Western-blot-實驗原理和實驗步驟-P課件

Westernblot實驗原理和實驗步驟Westernblot實驗原理和實驗步驟1為什么要做蛋白質(zhì)印跡實驗？

研究一些體外的蛋白質(zhì)分子，尋找目的蛋白是否存在樣品當(dāng)中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，在不同的樣品中，樣品之間的表達(dá)差異性。2為什么要做蛋白質(zhì)印跡實驗？

21Westernblot基本原理蛋白免疫印跡的組成Western

blot一般流程Westernblot常見問題分析31Westernblot基本原理蛋白免疫印跡的組成We1WesternBlot基本原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。SDS可對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到固相載體——例如PVDF膜上。固相載體可以吸附蛋白質(zhì)，并保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜就稱為一個印跡（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液）處理，封閉PVDF膜上的疏水結(jié)合位點。用目標(biāo)蛋白的抗體（一抗）處理PVDF膜——只有待研究的蛋白質(zhì)才能與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，只有在目標(biāo)蛋白的位置上結(jié)合著一抗。用一抗處理過的PVDF膜再用標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。41WesternBlot基本原理WesternBlot采用2組成蛋白免疫印跡（Westernblotting或Immunoblotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測三個部分組成。第一步:是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步：把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移電泳），它又有半干法和濕法之分，電轉(zhuǎn)移主要方法有垂直的槽式和水平的半干式兩種。第三步：是用自特異性的抗體檢測出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測的方法可以是直接的和間接的。現(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)的方法，在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體（堿性磷酸酶（知AP）或辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗第一抗體的抗體）雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來道顯示抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的檢測中。52組成蛋白免疫印跡（Westernblotting或I3Westernblot流程圖63Westernblot流程圖6WesternBlot一般流程1蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交洗膜二抗雜交洗膜底物顯色7WesternBlot一般流程1蛋白樣品的制備轉(zhuǎn)膜7蛋白樣品的制備21、細(xì)胞的處理：1、細(xì)胞計數(shù)，取5*10^4/well，500g離心5min。加入200ulPBS混勻，500g離心5min。去掉廢液加入15ulPBS再加入5ul5Xloading

buffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍離心。2、分泌蛋白的提?。喝?5ul細(xì)胞上清，加入5ul5Xloading

buffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍離心。8蛋白樣品的制備21、細(xì)胞的處理：1、細(xì)胞計數(shù)，取5*10^4大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜9大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜93SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳103SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳104

分離膠濃度與蛋白分離范圍114

分離膠濃度與蛋白分離范圍115

制膠1）裝好架子，固定好玻璃板。2）注水試漏。3）倒水，甩干，用濾紙吸凈殘留水份。

4)按照下面配方配制12%分離膠。一般1.5玻璃板需膠6.5-7ml，1.0玻璃板需膠4.5ml。5)將膠慢慢倒入，防止有氣泡產(chǎn)生。6）在膠上面加入一層蒸餾水，可以將膠里的氣泡壓出、將膠面壓平并防止頂層膠風(fēng)干。

7)待分離膠凝集后（至少20度，30min），配制濃縮膠5％。

125

制膠1）裝好架子，固定好玻璃板。126

制膠過程注意事項操作時要使兩玻璃對其，以免漏膠加完分離膠后，加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。分離膠充分凝固就倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。插梳子時要使梳子保持水平。136

制膠過程注意事項操作時要使兩玻璃對其，以免漏膠137

上樣與電泳將制備好的樣品溶解后，把蛋白樣品直接上樣到SDS膠加樣孔內(nèi)即可。濃縮膠用70V電壓，當(dāng)樣品至分離膠時，用120V電壓，至溴酚蘭跑到底時停止電泳。電泳時常遇到的問題︶條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。

︵條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。

拖尾：樣品溶解不好。

紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。

條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

條帶兩邊擴散：加樣量過多。147

上樣與電泳將制備好的樣品溶解后，把蛋白樣品直接上樣到SD8

轉(zhuǎn)膜在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。

膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa)。

槽式濕轉(zhuǎn)法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中。-/海綿/濾紙/膠/膜/濾紙/海綿/+158

轉(zhuǎn)膜在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。

半干轉(zhuǎn)移法即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移時間短，效率高。-/濾紙/膠/膜/濾紙/+916

半干轉(zhuǎn)移法即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通10

半干轉(zhuǎn)移步驟（1）從陽極（下）到陰極（上）方向依次：濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙，呈三明治樣。在加有轉(zhuǎn)膜液的盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、濾紙和浸過的膜。（2）將陽極（下）打開使保持水平。在上面墊兩張厚濾紙，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（3）輕輕將小玻璃板撬掉，再將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠，并根據(jù)膠的大小裁剪同樣大小PVDF膜，剪去膜的左上角作為標(biāo)記。如果樣本多，同時做幾張膜，可用鉛筆在膜下角標(biāo)ABCD或1234，這樣可以分出膜的正反和加樣順序。注意：裁濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將裁好的PVDF膜置于甲醇中浸2min才可使用。（4）先把PVDF膜蓋在2層濾紙并除去氣泡,再把膠蓋在膜上，最后蓋上另2張濾紙，搟幾下蓋上陰極蓋子。整個操作在轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。（5）將盒子放入轉(zhuǎn)膜槽中，轉(zhuǎn)膜時會產(chǎn)熱，打開電源，設(shè)置mA和時間轉(zhuǎn)膜時間。1710

半干轉(zhuǎn)移步驟（1）從陽極（下）到陰極（上）方向依次：濾

轉(zhuǎn)膜條件推薦：25V，1.0A，25min。（適合本實驗室半干轉(zhuǎn)移條件）轉(zhuǎn)膜注意事項：濾紙、膠、膜之間不能有氣泡產(chǎn)生濾紙、膠、膜的大小和擺放順序膠和膜上要做好標(biāo)記，識別正反面和上下PVDF膜需要100%甲醇預(yù)處理，后續(xù)操作中膜必須保持濕潤1118

轉(zhuǎn)膜條件推薦：25V，1.0A，25min。（適合本實驗室1、封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。

2、常用的封閉液有bovineserumalbumin(BSA)，non-fatmilk，casein，gelatin，tween-20等，我們一般用non-fatmilk。

3、在轉(zhuǎn)移結(jié)束前配好5%的Milk(TBST溶解)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后將膜放入milk中block(一定要放在干凈的容器里，避免污染而且要足以覆蓋膜)，4C過夜。

4、封閉后可以不洗膜，讓膜的一角在吸水紙上接觸，把封閉液控一下即可5、Tween-20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結(jié)合。

12封閉191、封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和1、先將需要檢測的抗體準(zhǔn)備好，并決定好它們的稀釋度。

2、配好1%的Milk(TBST溶解)，按要求稀釋好抗體。注意，如需高比例稀釋，最好采用梯度稀釋。

3、將稀釋好的抗體和膜一起放在密閉的自封袋或抗體盒中，100rpm搖動孵育。一般采用RT1小時。洗膜

用TBST搖動洗三次，每次10min。洗滌是為了洗去一抗與抗原的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺。

12一抗雜交201、先將需要檢測的抗體準(zhǔn)備好，并決定好它們的稀釋度。

2、配13二抗雜交1、將PVDF膜放在密閉的自封袋或抗體盒中，加入稀釋好的熒光二抗，孵育RT0.5小時。（

一般采用HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例參照說明書）

注：二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導(dǎo)致非特異性的結(jié)合。

洗膜去掉二抗稀釋液，加入TBST液，在測擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10min。吸盡洗滌液后再加入洗滌液洗滌5-10min。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。2113二抗雜交1、將PVDF膜放在密閉的自封袋或抗體盒中，加入1、用平頭鑷子取出膜，放入已配制好的BeyoECLStar工作液中（BeyoECLStar工作液應(yīng)提前取出放置室溫）放置1-2min。2、取膜，棄去BeyoECLStar工作液，將膜放置在自封袋中間，隨后進(jìn)行凝膠成像儀發(fā)光檢測。

14底物顯色：化學(xué)發(fā)光法（ECL）221、用平頭鑷子取出膜，放入已配制好的BeyoECLStar4Westernblot常見問題分析可能遇到的問題及解決途徑（1）沒有特異蛋白帶出現(xiàn)：①檢查蛋白樣品是否降解；②麗春紅對膜染色，查看轉(zhuǎn)印效果；③逐一驗證所用抗體的有效性；④檢查顯色體系。（2）非特異條帶出現(xiàn)：①封閉不好②抗體濃度過大，適當(dāng)減少抗體用量；③抗體特異性不好。（3）整張膜背景深：①封閉不好②抗體濃度過大，適當(dāng)減少抗體用量，③膜在實驗過程中干過。（4）條帶彌散：①電泳分離效果不好，可能是膠凝得不充分；②電流不穩(wěn)定也有可能導(dǎo)致條帶不均勻。（5）結(jié)果中無信號或顯示信號弱：①檢測樣本不表達(dá)目的蛋白②檢測樣本低表達(dá)目的蛋白③轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移④抗體不能識別測試種屬的相關(guān)蛋白⑤二抗與一抗不匹配⑥洗膜過度234Westernblot常見問題分析可能遇到的問題及解決1

其他現(xiàn)象1）膜上多處出現(xiàn)黑點或黑斑?原因：抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合。??2）蛋白分子量偏低或偏高?原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。241

其他現(xiàn)象1）膜上多處出現(xiàn)黑點或黑斑?原因：抗體與封閉試劑1

注意事項1）電泳加樣前樣品應(yīng)先離心,尤其是長時間放置的樣品,以減少蛋白質(zhì)帶的拖尾現(xiàn)象。??2）為避免邊緣效應(yīng),可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。3）樣品緩沖液中煮沸的樣品可在-20℃存放數(shù)月,但是反復(fù)凍融會使蛋白質(zhì)降解。4)為減少蛋白質(zhì)條帶的擴散,上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印。5)上樣時,小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。?6）?取出凝膠后應(yīng)注意分清上下,可用刀片切去凝膠的一角作為標(biāo)記(如左上角)轉(zhuǎn)膜時也應(yīng)用同樣的方法對pvdf膜做上標(biāo)記(如左上角)以分清正反面和上下關(guān)系。

7)轉(zhuǎn)膜時，一定要將三明治各層之間的氣泡趕干凈，否則轉(zhuǎn)膜時產(chǎn)熱量會很大，很影響轉(zhuǎn)膜效率。8）轉(zhuǎn)膜完，可以通過預(yù)染marker看看轉(zhuǎn)膜的情況。有沒有轉(zhuǎn)過了穿到膜后的濾紙上，或者還有部分殘留在膠上。以便下次調(diào)整轉(zhuǎn)膜時間和電壓。9）二抗?jié)舛炔灰颂叻駝t會導(dǎo)致背景過高。251

注意事項1）電泳加樣前樣品應(yīng)先離心,尤其是長時間放置的樣Westernblot實驗原理和實驗步驟Westernblot實驗原理和實驗步驟26為什么要做蛋白質(zhì)印跡實驗？

研究一些體外的蛋白質(zhì)分子，尋找目的蛋白是否存在樣品當(dāng)中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，在不同的樣品中，樣品之間的表達(dá)差異性。27為什么要做蛋白質(zhì)印跡實驗？

21Westernblot基本原理蛋白免疫印跡的組成Western

blot一般流程Westernblot常見問題分析281Westernblot基本原理蛋白免疫印跡的組成We1WesternBlot基本原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。SDS可對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到固相載體——例如PVDF膜上。固相載體可以吸附蛋白質(zhì)，并保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜就稱為一個印跡（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液）處理，封閉PVDF膜上的疏水結(jié)合位點。用目標(biāo)蛋白的抗體（一抗）處理PVDF膜——只有待研究的蛋白質(zhì)才能與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，只有在目標(biāo)蛋白的位置上結(jié)合著一抗。用一抗處理過的PVDF膜再用標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。291WesternBlot基本原理WesternBlot采用2組成蛋白免疫印跡（Westernblotting或Immunoblotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測三個部分組成。第一步:是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步：把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移電泳），它又有半干法和濕法之分，電轉(zhuǎn)移主要方法有垂直的槽式和水平的半干式兩種。第三步：是用自特異性的抗體檢測出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測的方法可以是直接的和間接的?，F(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)的方法，在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體（堿性磷酸酶（知AP）或辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗第一抗體的抗體）雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來道顯示抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的檢測中。302組成蛋白免疫印跡（Westernblotting或I3Westernblot流程圖313Westernblot流程圖6WesternBlot一般流程1蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交洗膜二抗雜交洗膜底物顯色32WesternBlot一般流程1蛋白樣品的制備轉(zhuǎn)膜7蛋白樣品的制備21、細(xì)胞的處理：1、細(xì)胞計數(shù)，取5*10^4/well，500g離心5min。加入200ulPBS混勻，500g離心5min。去掉廢液加入15ulPBS再加入5ul5Xloading

buffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍離心。2、分泌蛋白的提?。喝?5ul細(xì)胞上清，加入5ul5Xloading

buffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍離心。33蛋白樣品的制備21、細(xì)胞的處理：1、細(xì)胞計數(shù)，取5*10^4大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜34大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜93SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳353SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳104

分離膠濃度與蛋白分離范圍364

分離膠濃度與蛋白分離范圍115

制膠1）裝好架子，固定好玻璃板。2）注水試漏。3）倒水，甩干，用濾紙吸凈殘留水份。

4)按照下面配方配制12%分離膠。一般1.5玻璃板需膠6.5-7ml，1.0玻璃板需膠4.5ml。5)將膠慢慢倒入，防止有氣泡產(chǎn)生。6）在膠上面加入一層蒸餾水，可以將膠里的氣泡壓出、將膠面壓平并防止頂層膠風(fēng)干。

7)待分離膠凝集后（至少20度，30min），配制濃縮膠5％。

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制膠1）裝好架子，固定好玻璃板。126

制膠過程注意事項操作時要使兩玻璃對其，以免漏膠加完分離膠后，加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。分離膠充分凝固就倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。插梳子時要使梳子保持水平。386

制膠過程注意事項操作時要使兩玻璃對其，以免漏膠137

上樣與電泳將制備好的樣品溶解后，把蛋白樣品直接上樣到SDS膠加樣孔內(nèi)即可。濃縮膠用70V電壓，當(dāng)樣品至分離膠時，用120V電壓，至溴酚蘭跑到底時停止電泳。電泳時常遇到的問題︶條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。

︵條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。

拖尾：樣品溶解不好。

紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。

條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

條帶兩邊擴散：加樣量過多。397

上樣與電泳將制備好的樣品溶解后，把蛋白樣品直接上樣到SD8

轉(zhuǎn)膜在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。

膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa)。

槽式濕轉(zhuǎn)法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中。-/海綿/濾紙/膠/膜/濾紙/海綿/+408

轉(zhuǎn)膜在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。

半干轉(zhuǎn)移法即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移時間短，效率高。-/濾紙/膠/膜/濾紙/+941

半干轉(zhuǎn)移法即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通10

半干轉(zhuǎn)移步驟（1）從陽極（下）到陰極（上）方向依次：濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙，呈三明治樣。在加有轉(zhuǎn)膜液的盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、濾紙和浸過的膜。（2）將陽極（下）打開使保持水平。在上面墊兩張厚濾紙，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（3）輕輕將小玻璃板撬掉，再將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠，并根據(jù)膠的大小裁剪同樣大小PVDF膜，剪去膜的左上角作為標(biāo)記。如果樣本多，同時做幾張膜，可用鉛筆在膜下角標(biāo)ABCD或1234，這樣可以分出膜的正反和加樣順序。注意：裁濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將裁好的PVDF膜置于甲醇中浸2min才可使用。（4）先把PVDF膜蓋在2層濾紙并除去氣泡,再把膠蓋在膜上，最后蓋上另2張濾紙，搟幾下蓋上陰極蓋子。整個操作在轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。（5）將盒子放入轉(zhuǎn)膜槽中，轉(zhuǎn)膜時會產(chǎn)熱，打開電源，設(shè)置mA和時間轉(zhuǎn)膜時間。4210

半干轉(zhuǎn)移步驟（1）從陽極（下）到陰極（上）方向依次：濾

轉(zhuǎn)膜條件推薦：25V，1.0A，25min。（適合本實驗室半干轉(zhuǎn)移條件）轉(zhuǎn)膜注意事項：濾紙、膠、膜之間不能有氣泡產(chǎn)生濾紙、膠、膜的大小和擺放順序膠和膜上要做好標(biāo)記，識別正反面和上下PVDF膜需要100%甲醇預(yù)處理，后續(xù)操作中膜必須保持濕潤1143

轉(zhuǎn)膜條件推薦：25V，1.0A，25min。（適合本實驗室1、封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。

2、常用的封閉液有bovineserumalbumin(BSA)，non-fatmilk，casein，gelatin，tween-20等，我們一般用non-fatmilk。

3、在轉(zhuǎn)移結(jié)束前配好5%的Milk(TBST溶解)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后將膜放入milk中block(一定要放在干凈的容器里，避免污染而且要足以覆蓋膜)，4C過夜。

4、封閉后可以不洗膜，讓膜的一角在吸水紙上接觸，把封閉液控一下即可5、Tween-20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結(jié)合。

12封閉441、封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和1、先將需要檢測的抗體準(zhǔn)備好，并決定好它們的稀釋度。

2、配好1%的Milk(TBST溶解)，按要求稀釋好抗體。注意，如需高比例稀釋，最好采用梯度稀釋。

3、將稀釋好的抗體和膜一起放在密閉的自封袋或抗體盒中，100rpm搖動孵育。一般采用RT1小時。洗膜

用TBST搖動洗三次，每次10min。洗滌是為了洗去一抗與抗原的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺。

12一抗雜交451、先將需要檢測的抗體準(zhǔn)備好，并決定好它們的稀釋度。

2、配13二抗雜交1、將PVDF膜放在密閉的自封袋或抗體盒中，加入稀釋好的熒光二抗，孵育RT0.5小時。（

一般采用HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例參照說明書）

注：二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導(dǎo)致非特異性的結(jié)合。

洗膜去掉二抗稀釋液，加入TBST液，在測擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10min。吸盡洗滌液后再加入洗滌液洗滌5-10min。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。4613二抗雜交1、將PVDF膜放在密閉的自封袋或抗體盒中，加入1、用平頭鑷子取出膜，放入已配制好的BeyoECLStar工作液中（BeyoECLStar工作液應(yīng)提前取出放置室溫）