：

U/L＝ΔAmin×KV×106ε×v×LK=

K為酶活性濃度定量系數(shù)

主要用于臨床酶活性測(cè)定的計(jì)算與校正

K值設(shè)置應(yīng)考慮酶的參考值上限及測(cè)定時(shí)間兩方面。

自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定同一酶，條件固定時(shí)，從理論上講V，v和23（三）連續(xù)監(jiān)測(cè)法的方法類型1.直接連續(xù)監(jiān)測(cè)法是在不終止酶促反應(yīng)條件下，直接通過測(cè)定反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物某些理化性質(zhì)的變化（如：A、熒光、旋光性，pH、電導(dǎo)率、粘度等），從而計(jì)算出酶活性濃度。評(píng)價(jià)：方法簡(jiǎn)單，但只有底物與產(chǎn)物之間，在理化性質(zhì)方面有顯著性差異時(shí)，才能使用直接法，只有很少一部分酶能用直接法測(cè)定。根據(jù)檢測(cè)物質(zhì)是否為待測(cè)酶的底物或產(chǎn)物，可將連續(xù)監(jiān)測(cè)法分為：直接連續(xù)監(jiān)測(cè)法和間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法。（三）連續(xù)監(jiān)測(cè)法的方法類型1.直接連續(xù)監(jiān)測(cè)法是在不終止酶促反242.間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法（1）一步間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法在原反應(yīng)體系中加入一些試劑，其只和反應(yīng)產(chǎn)物迅速作用，產(chǎn)生可被檢出的物質(zhì)，但該試劑不和酶反應(yīng)，也不影響酶的活性。SPE+試劑可被檢出的物質(zhì)（2）酶偶聯(lián)法目前應(yīng)用最多，即在原反應(yīng)體系中加入另一些酶試劑，所進(jìn)行的酶促反應(yīng)和被測(cè)酶的酶促反應(yīng)偶聯(lián)起來(lái)，最后的反應(yīng)產(chǎn)物可直接監(jiān)測(cè)，進(jìn)而推測(cè)出第一個(gè)酶的活性濃度。2.間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法（1）一步間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法在原反應(yīng)體系25反應(yīng)模式ABPExEi被測(cè)酶被測(cè)酶始發(fā)反應(yīng)始發(fā)反應(yīng)指示反應(yīng)指示酶指示反應(yīng)指示酶ABCPExEaEi輔助酶輔助反應(yīng)酶偶聯(lián)體系輔助酶輔助反應(yīng)酶偶聯(lián)反應(yīng)反應(yīng)模式ABPEx26酶偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)相

酶偶聯(lián)反應(yīng)一開始不能反映酶活性，在反應(yīng)中存在幾個(gè)時(shí)相。以臨床常規(guī)酶學(xué)分析中常見的ALT的檢測(cè)為例，在該酶偶聯(lián)體系中的指示酶為脫氫酶，反應(yīng)原理如下：L-丙氨酸＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸α-丙酮酸＋NADH乳酸＋NAD+ALTLDH此時(shí)反應(yīng)的方向由NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD，隨反應(yīng)進(jìn)行，A應(yīng)隨之而下降，通過檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物A在340nm處A的變化速率，可以檢測(cè)指示酶反應(yīng)。+酶偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)相酶偶聯(lián)反應(yīng)一開始不能反映酶活性，在反應(yīng)中存在27反應(yīng)一開始加入的試劑1中只有丙氨酸，不存在α-酮戊二酸，在此時(shí)相中，存在于樣品中的干擾物質(zhì)（內(nèi)源性α-酮酸）消耗完。加入試劑2（即α-酮戊二酸）啟動(dòng)反應(yīng)，在初始階段，產(chǎn)物α-丙酮酸開始出現(xiàn)，并逐漸增多，但處于較低水平，指示酶反應(yīng)速度也較低，不能代表待測(cè)酶的Vx。隨著產(chǎn)物α-丙酮酸增加到一定程度，Ex和Ei反應(yīng)V相同，達(dá)到穩(wěn)態(tài)期。此階段340nm處A出現(xiàn)明顯的線性變化。反應(yīng)一開始加入的試劑1中只有丙氨酸，不存在α-酮戊二酸，在此282.酶偶聯(lián)反應(yīng)注意事項(xiàng)(1)延滯期應(yīng)越短越好，測(cè)定時(shí)間要避開此期。(2)不是所有的酶都適合用酶偶聯(lián)法進(jìn)行測(cè)定，酶偶聯(lián)反應(yīng)V應(yīng)超過或等于Vx，Ei反應(yīng)必須是一級(jí)反應(yīng)，即指示酶反應(yīng)速率和測(cè)定酶的產(chǎn)物B濃度成正比。只有使用大量的Ei及其Km值很小時(shí)才能做到。(3)從經(jīng)濟(jì)方面考慮應(yīng)選用一些來(lái)源容易且價(jià)格便宜的酶（指示酶）制劑。(4)適當(dāng)?shù)闹甘久傅挠昧?，反?fù)實(shí)驗(yàn)法確定，即做到酶偶聯(lián)速率不隨酶量的增加而升高，并在所選的最適條件下，指示酶偶聯(lián)反應(yīng)速率和酶活性濃度成正比。2.酶偶聯(lián)反應(yīng)注意事項(xiàng)29檢測(cè)方法設(shè)計(jì)連續(xù)監(jiān)測(cè)法色素原底物NAD(P)H系統(tǒng)過氧化物酶系統(tǒng)其它ALP、GGT、AMS、AFULDH、HBDH、ALTAST、CK、ADALPS、ADACHE、ACP根據(jù)連續(xù)監(jiān)測(cè)法偶聯(lián)體系和檢測(cè)信號(hào)的不同，可以設(shè)計(jì)多種檢測(cè)方法檢測(cè)方法設(shè)計(jì)連色素原底物NAD(P)H系統(tǒng)過氧化物酶系統(tǒng)其它30定時(shí)法和連續(xù)監(jiān)測(cè)法的區(qū)別定時(shí)法連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)總變化量，平均速率測(cè)速率含延滯期或非線性期只計(jì)算線性期速率終止酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)一直進(jìn)行多用酶偶聯(lián)反應(yīng)多用化學(xué)方法檢測(cè)定時(shí)法和連續(xù)監(jiān)測(cè)法的區(qū)別定時(shí)法連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)總變化量，平均速率31第二十三章臨床酶學(xué)檢驗(yàn)的原理和方法第二十三章臨床酶學(xué)檢驗(yàn)的原理和方法32臨床酶學(xué)檢驗(yàn)基本特點(diǎn)基本方法1、項(xiàng)目多，應(yīng)用廣2、含量少，難度大3、高靈敏度4、高特異度1、活性測(cè)定法2、質(zhì)量測(cè)定法臨床酶學(xué)檢驗(yàn)基本特點(diǎn)基本方法1、項(xiàng)目多，應(yīng)用廣1、活性測(cè)定法33第一節(jié)酶活性測(cè)定的理論基礎(chǔ)一、酶促反應(yīng)進(jìn)程二、定時(shí)法三、連續(xù)檢測(cè)法第一節(jié)酶活性測(cè)定的理論基礎(chǔ)一、酶促反應(yīng)進(jìn)程34米-曼方程最大反應(yīng)速率底物濃度米氏常數(shù)反應(yīng)速度一、酶促反應(yīng)進(jìn)程K1K2E+SESE+PK-1酶底物酶-底物復(fù)合物酶產(chǎn)物

Vmax［S］V0=Km+［S］米-曼方程最大反應(yīng)速率底物濃度米氏常數(shù)反應(yīng)速度一、酶促反應(yīng)進(jìn)35（一）Km

Km是酶的特征性常數(shù)之一。若v=0.5Vmax，則Km=[S]，可見Km值等于酶促反應(yīng)的初速率為最大速率Vmax一半時(shí)的底物濃度。Km只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無(wú)關(guān)。1．1／Km可近似地表示酶對(duì)底物的親和力的大小，Km值越小，表示酶與底物的親和力越大，反之亦然。2．如果一個(gè)酶有幾種底物，則對(duì)每一種底物各有一個(gè)特定的Km值，其中Km值最小的底物大都是該酶的最適底物或天然底物。（一）Km36

3．如已知酶的Km，可計(jì)算某一底物濃度時(shí)反應(yīng)速率v和最大速率Vmax的比值，并可推知酶的活性中心被底物飽和的分?jǐn)?shù)。同樣，如要求v和Vmax有一定的百分比，也可算出所需底物濃度為其Km的多少倍4．利用工具酶來(lái)測(cè)定體液中某一成分的濃度或某一酶的催化活性濃度時(shí)，可根據(jù)米-曼方程或其衍變方程式來(lái)計(jì)算工具酶的用量。5．測(cè)定Km值可鑒別不同來(lái)源但催化相同反應(yīng)的酶是同一種酶或是同工酶。

6．如一個(gè)酶催化正逆兩個(gè)方向，測(cè)定正逆兩個(gè)方向底物的Km及底物濃度，可大體推測(cè)該酶在體內(nèi)催化反應(yīng)的方向及其催化效率。7．在代謝酶系中，當(dāng)一組酶催化連續(xù)的代謝反應(yīng)時(shí)，如已知各酶的Km及其相應(yīng)底物的濃度，有助于尋找代謝的限速步驟。一般Km值最大的酶所催化的反應(yīng)為該酶系的限速步驟。3．如已知酶的Km，可計(jì)算某一底物濃度時(shí)反應(yīng)速率v和最大速37（二）VmaxVmax表示在一定酶量下的最大反應(yīng)速率，即酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度呈正比。在酶的濃度不變時(shí)，對(duì)于特定底物而言，Vmax也是一個(gè)常數(shù)。（二）Vmax38零級(jí)一級(jí)[P][S]V＝dpdt時(shí)間延滯期線性期非線性期酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線零級(jí)一級(jí)[P][S]V＝dpdt時(shí)間延滯期線性期非線性期酶39（一）延滯期延滯期（lagphase）是指反應(yīng)初開始的一段時(shí)間，可以是幾秒至幾分鐘。此時(shí)[S]不斷下降，隨之有相應(yīng)[P]產(chǎn)生。由于多種因素的影響，該其酶促反應(yīng)速率比較慢。1、單一酶促反應(yīng)的延滯期：是指酶促反應(yīng)開始到達(dá)最大反應(yīng)速率所需要的時(shí)間。2、酶偶聯(lián)反應(yīng)的延滯期（一）延滯期延滯期（lagphase）是指反應(yīng)初開始的40（二）線性期延滯期后，在過量底物存在的條件下，酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率并保持相對(duì)恒定的一段時(shí)期，該期在時(shí)間進(jìn)程曲線中呈直線或接近直線狀態(tài)，稱為線性期(linearphase)。因底物量足夠，在線性期酶促反應(yīng)速率不受底物濃度的影響，產(chǎn)物[P]和底物[S]變化與時(shí)間t成直線關(guān)系，因此該期的酶促反應(yīng)速率能反映酶活性的大小。（二）線性期41（三）非線性期非線性期又稱底物耗盡期，是指線性期后反應(yīng)速度明顯下降，酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線偏離直線的一段時(shí)期。根據(jù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線中線性期的反應(yīng)速度才能準(zhǔn)確計(jì)算出酶活性濃度，因此，不論哪種酶活性濃度測(cè)定方法，都應(yīng)該盡量保證在酶促反應(yīng)進(jìn)程的線性期進(jìn)行檢測(cè)，否則將導(dǎo)致誤差。在延滯期、非線性反應(yīng)期所測(cè)得的結(jié)果往往不準(zhǔn)確。（三）非線性期根據(jù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線中線性期的反應(yīng)速度才能準(zhǔn)確42酶促反應(yīng)進(jìn)程定時(shí)法三課件43 二、定時(shí)法為了計(jì)算酶活性濃度，必須根據(jù)線性反應(yīng)期（零級(jí)反應(yīng)期）的反應(yīng)速率才能準(zhǔn)確計(jì)算出酶活性濃度，否則將導(dǎo)致誤差。酶活性濃度測(cè)定就是要使酶促反應(yīng)的初速度達(dá)到Vmax，即在過量底物存在下的零級(jí)反應(yīng)期的V，此時(shí)V與[E]之間有線性關(guān)系。 二、定時(shí)法為了計(jì)算酶活性濃度，必須根據(jù)線性反應(yīng)期（44酶活性濃度測(cè)定方法①量氣法其原理是通過測(cè)量一封閉反應(yīng)系統(tǒng)中氣體變化后的氣體體積或壓力，從而計(jì)算出氣體的變化量適用于測(cè)定在反應(yīng)中產(chǎn)生或消耗氣體的酶②分光光度法酶促反應(yīng)的底物與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同，光吸收譜也有差異，不僅能在可見光范圍測(cè)定有色溶液的濃度，還能在紫外光波長(zhǎng)范圍測(cè)定特異的帶有雙鍵或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的無(wú)色物質(zhì)③熒光法和放射性核素法通過熒光光度計(jì)測(cè)定酶促反應(yīng)生成熒光物質(zhì)的速率，此速率與酶濃度成正比④其它方法

1.按監(jiān)測(cè)方法分類2.按反應(yīng)時(shí)間分類(1)定時(shí)法（取樣法、終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法）(2)連續(xù)監(jiān)測(cè)法（動(dòng)力學(xué)法、速率法）酶活性濃度測(cè)定方法①量氣法其原理是通過測(cè)量一封閉反應(yīng)系統(tǒng)中氣45定時(shí)法（取樣法、終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法）定時(shí)法:早期測(cè)定酶活性濃度的方法，大多是使酶作用一段時(shí)間，然后加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應(yīng)，測(cè)定這段時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算酶促反應(yīng)的平均速度。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，測(cè)定時(shí)酶促反應(yīng)已被終止，故比色計(jì)或分光光度計(jì)無(wú)需保溫設(shè)備，顯色劑的選擇不考慮對(duì)酶活性的影響。（一）定時(shí)法的特點(diǎn)定時(shí)法（取樣法、終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法）定時(shí)法:早期測(cè)定酶活性濃度的46缺點(diǎn)：難以確定選定的反應(yīng)時(shí)間是否處于線性期反應(yīng)1反應(yīng)3反應(yīng)2定時(shí)法中可能引起的誤差缺點(diǎn)：難以確定選定的反應(yīng)時(shí)間是否處于線性期反應(yīng)1反應(yīng)3反應(yīng)247注意事項(xiàng)①用定時(shí)法測(cè)定酶活性濃度，必須了解不同酶促反應(yīng)速率和時(shí)間的關(guān)系，②應(yīng)先做預(yù)試驗(yàn)找出酶促反應(yīng)速率恒定的時(shí)期，確定線性時(shí)間，然后在這段時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，③避開延滯期和一級(jí)反應(yīng)。

在實(shí)際工作中，延滯期很難確定，而且一般很短，對(duì)酶活性測(cè)定產(chǎn)生的影響不大。但非線性期的影響不容忽視，隨著保溫時(shí)間的延續(xù)，酶變性失活加速，逆反應(yīng)加強(qiáng)，對(duì)活性測(cè)定產(chǎn)生的影響非常明顯。注意事項(xiàng)在實(shí)際工作中，延滯期很難確定，而且一般很短，對(duì)酶活性48（二）酶活性的計(jì)算根據(jù)測(cè)定方法的不同，可以利用標(biāo)準(zhǔn)比較法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法或吸光系數(shù)法計(jì)算出酶活性濃度單位。酶活性國(guó)際單位定義為每升樣品中每分鐘生成1μmol為1U/L（二）酶活性的計(jì)算根據(jù)測(cè)定方法的不同，可以利用標(biāo)49三、連續(xù)監(jiān)測(cè)法（動(dòng)力學(xué)法、速率法）

即指連續(xù)測(cè)定酶促反應(yīng)過程中某一產(chǎn)物或底物濃度隨時(shí)間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶促反應(yīng)初速度，間接計(jì)算出酶活性濃度的方法。其是臨床測(cè)定酶活性濃度最常用方法。三、連續(xù)監(jiān)測(cè)法（動(dòng)力學(xué)法、速率法）即指連續(xù)測(cè)定酶促反應(yīng)50（一）連續(xù)監(jiān)測(cè)法的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：連續(xù)觀測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，容易找到直線區(qū)域，選擇線性反應(yīng)期來(lái)計(jì)算酶活性，不需終止反應(yīng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，標(biāo)本和試劑用量少，可在短時(shí)間內(nèi)完成測(cè)定。缺點(diǎn)：連續(xù)監(jiān)測(cè)法在特定條件下進(jìn)行，要求足夠的底物濃度和精確控制溫度、PH等反應(yīng)條件，對(duì)儀器要求較高，需要具有恒溫裝置和連續(xù)記錄吸光度裝置。①自動(dòng)生化分析儀能自動(dòng)獲取規(guī)定時(shí)間內(nèi)的信號(hào)，自動(dòng)判斷非線性度，所以連續(xù)監(jiān)測(cè)法更適合于自動(dòng)化儀器。②目前已取代固定時(shí)間法而成為臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)定酶活性濃度最常用的方法。（一）連續(xù)監(jiān)測(cè)法的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：連續(xù)觀測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，容易找到直線區(qū)51（二）酶活性的計(jì)算用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行酶活性測(cè)定時(shí)，根據(jù)摩爾吸收系數(shù)可以進(jìn)行酶活性濃度的計(jì)算。（二）酶活性的計(jì)算用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行酶活性測(cè)定時(shí)，根據(jù)摩爾吸收52連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)酶活性濃度時(shí)，使用摩爾消光系數(shù)（ε）。其定義為：特定條件下，一定波長(zhǎng)的光，光徑為1.0cm時(shí)，通過所含吸光物質(zhì)的濃度為1.00mol/L時(shí)的吸光度。目前實(shí)驗(yàn)室常用的計(jì)算方式連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化（ΔA/min）U/L＝ΔAmin×V×106ε×v×LΔA—吸光度變化106—把mol換算成μmolv—樣品量（ml）L—比色杯光徑（cm）V—反應(yīng)體系體積（ml）ε—摩爾消光系數(shù)（cm2·mol-1）連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)酶活性濃度時(shí)，使用摩爾消光系數(shù)（ε）。其定義為53自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定同一酶，條件固定時(shí)，從理論上講V，v和L均為固定值，ε為常數(shù)，則可將公式簡(jiǎn)寫為：

U/L＝ΔAmin×KV×106ε×v×LK=

K為酶活性濃度定量系數(shù)

主要用于臨床酶活性測(cè)定的計(jì)算與校正

K值設(shè)置應(yīng)考慮酶的參考值上限及測(cè)定時(shí)間兩方面。

自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定同一酶，條件固定時(shí)，從理論上講V，v和54（三）連續(xù)監(jiān)測(cè)法的方法類型1.直接連續(xù)監(jiān)測(cè)法是在不終止酶促反應(yīng)條件下，直接通過測(cè)定反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物某些理化性質(zhì)的變化（如：A、熒光、旋光性，pH、電導(dǎo)率、粘度等），從而計(jì)算出酶活性濃度。評(píng)價(jià)：方法簡(jiǎn)單，但只有底物與產(chǎn)物之間，在理化性質(zhì)方面有顯著性差異時(shí)，才能使用直接法，只有很少一部分酶能用直接法測(cè)定。根據(jù)檢測(cè)物質(zhì)是否為待測(cè)酶的底物或產(chǎn)物，可將連續(xù)監(jiān)測(cè)法分為：直接連續(xù)監(jiān)測(cè)法和間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法。（三）連續(xù)監(jiān)測(cè)法的方法類型1.直接連續(xù)監(jiān)測(cè)法是在不終止酶促反552.間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法（1）一步間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法在原反應(yīng)體系中加入一些試劑，其只和反應(yīng)產(chǎn)物迅速作用，產(chǎn)生可被檢出的物質(zhì)，但該試劑不和酶反應(yīng)，也不影響酶的活性。SPE+試劑可被檢出的物質(zhì)（2）酶偶聯(lián)法目前應(yīng)用最多，即在原反應(yīng)體系中加入另一些酶試劑，所進(jìn)行的酶促反應(yīng)和被測(cè)酶的酶促反應(yīng)偶聯(lián)起來(lái)，最后的反應(yīng)產(chǎn)物可直接監(jiān)測(cè)，進(jìn)而推測(cè)出第一個(gè)酶的活性濃度。2.間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法（1）一步間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法在原反應(yīng)體系56反應(yīng)模式ABPExEi被測(cè)酶被測(cè)酶始發(fā)反應(yīng)始發(fā)反應(yīng)指示反應(yīng)指示酶指示反應(yīng)指示酶AB