什么是包涵體

包涵體即表達外源基因的宿主細(xì)胞，可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌；也可以是真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等。包涵體是病毒在增殖的過程中，常使寄主細(xì)胞內(nèi)形成一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)，在光學(xué)顯微鏡下可見。多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆?；蛏形囱b配的病毒亞基聚集而成；少數(shù)則是宿主細(xì)胞對病毒感染的反應(yīng)產(chǎn)物，不含病毒粒子。包涵體（inclusionbody）基因工程定義：在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。病毒在增殖的過程中，常使寄主細(xì)胞內(nèi)形成一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)，在光學(xué)顯微鏡下可見。多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆?；蛏形囱b配的病毒亞基聚集而成；少數(shù)則是宿主細(xì)胞對病毒感染的反應(yīng)產(chǎn)物，不含病毒粒子。有的位于細(xì)胞質(zhì)中（如天花病毒包涵體），有的位于細(xì)胞核中（如皰疹病毒），或細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中都有（如麻疹病毒）。有的還具有特殊名稱，如天花病毒包涵體叫顧氏（Guarnieri）小體，狂犬病毒包涵體叫內(nèi)基氏（Negri）小體。特性一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶于水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。形成主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。1、表達量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達到足夠的溶解度等。2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。在基因重組技術(shù)得到迅速發(fā)展之前，研究者就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)人工引入反常的蛋白質(zhì)（這些蛋白質(zhì)可以看作是細(xì)胞的外源蛋白質(zhì)），這些蛋白質(zhì)會堆積起來形成不溶的形式。這些蛋白質(zhì)聚集的形態(tài)是明顯的球形，這些球形的物質(zhì)全部是蛋白質(zhì)，并且通過非共價鍵的作用力形成，必須使用變性劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）或者鹽酸胍才能溶解。自從基因工程的蛋白質(zhì)在大腸桿菌表達以后，人們逐漸發(fā)現(xiàn)這些外源蛋白質(zhì)基因在細(xì)胞中的過量表達同樣形成不溶性的狀態(tài)。Georgiou等人發(fā)現(xiàn)天然的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中大量表達時，如內(nèi)酰氨酶和堿性磷酸酶的過量表達，都形成了包涵體，前者的包涵體在外周質(zhì)，后者的包涵體存在于細(xì)胞質(zhì)中。其它的宿主細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了重組蛋白質(zhì)過量表達時形成的包涵體或者聚集體，如細(xì)菌病毒、哺乳動物細(xì)胞中。包涵體在一些外界壓力下也可以形成，如溫度，是影響包涵體形成與否的主要因素。有些蛋白質(zhì)在高溫的情況下容易形成包涵體，這是由于這些蛋白質(zhì)在高溫下容易變性而形成聚集體。所以有人認(rèn)為，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)具有高的融化溫度、高的天然構(gòu)象穩(wěn)定性的情況下，包涵體就不容易形成。但是，對一些體內(nèi)包涵體形成的研究發(fā)現(xiàn)，包涵體的形成先于成熟肽鏈的形成，或者是同時進行的。在研究P22尾刺蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)，盡管尾刺蛋白質(zhì)有高的穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)中主要是片斷，融化的溫度是88℃，并不受SDS、蛋白質(zhì)酶和熱失活的作用，但是這種蛋白質(zhì)是為數(shù)不多的在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體的原核蛋白質(zhì)模型。有些天然的蛋白質(zhì)在高溫（39.1℃）表達時可以提高25%，但是這些蛋白質(zhì)不能折疊成天然的狀態(tài)而形成聚集體。聚集體形成的動力學(xué)表明，這些聚集體是從部分折疊的中間體形成的。實際上，這些折疊的中間體或者形成天然的狀態(tài)，或者形成聚集體，這個過程是溫度依賴性的，溫度的升高利于聚集體的形成。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)肽鏈在高溫下表達，合成的肽鏈足夠早地轉(zhuǎn)移到低溫下時，這些蛋白質(zhì)肽鏈會重新進入折疊的過程。同時，當(dāng)尾刺蛋白質(zhì)在允許的溫度下表達后，再把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到高溫下，這些蛋白質(zhì)肽鏈保持活性，證明了一旦蛋白質(zhì)被正確的表達并折疊成正確的構(gòu)象以后，則細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解性在高溫下不再改變。蛋白質(zhì)在體內(nèi)折疊的中間體對于溫度因子明顯敏感。沙眼衣原體包涵體認(rèn)為較高的溫度可能增加了蛋白質(zhì)合成的速度、折疊中間體形成聚集體的速度以及疏水相互作用力，表達的蛋白質(zhì)易于以包涵體的形式存在。其它的發(fā)酵條件同樣影響蛋白質(zhì)包涵體的形成，發(fā)酵液中加入蔗糖可以大大降低內(nèi)酰胺酶包涵體的形成。蔗糖的作用可能是穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或者防止蛋白質(zhì)折疊中間體的聚集。在體外的內(nèi)酰胺酶折疊復(fù)性的過程中，同樣發(fā)現(xiàn)復(fù)性緩沖液中加入蔗糖可以提高蛋白質(zhì)的復(fù)性率。其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白質(zhì)的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl。也有報道認(rèn)為在豐富的培養(yǎng)基中有利于活性蛋白質(zhì)的表達，當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時如供氧不足或pH控制不佳時易形成包涵體。蛋白質(zhì)的聚集體和包涵體不僅僅存在于重組蛋白質(zhì)的表達中，是一個廣泛存在的現(xiàn)象。通常認(rèn)為，蛋白質(zhì)的聚集現(xiàn)象，無論細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外，都是中間體不能完成折疊而形成自我聚集現(xiàn)象。包涵體的形成與多肽鏈的序列、表達速度、可用的伴侶分子的量以及生長的環(huán)境有關(guān)。特點包涵體是新合成的肽鏈在折疊過程中部分折疊的中間體形成的，而不是由完全的解折疊形式的蛋白質(zhì)形成的，這可能與體外復(fù)性時聚集體的形成有相似的機制，應(yīng)該考慮到在包涵體中含有這些部分折疊的結(jié)構(gòu)。但是，由于包涵體的特性，很難利用物理的方法去探測包涵體中蛋白質(zhì)肽鏈的結(jié)構(gòu)。Zetlmeissl等人利用圓二色的方法，發(fā)現(xiàn)聚集體的肽鏈保持了部分的二級結(jié)構(gòu)。利用Raman測定的方法也得出了相同的結(jié)論。利用ATR-FTIR發(fā)現(xiàn)包涵體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比天然的蛋白質(zhì)和鹽沉淀的蛋白質(zhì)含有更多的非天然狀態(tài)的折疊的結(jié)構(gòu)。Murry等人利用免疫學(xué)的方法測定色氨酸合成酶的亞基，蛋白質(zhì)復(fù)性以后，出現(xiàn)三種形式的蛋白質(zhì)：一種是不溶的高分子量的聚集體，一種是可溶的復(fù)性完全的蛋白質(zhì)，一種是可溶的低分子量的聚集體，最后一種聚集體同天然的蛋白質(zhì)一樣有免疫活性，可以與兩種單克隆抗體結(jié)合，但是天然蛋白質(zhì)的另外三種抗體不與它結(jié)合，說明了即使沒有復(fù)性，聚集體仍保持了部分的近似天然的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。在大腸桿菌中，包涵體可以在細(xì)胞的兩個位置出現(xiàn)：細(xì)胞質(zhì)和外周胞質(zhì)。包涵體在細(xì)胞內(nèi)形成的位置和特點取決于蛋白質(zhì)表達的方式。三種表達的內(nèi)酰氨酶，一種是天然的內(nèi)酰氨酶，一種是含有OmpA信號肽，一種完全切除了天然蛋白質(zhì)的信號肽，當(dāng)大量表達時，造成了聚集體的形成，前兩者的聚集體在外周胞質(zhì)，后者在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成聚集。這些包涵體在大小和形狀有相當(dāng)清楚的差別，這些差別表現(xiàn)了聚集體的表面形態(tài)、組成和形成聚集體的多肽鏈構(gòu)象上的不同。大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中的包涵體直徑一般在0.2到1.5μm之間，不同的蛋白質(zhì)具有不同的直徑，如干擾素的大小是0.811μm，而牛凝乳酶原的大小是1.281μm。大的包涵體可以利用光學(xué)顯微鏡看得到。在一些情況下，有些包涵體比較大，直徑大于大腸桿菌的直徑，使得大腸桿菌有一個突起。一般情況下，一個細(xì)胞僅有一個包涵體。包涵體從來不吸附在膜上，并且不同于真核細(xì)胞中的其它的細(xì)胞器。高精度的投射電子顯微鏡顯示了多孔的結(jié)構(gòu)。所有的包涵體密度較大，是微生物細(xì)胞中密度最大的結(jié)構(gòu)，密度在1.1-1.3之間，不同蛋白質(zhì)的包涵體的密度也不同，一些低分子量的包涵體結(jié)構(gòu)是多孔的。聚集體的構(gòu)象還沒有進行系統(tǒng)的研究，但是已經(jīng)知道聚集在一起的作用力不是共價鍵，主要的是疏水相互作用力。大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中有大量的谷胱甘肽，抑制二硫鍵的形成。所以，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中表達時，由于形成不了二硫鍵而形成了聚集體。內(nèi)酰氨酶的包涵體進行蔗糖梯度離心表明其中95%是蛋白質(zhì)成分，說明很少有其他的蛋白質(zhì)成分加入到聚集體中，利用免疫學(xué)的方法，也沒有發(fā)現(xiàn)伴侶分子。體內(nèi)聚集體的形成不僅產(chǎn)生包涵體，而且會帶來淀粉質(zhì)的疾病，對哺乳動物同樣會造成疾病。對體內(nèi)或者體外蛋白質(zhì)聚集體形成的研究，特別是了解氨基酸序列如何避免聚集體的形成，可以大大提高蛋白質(zhì)在體外折疊的收率，并且有助于理解體內(nèi)分子病形成的機制。病毒包涵體包涵體有的位于細(xì)胞質(zhì)中（如天花病毒包涵體）。有的包涵體還具有特殊名稱，如天花病毒包涵體叫顧氏（Guarnieri）小體，狂犬病毒包涵體叫內(nèi)基氏（Vegri）小體。分離一旦一個穩(wěn)定的、重復(fù)的發(fā)酵過程建立起來，則要考慮提取包涵體的步驟了。包涵體處在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或者細(xì)胞的外周質(zhì)，必須破壞細(xì)胞膜才能把包涵體釋放出來。溶液中的包涵體也要同破碎液中溶解的成分和不溶的其它成分如細(xì)胞碎片、細(xì)胞膜以及核糖體等成分分離開來。提取的第一步是冷卻發(fā)酵液，利用離心或者錯流過濾的方法收集細(xì)胞，細(xì)胞的沉淀利用設(shè)定的含有一定濃度的離子強度（0.4-0.6mo1）的緩沖液懸浮。這種緩沖液必須控制pH、離子強度、重金屬的濃度和氧化還原的環(huán)境，在以后的操作步驟中也要考慮這些因素。由于包涵體比細(xì)胞可以耐受更大的剪切力，所以可以使用的破碎細(xì)胞的方法有很多。對于大腸桿菌，最經(jīng)常使用的方法是高壓勻漿的方法，可以使細(xì)胞完全破碎，并且這種方法可以以不同的規(guī)模使用，2到5個循環(huán)可以使細(xì)胞完全破碎。酵母細(xì)胞由于含有更加有彈力的細(xì)胞壁，所以需要的循環(huán)可能更多，或者在容器中加入一些玻璃顆粒。破碎細(xì)胞還可以使用物理的方法如超聲，或者化學(xué)的方法如化學(xué)試劑和酶，如溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）來破碎細(xì)胞。包涵體可以使用過濾或者離心的方法，把細(xì)胞破碎液中的其它成分除去，這兩種方法利用了包涵體的不同物理特性。由于包涵體和可溶蛋白質(zhì)的體積不同，所以可以使用過濾的方法，這種方法可以降低操作成本，易于放大。一些實驗已經(jīng)證明過濾的方法是分離包涵體的有效的手段，但是這種方法也存在著一些缺點：過濾膜很容易被一些不透過的成分所堵塞，即使使用錯流過濾或者使用很高的流速，這種情況都不能避免。并且，由于微孔膜是根據(jù)成分的大小來分離的，一些細(xì)胞碎片也容易與包涵體混在一起。而包涵體蛋白質(zhì)的密度比相同體積的細(xì)胞碎片的密度大得多，所以使用離心的手段可以把包涵體與細(xì)胞的其它成分分離開來。如果細(xì)胞碎片沒有同包涵體分離，在以后的分離手段中必須把膜上的組分分離開來。有時，有些目標(biāo)蛋白質(zhì)以溶解的形式存在，可以通過在細(xì)胞破碎以前加入一些非極性的物質(zhì)（如苯酚、甲苯）或者去垢劑，通過這個方法可以提高從大腸桿菌表達的人生長激素包涵體的收率。連續(xù)離心技術(shù)是工業(yè)生產(chǎn)中獲得包涵體最經(jīng)常使用的操作。由于細(xì)胞碎片的密度比包涵體小，則沉降的速度比包涵體要小，連續(xù)的懸浮、離心可以把大部分的包涵體離心下來，而細(xì)胞碎片逐步除去。SDS（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳）分析發(fā)現(xiàn)，離心的方法可以達到沉降物中的蛋白質(zhì)的含量大于90%。當(dāng)細(xì)胞碎片與包涵體混在一起難于分離時，可以采用一些化學(xué)的方法把細(xì)胞碎片離子交換色譜復(fù)性蛋白質(zhì)與包涵體分離開，否則溶解包涵體以后，膜蛋白質(zhì)溶在包涵體蛋白質(zhì)的溶液中，會污染以后的操作。特別如果一些膜蛋白質(zhì)具有蛋白質(zhì)酶的活性，則溶解以后的包涵體蛋白質(zhì)可被降解。如果溶解原核細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的一些溶劑不能溶解包涵體蛋白質(zhì)時，可以使用溶解的方法把膜蛋白質(zhì)除去。最經(jīng)常的選擇性溶解膜蛋白質(zhì)的方法是利用鰲合金屬的試劑如EDTA、中性的去垢劑如TritonX-100，或者一些鹽如，脫氧膽酸鹽，或者弱離液劑，如2mol/L的脲。Babbit等人發(fā)現(xiàn)經(jīng)過前面的步驟，可以提高肌氨酸激酶的復(fù)性收率，活性提高的原因是使用弱的去垢劑辛基糖除去了蛋白質(zhì)酶。離心和高壓勻漿都有可能產(chǎn)生泡沫，所以必須在工業(yè)規(guī)模中避免這種無謂的損失。有些工業(yè)生產(chǎn)中，分離以前在發(fā)酵罐中把細(xì)胞殺死使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來，并同時溶解或者不溶解包涵體蛋白質(zhì)。這種在線殺死細(xì)胞的方法己經(jīng)用來生產(chǎn)兩種蛋白質(zhì)：在堿性條件下溶解類胰島素生長因子和高溫、酸性條件下生產(chǎn)重組的抗真菌肽段。這種方法的優(yōu)點是可以節(jié)省操作時間以及能量消耗，僅僅需要一步離心的步驟。最經(jīng)常使用的殺死細(xì)胞的試劑有苯乙醇，辛酸，氯仿，甲苯等。殺死細(xì)胞時也有缺點，溶解的目標(biāo)蛋白質(zhì)中含有蛋白質(zhì)或者非蛋白質(zhì)的物質(zhì)，降低了蛋白質(zhì)的純度；如果目標(biāo)蛋白質(zhì)沒有被溶解，則殺死細(xì)胞會使可溶蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，使得包涵體的純化比較困難，或者破壞包涵體內(nèi)部的重組蛋白質(zhì)。溶解維持包涵體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力是分子內(nèi)的作用力，這種作用力也維持天然蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)。先前有報道這種作用力是共價鍵結(jié)合的，但是，趨向于一致，就是維持包涵體內(nèi)部的蛋白質(zhì)的緊密的結(jié)構(gòu)的是非共價鍵的作用力。二硫鍵，無論是正確的還是錯誤的二硫鍵，在維持內(nèi)部蛋白質(zhì)的緊密的結(jié)構(gòu)中都沒有發(fā)揮直接的作用。最經(jīng)常的獲得活性蛋白質(zhì)的第一步是溶解這些包涵體蛋白質(zhì)，溶解液是使這些包涵體蛋白質(zhì)完全變性的成分，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被溶解以后，則進入到蛋白質(zhì)的體外折疊的過程。包涵體溶解遵循標(biāo)準(zhǔn)包涵體蛋白質(zhì)的溶解同樣是一個工藝的關(guān)鍵的步驟。溶劑的選擇會影響后續(xù)的操作、最終的各種蛋白質(zhì)的收率以及最終的成本，必須遵循以下的標(biāo)準(zhǔn)：⑴快速溶解的動力學(xué)；⑵與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可逆的；⑶對細(xì)胞碎片的分離方法沒有干擾作用；⑷對溫度沒有依賴作用；⑸抑制蛋白質(zhì)酶的降解作用；⑹與蛋白質(zhì)的氨基沒有化學(xué)修飾作用；⑺在可能的情況下，選擇最低的溶解濃度和廉價的溶劑，并適于以后的復(fù)性方法。溶解包涵體最經(jīng)常使用溶解包涵體的試劑包括離液劑或者去垢劑。最經(jīng)常使用的溶解和制備蛋白質(zhì)的離子型的離液劑最早于1969年Hatefi等人發(fā)展的離子型的去垢劑如SDS是另外一種溶解包涵體蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)的試劑，但是一般不用來大規(guī)模的生產(chǎn)，而是用來定性。除了強酸、強堿和利用有機溶劑來提取疏水性很強的蛋白質(zhì)以外，其他的變性方法如非可逆的共價修飾在工業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)中很少用到。一旦蛋白質(zhì)被溶解，蛋白質(zhì)中的巰基很容易快速地氧化并形成共價的聚集體或者分子內(nèi)錯配的二硫鍵，然后這些蛋白質(zhì)就不能再進行折疊。為了防止氧化，可以使這些基團或者利用緩沖液中含有低分子量的疏基試劑保持在還原的狀態(tài)或形成磺酸鹽或者形成混合的二硫鍵。去垢劑去垢劑是一種最經(jīng)濟的溶解包涵體蛋白質(zhì)的方法，一個最大的優(yōu)點是溶解的蛋白質(zhì)有可能保持全部的生物活性，說明在此條件下保持了蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。最重要的是稀釋以后蛋白質(zhì)的聚集比其它溶劑生成的很少。陽離子型、陰離子型的和非離子型的去垢劑都可以使用，使用時的濃度一般高于去垢劑的臨界膠束濃度（CMC），通常是0.5-5%。SDS僅僅在大量生產(chǎn)牛生長激素、干擾素和白介素-2中用到。SDS由于具有較低的臨界膠束濃度（CMC）而使得結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的SDS比較難于除去。由于N-十二烷肌氨酸它的CMC比SDS高0.4%，也被用來溶解包涵體蛋白質(zhì)并可用稀釋的方法使蛋白質(zhì)復(fù)性，殘余的去垢劑可以使用陰離子交換色譜或者超濾的方法除去。這種去垢劑是一種比較溫和的去垢劑，可以選擇性地溶解一些包涵體，但是不能溶解完全的變性的蛋白質(zhì)的聚集體和大腸桿菌的內(nèi)膜的蛋白質(zhì)分子。使用去垢劑一個主要的缺點是對以后的純化和復(fù)性的步驟的干擾，去垢劑結(jié)合到蛋白質(zhì)上的強度大離子交換色譜復(fù)性蛋白質(zhì)小不同，比較難于除去，并干擾離子交換和疏水相互作用色譜的過程，在變性的濃度時超濾膜會吸附這些變性劑。所以復(fù)性后需要盡量洗滌這些去垢劑，也可以使用環(huán)狀糊精鏈狀糊精或者環(huán)狀淀粉從復(fù)性緩沖液中提取去垢劑。一個不容忽視的問題是去垢劑可以溶解全部的膜蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)酶，這些蛋白質(zhì)酶的活性在去垢劑的存在的情況下被活化，可能造成溶解和復(fù)性過程的收率的降低。蛋白質(zhì)復(fù)性的收率可以通過以下的方法來提高：a)先期使用可以溶解膜蛋白質(zhì)但是不溶解包涵體蛋白質(zhì)的溶劑盡量洗滌包涵體蛋白質(zhì)；b)包涵體的含有的菌體碎片被完全除去；c)溶解包涵體的液體中含有蛋白質(zhì)酶的抑制劑，如EDTA，苯甲基磺酰氟（PMSF）等。離液劑其它的離液劑也被用來溶解包涵體蛋白質(zhì)，最主要的溶解包涵體蛋白質(zhì)的離液劑是鹽酸胍和尿素，這是最經(jīng)常使用的溶解試劑，一般情況下選擇6-8mo1/L的濃度，蛋白質(zhì)濃度在1-10mg/mL。在溶解色氨酸合成酶A的過程，發(fā)現(xiàn)陽離子的溶解能力順序是Gdm+>Li+>K+>Na+，陰離子的順序是SCN->I->Br->Cr-。一些離液劑由于它們的溶液比鹽酸胍和尿素有更高的密度和黏度而不適合用于溶解包涵體，因為利用離心和色譜分離起來比較困難。為了溶解包涵體蛋白質(zhì)需要的尿素或者鹽酸胍的濃度根據(jù)蛋白質(zhì)的不同而不同。如果蛋白質(zhì)天然形態(tài)需要溶解的變性劑的濃度不能獲得，則在溶解包涵體時需要首先確定離液劑的濃度。大腸桿菌鹽酸胍由于比較貴，所以一般用來溶解一些附加值比較高的藥物蛋白質(zhì)分子，選擇鹽酸胍作為溶解試劑，是因為鹽酸胍是一種比脲更為強烈的變性劑，甚至可以溶解脲所不能溶解的包涵體；尿素，由于可能被自發(fā)的形成的氰酸鹽或者已有的氰酸鹽的污染，特別是在堿性環(huán)境中，從而造成蛋白質(zhì)的自由的氨基被不可逆的修飾。消除此種影響的方法是用陰離子的緩沖系統(tǒng)如Tris-HCl溶解脲或者脲在使用之前利用陰離子交換色譜純化，并且配制的溶解和復(fù)性的緩沖液在當(dāng)天使用。脲溶液中影響蛋白質(zhì)變性的因素與鹽酸胍的不同。溶在脲中的蛋白質(zhì)受到pH和離子強度的影響，從而影響電荷的蛋白質(zhì)殘基之間的電荷作用，但是由于鹽酸胍含有高濃度的離子強度，所以這兩個因素的影響很少?；旌先軇┮话闱闆r下去垢劑并不聯(lián)合使用，Lilly等人發(fā)現(xiàn)去垢劑和尿素的混合液有效的摩爾濃度較低。尿素和去垢劑型的鹽混合可以使蛋白質(zhì)變性，但是尿素和非去垢劑的鹽如氯化鈉反而降低包涵體蛋白質(zhì)的溶解性，所以要避免使用。去垢劑結(jié)合其他的試劑或者溶解增強劑也被使用，發(fā)現(xiàn)尿素和乙酸，尿素和二甲亞楓，尿素和高pH等是比較有效的溶解包涵體蛋白質(zhì)的方法。高壓（1-2kbar）、超聲也可以溶解包涵體蛋白質(zhì)，此時使用的溶解試劑濃度可以比較低，便于后續(xù)的復(fù)性步驟。極端pH酸堿度也是比較廉價的有效的溶解包涵體的方法。最經(jīng)常使用酸的是有機酸，濃度在5-80%之間。Gavif和Better使用低的（pH≤2.6）和高溫（85℃）溶解抗真菌的重組蛋白質(zhì)的膚段，低溫和高PH需要溶解時間要長。Reddy和合作者也使用20%乙酸溶解一種麥芽糖結(jié)合的蛋白質(zhì)。但是，同樣的一些不可逆的修飾作用或者酸降解會在極端pH下發(fā)生，所以此種方法并不是經(jīng)常使用的溶解包涵體的方法。高pH（≥12）也被用來溶解生長激素和原胰島素。在高pH下一些蛋白質(zhì)同樣可能發(fā)生非可逆的變性，原因在于半胱氨酸在堿性條件下的脫硫過程。所以這種方法盡管比較簡單、廉價，同樣僅僅用于一些特定的蛋白質(zhì)，特別對于藥用蛋白質(zhì)一般不采用這種方法。因素1、可溶性蛋白在細(xì)胞內(nèi)容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解。2、降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃度，有利于表達量的提高。3、包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利于分離純化。4、對機械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，并與細(xì)胞膜碎片分離。實驗方法破菌1、機械破碎2、超聲破碎3、化學(xué)方法破碎洗滌由于脂體及部分破碎的細(xì)胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右，1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。去垢劑如強的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。問題是由于SDS無法徹底的去除而不允許在制藥過程中使用。極端pH可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生長激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。變性劑的使用濃度和作用時間：一般在偏堿性性的環(huán)境中如pH8.0-9.0，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，一般不要超過pH1.0。有些蛋白只能用鹽酸胍如IL-4。增溶時一般室溫過夜，但鹽酸胍在37度1小時便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。還原劑由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文獻使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關(guān)，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響，如牛生長激素包涵體的增溶。對于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。復(fù)性通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復(fù)性過程開始，到2M左右時結(jié)束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M時復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。復(fù)性中常采用稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成沉淀，且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對透析速度進行控制，缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。柱上復(fù)性：是研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種復(fù)性方法，如華北制藥的G-CSF復(fù)性據(jù)說是通過柱上復(fù)性進行的。常用于復(fù)性的層析方法有SEC、HIC等。還原劑的去除還原劑一般和變性劑的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫鍵慢慢形成。但是由于二硫鍵的形成并不是蛋白質(zhì)正確折疊所必須的，可以考慮在變性劑完全去除之后，在去除還原劑使已經(jīng)按照正確的結(jié)構(gòu)相互接近的巰基間形成正確的二硫鍵。常用的氧化方法有：空氣氧化法：在堿性條件下通空氣，或者加入二價銅離子，能夠取得更好的效果，缺點是不易控制氧化還原電勢。氧化還原電對（redox）：常采用GSSG/GSH，通過調(diào)整兩者的比例來控制較精確的氧化還原電勢，也可以在添加了還原劑如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG，如：5mMGSSG/2mMDTT=GSH/GSSG(1.33/1）。效率復(fù)性是一個非常復(fù)雜的過程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M行復(fù)性的方法如IL-11，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點幾。一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。添加劑1、共溶劑：如PEG6000-20000，據(jù)說可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團，此外由于阻止了蛋白質(zhì)分子間的相互接觸的機會，也可能對復(fù)性效率的提高起作用。一般的使用濃度在0.1%左右，具體條件可根據(jù)實驗條件確定。2、二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）和脯氨酸異構(gòu)酶（PPI）：PDI可以使錯配的二硫鍵打開并重新組合，從而有利于恢復(fù)到正常的結(jié)構(gòu)，此外在復(fù)性過程中蛋白質(zhì)的脯氨酸兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變需要較高能量，常常是復(fù)性過程中的限速步驟，而PPI的作用是促進兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變，從而促進復(fù)性的進行。3、分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP），是一種沒有蛋白質(zhì)特異性的促進折疊的蛋白因子，研究發(fā)現(xiàn)很多蛋白在缺乏分子伴侶時無法自己正確的折疊。有人構(gòu)建了與伴侶分子共同表達的菌株，據(jù)說效果不錯。不過在生產(chǎn)中還沒有看到2和3的應(yīng)用的例子。4、0.4-0.6ML-Arg：成功的應(yīng)用于很多蛋白如t-PA的復(fù)性中，可以抑制二聚體的形成。5、甘油等：增加黏度，減少分子碰撞機會，一般使用濃度在%5-30%。6、一定的鹽濃度，可能是為了降低某些帶電集團間的斥力，有利于蛋白質(zhì)的折疊。7、輔助因子：添加蛋白質(zhì)活性狀態(tài)必須的輔助因子如輔酶輔基等或蛋白配體等很多時候?qū)Φ鞍踪|(zhì)正確的折疊是有利的。8、色譜法：通過將目標(biāo)蛋白結(jié)合到層析柱上，減少蛋白分子間的相互影響，該方法得到越來越多的應(yīng)用，常用的色譜有SEC、HIC、IEC、IMAC等。當(dāng)然，雖然有很多所謂的理性的復(fù)性方案設(shè)計，復(fù)性工作更多的是一個經(jīng)驗的過程，沒有一種通用的方法可以套用。蛋白濃度一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經(jīng)濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩(wěn)定，很容易變性。檢測根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進行檢測。1、凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對情況。2、光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進行復(fù)性情況的檢測，但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測。3、色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。4、生物學(xué)活性及比活測定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。5、黏度和濁度測定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。6、免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。實例1、MHCⅡJBC269(47）：1994增溶：16-40mgProtein,8MGdnHCl,16-32mMDTT,1mMEDTA,50mMTrispH8.037度1hr.復(fù)性：8-16folddilutionto1-5mg/mlProtein.2、增溶：10mMDTT,0.1%SDS,25mMTris,200mMGlucinepH8.5.復(fù)性：10倍稀釋到10mMDTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTrispH8.0.對起始緩沖液密閉透析16hr，開口透析8hr，對150mMNaCl,10mMTrispH8.0透析48hr。3、BovinePrethrombin-2,JBC270⑴：1990四對二硫鍵。增溶：7MGdnHCl,10mMTrispH8.0,1mMEDTA4mg/ml.復(fù)性：稀釋到100mMNa2HPO4,2mMEDTA,0.1%PEG,0-4MGdnHCl,0.1mMGSSG,0.2mMGSH,pH7.4,0.025mg/mlProtein.RT24hr.對4L25mMsodiumphosphate,2mMEDTA,0.1%PEG,pH7.4透析3次，溫度4度。純化一般說來，復(fù)性液的體積較大，為了減少處理體積，在進行柱純化以前可以先進行硫酸銨沉淀，沉淀在低速離心收集后復(fù)溶的鹽濃度較高，可以直接進行HIC純化，目標(biāo)峰經(jīng)適當(dāng)稀釋后（cond<5mS/cm）進行IEX純化，然后通過SEC脫鹽，更換緩沖液，除菌過濾后，在質(zhì)量合格的情況下便可以進入制劑階段。當(dāng)然在復(fù)性濃度較高的情況下，也可以直接將復(fù)性液進行IEX純化，優(yōu)點是在純化的同時進行體積的濃縮，為以后的精制創(chuàng)造條件。從生產(chǎn)的角度看，由于每增加一步純化工序便降低很多收率，所以可過兩到三次柱純化，工藝越簡單越有利于收率的提高。當(dāng)然這只是一個一般的原則，對于純度要求較高的產(chǎn)品如重組人白蛋白，不得不進行多次純化。蛋白質(zhì)1.

真核細(xì)胞表達外源蛋白質(zhì)的缺點一些蛋白質(zhì)需要翻譯后的修飾，如糖基化，則必須選用真核細(xì)胞。但是無論是正在臨床的還是市場上的蛋白質(zhì)藥物，主要的是以大腸桿菌作為宿主細(xì)胞。1982年第一次選用大腸桿菌作為表達重組DNA的宿主細(xì)胞，表達的產(chǎn)物是人胰島素。選擇原核細(xì)胞作為表達載體，因為真核細(xì)胞表達外源蛋白質(zhì)有其缺點：⑴真核細(xì)胞的天然蛋白質(zhì)的表達和外源蛋白質(zhì)的表達，表達量相當(dāng)少，即使有的蛋白質(zhì)表達量高時，容易出現(xiàn)蛋白質(zhì)的無活性的現(xiàn)象，或者形成聚集體；而原核細(xì)胞表達的蛋白質(zhì)量比真核細(xì)胞大很多；⑵相對于大腸桿菌，人類對于真核細(xì)胞的基因的了解還是有限的，而對大腸桿菌的基因了解的相當(dāng)透徹，并能進行熟練的基因重組等操作對大腸桿菌的基因進行改造；⑶真核細(xì)胞生長到高密度需要更長的時間（7天左右），并且細(xì)胞的最終濃度低，所以需要較大的培養(yǎng)容器，而大腸桿菌可以在幾個h以內(nèi)達到108cells/mL；⑷動物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液的造價較高，并且大部分使用血清作為生長液的添加劑，從而提高了產(chǎn)品的造價并且不利于以后的純化步驟；⑸原核細(xì)胞的堅硬的細(xì)胞壁，可以使用簡單的攪拌的方法完成傳熱、傳質(zhì)過程，而大部分的真核細(xì)胞需要溫和的培養(yǎng)方法及復(fù)雜的操作以達到其對培養(yǎng)基的要求?；谝陨系脑颍婧思?xì)胞尤其是哺乳動物細(xì)胞表達外源蛋白質(zhì)大部分處在研究階段，大部分重組蛋白質(zhì)使用的表達載體是大腸桿菌細(xì)胞。大腸桿菌表達的外源蛋白質(zhì)量相當(dāng)大，有時達到細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)總量的5-20%，甚至達到50%以上。但是，大腸桿菌表達的蛋白質(zhì)，當(dāng)含量相當(dāng)大時，有時由于原核細(xì)胞缺少分泌到胞外的機制或者折疊的機制，最后表達的蛋白質(zhì)往往以無活性的包涵體的形式存在。2