HBV-DNA定量檢測課件

HBVDNA定量檢測

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院xx1謝謝觀賞2019-6-13HBVDNA定量檢測

PCR基因的原理

一、PCR技術(shù)的發(fā)展及原理1971年，Kleppe等人首次在文章中準(zhǔn)確、客觀地闡述了PCR方法。1985年，美國PE-Cetus公司的KaryMullis等人發(fā)明PCR技術(shù)。2謝謝觀賞2019-6-13PCR基因的原理一、PCR技術(shù)的發(fā)展及原理2謝謝觀賞20PCR原理PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)“變性→退火→引物延伸”過程至25-40個循環(huán)，呈指數(shù)級擴(kuò)大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)。3謝謝觀賞2019-6-13PCR原理PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解PCR的基本原理4謝謝觀賞2019-6-13PCR的基本原理4謝謝觀賞2019-6-13PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀工作關(guān)鍵是溫度控制

5謝謝觀賞2019-6-13PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理5謝謝觀技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實地反映了體系中模板的增加，通過檢測熒光信號，從而實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。熒光實時定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）6謝謝觀賞2019-6-13技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的熒光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又稱實時PCR，是目前較精確的進(jìn)行定量檢測PCR的方法FQ-PCR通過熒光信號對PCR過程中產(chǎn)物量進(jìn)行實時監(jiān)測，精確計算出PCR的初始模板量7謝謝觀賞2019-6-13熒光定量PCR（fluorescencequantitat熒光定量PCR是融合了PCR高靈敏性、DNA雜交高特異性和光譜分析的精確性，直接檢測擴(kuò)增過程中雙鏈DNA熒光信號的變化以獲得定量的結(jié)果。系統(tǒng)內(nèi)裝置有半導(dǎo)體PCR、鹵鎢燈光源激發(fā)熒光信號、光柵分光、超低溫光電耦合器（CCD）攝象機(jī)收集熒光信號、計算機(jī)軟件分析系統(tǒng)等。8謝謝觀賞2019-6-13熒光定量PCR是融合了PCR高靈敏性、DNA雜交高特異性和光9謝謝觀賞2019-6-139謝謝觀賞2019-6-1310謝謝觀賞2019-6-1310謝謝觀賞2019-6-1311謝謝觀賞2019-6-1311謝謝觀賞2019-6-13熒光定量PCR檢測的是樣本的初始濃度，而準(zhǔn)確測定初始濃度需要在對數(shù)期進(jìn)行。Thesoftwaredisplaysthefluorescencesignalsinreal-timeimmediatelyaftereachmeasurement.Signalsfromthesamplesareobtainedasthemachinepositionsthecapillariessequentiallyovertheopticalunit.Duringthermalcycling,fluorescencecanbemeasuredoncepercycleforeverycapillaryandthefluorescencevaluesaredisplayedimmediatelyonthescreenandupdatedaftereverycycle(Fig.3).Thegenerateddataarestoredforfurtheranalysis.

熒光定量PCR在每一次循環(huán)后對進(jìn)行實時監(jiān)控，因此能最準(zhǔn)確反映出對數(shù)期。確定準(zhǔn)確的初始濃度。軟件系統(tǒng)可以進(jìn)行參數(shù)設(shè)定、保存數(shù)據(jù)和報告結(jié)果，并將結(jié)果自動保存在計算機(jī)中。12謝謝觀賞2019-6-13熒光定量PCR檢測的是樣本的初始濃度，而準(zhǔn)確測定初始濃度需要相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。

13謝謝觀賞2019-6-13相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。13謝謝觀賞2019-①熒光定量技術(shù)要求在低濃度壞境。因為熒光檢測定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立的。如果分子濃度高了，影響作用很復(fù)雜，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是高濃度的，因此重復(fù)性變差也很容易理解。②由于擴(kuò)增末期，擴(kuò)增效率可能因為大量的靶序列而產(chǎn)生不可控的影響。14謝謝觀賞2019-6-13①熒光定量技術(shù)要求在低濃度壞境。因為熒光檢測定量原理是在忽略

Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值分析實際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，所以具有良好的重現(xiàn)性。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。15謝謝觀賞2019-6-13Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。16謝謝觀賞2019-6-13利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始熒光信號的檢測方法：1、DNA結(jié)合染料技術(shù)2、水解探針技術(shù)（TaqManprobe）技術(shù)3、雜交探針技術(shù)4、分子信標(biāo)17謝謝觀賞2019-6-13熒光信號的檢測方法：17謝謝觀賞2019-6-13ThebiggestdisadvantageofSYBRisthatitbindstoanydsDNA;thespecificproduct,non-specificproductsandprimerdimersaredetectedequallywell.

TheLightCyclerInstrumentallowsmeltingcurveanalysisOncethemeltingpointoftheproducthasbeendeterminedtheLightCyclerInstrument'sflexibleprogrammingallowstheusertoacquirefluorescenceabovethemeltingtemperatureoftheprimerdimers,butbelowthemeltingtemperatureoftheproduct.

缺點：存在非特異性產(chǎn)物，可以與非特異性產(chǎn)物，甚至引物二聚體結(jié)合發(fā)出熒光?？梢允褂萌埸c曲線分析進(jìn)行鑒別，明顯提高診斷的特異性。（F1通道）18謝謝觀賞2019-6-13ThebiggestdisadvantageofSY2、TaqMan水解探針技術(shù)19謝謝觀賞2019-6-132、TaqMan水解探針技術(shù)19謝謝觀賞2019-6-1320謝謝觀賞2019-6-1320謝謝觀賞2019-6-1321謝謝觀賞2019-6-1321謝謝觀賞2019-6-1322謝謝觀賞2019-6-1322謝謝觀賞2019-6-13雜交探針技術(shù)對PCR產(chǎn)物定量又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET需要一對引物和一對探針，探針A的3`端為熒光染料供體；探針B的5`端作為熒光染料受體。2個探針首尾相連，僅差一個堿基。檢測在退火時進(jìn)行。23謝謝觀賞2019-6-13雜交探針技術(shù)對PCR產(chǎn)物定量又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET2AdvantagesoftheLightCyclerSystemWatchamplificationasitoccurs:real-time,on-linefluorescenceallowsyoutoseetheresultsofeverycycleassoonasPCRproceedsSavetime:extremelyrapidPCR,20minutesfor30cyclesVerifyampliconspecificity:meltingcurveanalysisprovidesdifferentiationbetweenamplificationproductsDetectmutations:changesinthemeltingcurveanalysiscanbeusedtoidentifymutationsMinimizecontamination:amplificationanddetectionareperformedinthesameclosedtube熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點1）定量準(zhǔn)確，實時監(jiān)控2）敏感性和特異性高3）簡單快速，30個循環(huán)20幾分鐘就能夠完成。4）污染可能性小5）不需要常規(guī)的產(chǎn)物后期復(fù)雜處理，直接觀測結(jié)果6）可以進(jìn)行點突變分析，根據(jù)熔點曲線的不同直接分析點突變的情況。24謝謝觀賞2019-6-13AdvantagesoftheLightCyclerFigure3.Mutationdetectionbymeltingcurveanalysis.Toppanel:meltingcurvesofamplifiedgenefragmentsfromwild-typeandmutantindividuals.Bottompanel:negativefirstderivativesofthemeltingcurvesshowingtheuniquemeltingpeakofeachgenotype.Thegenefragmentamplifiedfromtheheterozygousindividualexhibitsameltingcurvewithboththewild-typeandmutantpeaks(redplot).

25謝謝觀賞2019-6-13Figure3.MutationdetectionbHBV的定量檢測標(biāo)本：病人血清200μl檢測：HBV病毒核酸載量檢測樣本：陽性對照、陰性對照、空白對照標(biāo)準(zhǔn)品、病人HBVDNA檢測步驟：HBVDNA提??；熒光定量

PCR；結(jié)果分析定量PCR方法：TaqMan水解探針技術(shù)26謝謝觀賞2019-6-13HBV的定量檢測標(biāo)本：病人血清200μl26謝謝觀賞2019標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線27謝謝觀賞2019-6-13標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線27謝謝觀賞2019-6-13標(biāo)準(zhǔn)曲線28謝謝觀賞2019-6-13標(biāo)準(zhǔn)曲線28謝謝觀賞2019-6-13報告結(jié)果：

HBVDNA拷貝數(shù)/ml，如

6.20×106拷貝數(shù)/ml或6.20E+06

參考范圍：最小檢測值，5×102拷貝數(shù)/ml（5E+02）

29謝謝觀賞2019-6-13報告結(jié)果：HBVDNA拷貝數(shù)/ml，29謝謝觀賞201930謝謝觀賞2019-6-1330謝謝觀賞2019-6-13HBVDNA定量檢測

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院xx31謝謝觀賞2019-6-13HBVDNA定量檢測

PCR基因的原理

一、PCR技術(shù)的發(fā)展及原理1971年，Kleppe等人首次在文章中準(zhǔn)確、客觀地闡述了PCR方法。1985年，美國PE-Cetus公司的KaryMullis等人發(fā)明PCR技術(shù)。32謝謝觀賞2019-6-13PCR基因的原理一、PCR技術(shù)的發(fā)展及原理2謝謝觀賞20PCR原理PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)“變性→退火→引物延伸”過程至25-40個循環(huán)，呈指數(shù)級擴(kuò)大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)。33謝謝觀賞2019-6-13PCR原理PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解PCR的基本原理34謝謝觀賞2019-6-13PCR的基本原理4謝謝觀賞2019-6-13PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀工作關(guān)鍵是溫度控制

35謝謝觀賞2019-6-13PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理5謝謝觀技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實地反映了體系中模板的增加，通過檢測熒光信號，從而實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。熒光實時定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）36謝謝觀賞2019-6-13技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的熒光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又稱實時PCR，是目前較精確的進(jìn)行定量檢測PCR的方法FQ-PCR通過熒光信號對PCR過程中產(chǎn)物量進(jìn)行實時監(jiān)測，精確計算出PCR的初始模板量37謝謝觀賞2019-6-13熒光定量PCR（fluorescencequantitat熒光定量PCR是融合了PCR高靈敏性、DNA雜交高特異性和光譜分析的精確性，直接檢測擴(kuò)增過程中雙鏈DNA熒光信號的變化以獲得定量的結(jié)果。系統(tǒng)內(nèi)裝置有半導(dǎo)體PCR、鹵鎢燈光源激發(fā)熒光信號、光柵分光、超低溫光電耦合器（CCD）攝象機(jī)收集熒光信號、計算機(jī)軟件分析系統(tǒng)等。38謝謝觀賞2019-6-13熒光定量PCR是融合了PCR高靈敏性、DNA雜交高特異性和光39謝謝觀賞2019-6-139謝謝觀賞2019-6-1340謝謝觀賞2019-6-1310謝謝觀賞2019-6-1341謝謝觀賞2019-6-1311謝謝觀賞2019-6-13熒光定量PCR檢測的是樣本的初始濃度，而準(zhǔn)確測定初始濃度需要在對數(shù)期進(jìn)行。Thesoftwaredisplaysthefluorescencesignalsinreal-timeimmediatelyaftereachmeasurement.Signalsfromthesamplesareobtainedasthemachinepositionsthecapillariessequentiallyovertheopticalunit.Duringthermalcycling,fluorescencecanbemeasuredoncepercycleforeverycapillaryandthefluorescencevaluesaredisplayedimmediatelyonthescreenandupdatedaftereverycycle(Fig.3).Thegenerateddataarestoredforfurtheranalysis.

熒光定量PCR在每一次循環(huán)后對進(jìn)行實時監(jiān)控，因此能最準(zhǔn)確反映出對數(shù)期。確定準(zhǔn)確的初始濃度。軟件系統(tǒng)可以進(jìn)行參數(shù)設(shè)定、保存數(shù)據(jù)和報告結(jié)果，并將結(jié)果自動保存在計算機(jī)中。42謝謝觀賞2019-6-13熒光定量PCR檢測的是樣本的初始濃度，而準(zhǔn)確測定初始濃度需要相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。

43謝謝觀賞2019-6-13相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。13謝謝觀賞2019-①熒光定量技術(shù)要求在低濃度壞境。因為熒光檢測定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立的。如果分子濃度高了，影響作用很復(fù)雜，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是高濃度的，因此重復(fù)性變差也很容易理解。②由于擴(kuò)增末期，擴(kuò)增效率可能因為大量的靶序列而產(chǎn)生不可控的影響。44謝謝觀賞2019-6-13①熒光定量技術(shù)要求在低濃度壞境。因為熒光檢測定量原理是在忽略

Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值分析實際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，所以具有良好的重現(xiàn)性。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。45謝謝觀賞2019-6-13Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。46謝謝觀賞2019-6-13利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始熒光信號的檢測方法：1、DNA結(jié)合染料技術(shù)2、水解探針技術(shù)（TaqManprobe）技術(shù)3、雜交探針技術(shù)4、分子信標(biāo)47謝謝觀賞2019-6-13熒光信號的檢測方法：17謝謝觀賞2019-6-13ThebiggestdisadvantageofSYBRisthatitbindstoanydsDNA;thespecificproduct,non-specificproductsandprimerdimersaredetectedequallywell.

TheLightCyclerInstrumentallowsmeltingcurveanalysisOncethemeltingpointoftheproducthasbeendeterminedtheLightCyclerInstrument'sflexibleprogrammingallowstheusertoacquirefluorescenceabovethemeltingtemperatureoftheprimerdimers,butbelowthemeltingtemperatureoftheproduct.

缺點：存在非特異性產(chǎn)物，可以與非特異性產(chǎn)物，甚至引物二聚體結(jié)合發(fā)出熒光。可以使用熔點曲線分析進(jìn)行鑒別，明顯提高診斷的特異性。（F1通道）48謝謝觀賞2019-6-13ThebiggestdisadvantageofSY2、TaqMan水解探針技術(shù)49謝謝觀賞2019-6-132、TaqMan水解探針技術(shù)19謝謝觀賞2019-6-1350謝謝觀賞2019-6-1320謝謝觀賞2019-6-1351謝謝觀賞2019-6-1321謝謝觀賞2019-6-1352謝謝觀賞2019-6-1322謝謝觀賞2019-6-13雜交探針技術(shù)對PCR產(chǎn)物定量又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET需要一對引物和一對探針，探針A的3`端為熒光染料供體；探針B的5`端作為熒光染料受體。2個探針首尾相連，僅差一個堿基。檢測在退火時進(jìn)行。53謝謝觀賞2019-6-13雜交探針技術(shù)對PCR產(chǎn)物定量又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET2AdvantagesoftheLightCyclerSystemWatchamplificationasitoccurs:real-time,on-linefluorescenceallowsyoutoseetheresultsofeverycycleassoonasPCRproceedsSavetime:extremelyrapidPCR,20minutesfor30cyclesVerifyampliconspecificity:meltingcurveanalysisprovidesdifferentiationbetweenamplificationproductsDetectmutations:changesinthemeltingcurveanalysiscanbeusedtoidentifymutationsMinimizecontamination:amplificationanddetectionareperformedinthesameclosedtube熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點1）定量準(zhǔn)確，實時監(jiān)控2）敏感性和特異性高3）簡單快速，30個循環(huán)20幾分鐘就能夠完成。4）污染可能性小5）不需要常規(guī)的產(chǎn)物后期復(fù)雜處理，