素材：紅細(xì)胞膜提取及成分測定 高一上學(xué)期生物人教版必修1

紅細(xì)胞膜提取及成分測定細(xì)胞膜有著重要的生物學(xué)功能性。如物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換、細(xì)胞識別、細(xì)胞免疫、代謝調(diào)控、腫瘤發(fā)生等均與細(xì)胞膜有關(guān)，因此生物膜的研究已成為當(dāng)前分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)中的一個重要研究方向。

隨著生物膜研究的迅速發(fā)展，在膜的結(jié)構(gòu)及功能的研究中分離和鑒定生物膜常常是必要的。為進(jìn)行膜結(jié)構(gòu)的生物化學(xué)分析，必須首先分離出純凈的細(xì)胞膜。

高中生物學(xué)練習(xí)中，經(jīng)常有許多關(guān)于細(xì)胞膜的成分的鑒定，如蛋白質(zhì)的鑒定需要用雙縮脲試劑，但事實上還有多種方法，甚至更好的方法，如下內(nèi)容所示。試題中用丙酮提取磷脂，事實上最常用的方法是氯仿－甲醇提取膜磷脂。試題中用本尼迪特試劑測定膜上的還原糖，但本人覺得應(yīng)該用蒽酮比色法是一個快速而簡便的測定可溶性糖方法。因為糖類并不都是還原糖，況且量又是極少的。由上可知，要鑒定細(xì)胞膜的成分命題時，還是需要考慮科學(xué)性和實際性。

紅細(xì)胞膜的提取

1.實驗原理哺乳動物成熟的紅細(xì)胞膜在分離狀態(tài)下。一般稱為“血影”，其沒有通常真核生物細(xì)胞內(nèi)所含有的任何細(xì)胞器，經(jīng)過制備，容易得到純粹的細(xì)胞膜，并且在取材方面來源方便，因此哺乳動物的紅細(xì)胞膜是研究細(xì)胞膜的好材料。從哺乳動物紅細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)膜。第一步：將血液取放在加有抗凝劑的容器內(nèi)，用低速離心的方法從血液中分離出紅細(xì)胞，然后用等滲緩沖液重復(fù)洗滌多次，去除血漿。第二步：將洗凈的紅細(xì)胞從等滲緩沖液轉(zhuǎn)移到低滲緩沖液中，由于滲透壓力作用于細(xì)胞質(zhì)膜，使紅細(xì)胞膨脹而溶血。第三步：將溶血的紅細(xì)胞經(jīng)過充分反復(fù)洗滌。高速離心，去除血紅蛋白和其他細(xì)胞內(nèi)含物。這樣制備所獲得的最終產(chǎn)品幾乎全是紅細(xì)胞膜。2.儀器、試驗材料和試劑儀器：冷凍離心機、冰箱、自動移液管、相差顯微鏡、冷凍干燥機等。原料：哺乳動物的血液。試劑：（1）pH7.4等滲磷酸鹽緩沖液(含有0.15mol/L氯化鈉的5mL，pH7.4磷酸鹽緩沖液)：貯液A：稱取0.7808磷酸二氫鈉溶于水，定容至1000mL；貯液B：稱取3.5828磷酸氫二鈉溶于水，定容至2000mL；取380mL貯液A加1620mL貯液B，用少量濃鹽酸調(diào)pH至7.4。再稱取17.5g氯化鈉加入其中。（2）pH7.4低滲tris緩沖液(10mmol/LpH7.4Tris-鹽酸緩沖液)：貯液A：稱取2.42gTis，溶于水，稀釋至500mL；貯液B：取0.84mL36％一38％鹽酸，稀釋至100mL；取500mL貯液A加414mL貯液B，用水稀釋至近于2000mL，用6mol/L鹽酸調(diào)pH7.4，再定容到2000mL。（3）肝素－pH7.4等滲磷酸鹽緩沖液：將肝素溶于pH7.4低滲Tris緩沖液中，使每毫升含肝素500單位。3.操作步驟（1）血液的收集及洗滌將血液收集在含有抗凝劑的容器中，每30mL血液加約5mL肝素－pH7.4等滲磷酸鹽緩沖溶液。為避免膜上含有的或膜上吸附的蛋白酶使膜蛋白發(fā)生變化，以下操作應(yīng)在－4℃低溫下進(jìn)行。取30mL血液，于冷凍離心機(4℃)中3000r/min離心20min，使紅細(xì)胞沉淀，用吸管吸盡血漿及沉淀的紅細(xì)胞表層的絨毛狀沉淀層，以避免其他類型細(xì)胞的混入。將紅細(xì)胞置于3倍量預(yù)冷的pH7.4等滲磷酸鹽緩沖液中，用玻璃棒緩慢地攪拌懸浮，4℃5000r/min離心15min，除去上清液及沉淀表層，重復(fù)洗滌3次。（2）溶血和紅細(xì)胞膜的洗滌在洗凈的紅細(xì)胞中，按照1:40的比例加入預(yù)冷的10mmol/LpH7.4低滲Tris(三羥甲基氨基甲烷)－HCl緩沖液，邊加邊緩慢攪拌，置于4℃冰箱中1～2h，使之完成溶血。然后于4℃9000r/min離心15min，使紅細(xì)胞膜沉淀。重復(fù)洗滌、離心3～5次，最后獲得白色的紅細(xì)胞膜樣品。注意：①溶血時低滲緩沖液的用量越大，紅細(xì)胞膜中血紅蛋白的殘留量越少，但體積大，離心費時間。因此，紅細(xì)胞與緩沖液的容量比例，以1:40為宜。②膜的重量很輕，在溶血后離心傾倒上清液時容易流走，因此要特別小心，盡可能防止膜的損失。③在制備過程中，若pH值降低，殘留的血紅蛋白會迅速增加。當(dāng)pH保持在7.4時，紅細(xì)胞膜中的血紅蛋白含量僅占總蛋白量的3～5%，相當(dāng)于血液中總血紅蛋白的0.1%。但pH值降低至7.0時，血紅蛋白增加至20%。④上述方法適用于大白鼠和人紅細(xì)胞膜的分離。牛、豬等紅細(xì)胞膜的制備，若反復(fù)進(jìn)行低滲處理，將造成膜外表面包含具有乙酰膽堿酯酶活性的酯蛋白脫落，使膜容易破碎，得不到較完整的膜樣品。若在低滲緩沖液中加入1mmoL氯化鈣，即可完全防止這種膜的不穩(wěn)定性。細(xì)胞膜成分的測定

細(xì)胞膜主要由脂類物質(zhì)和蛋白質(zhì)兩部分組成。膜脂主要有三種類型，即磷脂、膽固醇和糖脂。首先通過紅細(xì)胞膜制備，然后對膜蛋白、膽固醇、磷脂進(jìn)行測定。紅細(xì)胞膜成分測定：（1）采用Folin－Phenol法測定膜總蛋白目前蛋白質(zhì)含量測定有兩類方法，一類是利用蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，如折射率、比重、紫外吸收等測定得知；另一類是利用化學(xué)方法測定蛋白質(zhì)含量，如微量凱氏定氮、雙縮脲反應(yīng)、Folin-phenol試劑法。Folin-phenol法的優(yōu)點是操作簡單，迅速，不需特殊儀器設(shè)備，靈敏度高，較紫外吸收法靈敏10-20倍，較雙縮脲法靈敏100倍，反應(yīng)約在15min內(nèi)有最大顯色，并至少可穩(wěn)定幾小時。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素千擾。在測試時應(yīng)排除千擾因素或做空白試驗消除。Folin-phenol試劑可由A試劑與B試劑組成。A試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡(luò)合物。B試劑是由磷鋁酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基還原呈藍(lán)色反應(yīng)，其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法也適用于測定酪氨酸與色氨酸含量。本法可測定范圍是25-250μg蛋白質(zhì)。（2）用氯仿－甲醇提取膜磷脂，然后測定磷將試樣分散于氯仿-甲醇混合液中，在水浴中輕微沸騰，氯仿-甲醇及樣品中一定的水分形成提取脂類的溶劑，在使樣品中組織中結(jié)合態(tài)脂類游離出來的同時與磷脂等極性脂類的親和性增大，從而有效地提取出全部脂類，經(jīng)過濾除出非脂成分，回收溶劑，對殘留脂類用石油醚提取，蒸去石油醚后定量。測定磷的方法有多種，如稱量法和比色法等。（3）用酶法測定膽固醇含量具體的方法有許多，可以參考相關(guān)的文獻(xiàn)。例題：在對細(xì)胞膜的早期研究中，有一些很重要的實驗為人們認(rèn)識細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)提供了依據(jù)。（1）19世紀(jì)末，有人曾用500多種化學(xué)物質(zhì)對細(xì)胞的透性進(jìn)行過上萬次的實驗，發(fā)現(xiàn)脂溶性的化合物容易進(jìn)入細(xì)胞，對此合理的解釋為

。（2）1925年，荷蘭的兩位科學(xué)家用丙酮從人體成熟的紅細(xì)胞膜中提取出脂類物質(zhì)，然后將提取的脂類物質(zhì)放在槽中制備出單分子層，經(jīng)測量脂類單