20151014用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活性的影響

專業(yè)： 姓名： 學(xué)號：3140100477日期：2015.10.07 地點：生物實驗中心成績: ?實驗類型:性質(zhì)檢測課程名稱:生物化學(xué)實驗（甲）成績: ?實驗類型:性質(zhì)檢測實驗名稱：用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活性的影響同組學(xué)生姓名：二、實驗內(nèi)容和原理（必填）四、實驗器材與儀器（必填）六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理八、討論、心得一、實驗?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┒?、實驗?nèi)容和原理（必填）四、實驗器材與儀器（必填）六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理八、討論、心得三、實驗材料與試劑（必填）五、操作方法和實驗步驟（必填）七、實驗結(jié)果與分析（必填）： 一、實驗?zāi)康暮鸵? 1.初步掌握正交試驗設(shè)計法的使用。' 2.運(yùn)用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度和pH值這四種因素對酶活裝二、實驗內(nèi)容和原理訂酶的催化作用是在一定條件下進(jìn)行的，它受多種因素的影響，如酶濃度、底物濃度、溫度、pH值、抑制劑和激活劑等都能影響酶催化的反應(yīng)速度。通常在其他因素恒定的條件下，通過某一因素在一系列變線化條件下的酶活性測定求得該因素的影響，這是單因素的試驗方法。對于多因素的試驗可以通過正交試: 驗設(shè)計法來完成。正交法是借助于正交表，簡化的表格計算，正確分析結(jié)果，找到實驗的最佳條件，分: 清因素的主次，這樣就可以通過比較少的實驗次數(shù)達(dá)到好的實驗效果。實踐證明正交法是一個多、快、: 好、省的方法。目前已廣泛用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)實驗中。: 本實驗運(yùn)用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度、pH值這四個因素對酶活性的影響，并求得在什- 么樣的底物濃度、酶濃度、溫度和pH值時酶的活性最大。三、 實驗材料與試劑1、 實驗材料純化的蔗糖酶（樣品W）2、 實驗試劑⑴5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）；⑵0.2mol/L乙酸緩沖液，pH3.6、4.6、5.6；⑶3,5-二硝基水楊酸試劑；甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2ml10%NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液.甲，乙二溶液相混合即得黃色試劑，貯于棕色瓶中備用，在室溫放置7-10天以后使用。四、 實驗器材與儀器試管及試管架；吸量管；恒溫水浴箱（37°C、50°C、65°C、100°C）；4.可見光分光光度計。五、操作方法和實驗步驟1、實驗設(shè)計⑴、確定試驗因素和水平本實驗取四個因素，即底物濃度［S］、酶濃度［E］、溫度、pH值。每個因素選三個水平，實驗因素和選用水平如表1。表1 因素、水平表作因素、水平表時，各因素的水平，最好不要按大小順序排列。按一般方法，如對四個因素三個水平的各種搭配都要考慮，共需做34=81次試驗，而用正交表只需做9次試驗。⑵、選擇合適的正交表合適的正交表，是指要考察的因素的自由度總和，應(yīng)該不大于所選正交表的總自由度。正交表Ln（tq）L 正交表的代號n——處理數(shù)（試驗次數(shù)）t——水平數(shù)q——因素數(shù)試驗次數(shù)n=q（t-1）+1=4（3—1）+1=9總自由度V總=n-1各列自由度V列=K（該列水平數(shù)）-1例如本實驗選用四個因素，每個因素選三個水平，四個因素各占一列，那么四個因素的自由度分別為：V1=3-1=2，V2=3-1=2，V3=3-1=2，V4=3-1=2。四個因素的自由度總和=V1+V2+V3+V4=8因為各因素自由度總和是8,它沒有超過L9（34）的總自由度=9-1=8。所以選擇正交表L9（34）是適合的。在所選的正交表上進(jìn)行表頭設(shè)計由于本實驗是一項四因素各三水平的試驗，這樣將四個因素依次放在L9（34）的第1，2,3,4列上，這項把因素放入正交表頭的工作，叫做表頭設(shè)計。見表2。正交表都應(yīng)具有以下兩個特性：（1） 在每一列中，各水平出現(xiàn)的次數(shù)相等。即在任何一列中，數(shù)字1和數(shù)字2和數(shù)字3都出現(xiàn)三次（幾個水平就均出現(xiàn)幾次）。（2） 任何兩列中，橫行組成的數(shù)對出現(xiàn)次數(shù)相等，均出現(xiàn)一次（這里有9個不同的數(shù)對，均出現(xiàn)一次）（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、

(2,3)、(3,1)、(3,2)、(3,3),各出現(xiàn)一次。以上這些特點保證了用正交表安排的試驗計劃是均衡搭配的，因此分析數(shù)據(jù)比較方便，可進(jìn)行綜合比較，結(jié)果比較可靠。在所選的正交表上進(jìn)行表頭設(shè)計，見表2。L9表 表2 表頭設(shè)計7素實溫度111112122231333421235223162312ry313283213g332■-.1：2、試驗安排將本實驗的四個因素依次填入L9表的因素1,2,3,4中；再將各列的水平數(shù)用該列因素相應(yīng)的水平寫出來，便可得到下面的試驗安排表(表3)。表中試驗號共9個，表示要做9次試驗，每次試驗的條件如每一縱行所示。如做第一個試驗時［S］是0.5ml,［E］是1.0mL，溫度50°C,pH為3.6。第二個試驗［S］是0.5ml,［E］是0.6mL，溫度37°C,pH為5.6,余類推。

表3試驗安排表實驗號試劑（云"7249160357眺蔗糖溶液［S］0.20.80.50.20.80.50.20.80.2mjol/L已酸縫沖溶酒即］pH5.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH3.61.0pH5.61.0pH4.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH5.61.0蒸帽水0.90.31.00.51.60.61.31.20.23/C預(yù)溫SCl'G預(yù)溫5iniin6S‘G預(yù)溫Smin度寤酶（樣品卬）［E］（作相應(yīng)的預(yù)溫）0.61.00.21.00.20.60.20.61.0［溫度］37心反應(yīng)lOmin反應(yīng)lOmin反應(yīng)10minDNS1111111111OO'CxSjillh蒸愣水555555555另取試管一支作3瞄對照，即加毋蔗糖溶液Q5ml,緩沖液1.9ml°先加DNS1ml搖勻室

溫放置5分鐘后再加入蔗糖酶（樣品IV）0. 勻室溫放置10分鐘，lOOExSmin再加入蒸餡水5ml,混勻后在52Qnm處測光密度值.

六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理表4試驗結(jié)果分析計算表實驗號水平因素1[S](ml)2[E](ml)3溫度（°c）4pH值實驗結(jié)果A520110.511.015013.6210.520.623725.6310.530.236534.6420.211.023734.6520.220.636513.6620.230.215025.6730.811.026525.6830.820.615034.6930.830.223713.6水平試驗結(jié)果總合水平試驗結(jié)果總合水平試驗結(jié)果總合I/3II/3III/3極差七、實驗結(jié)果與分析實驗做好后，把9個數(shù)據(jù)填入表4試驗結(jié)果欄內(nèi)，按表中數(shù)據(jù)計算出各因素的一水平試驗結(jié)果總和、二水平試驗結(jié)果總和、三水平試驗結(jié)果總和，再取平均值（各自被3除）。最后計算極差。極差是指這一列中最好與最壞的之差，從極差的大小就可以看出那個因素對酶活力影響最大，那個影響最小。找出任何條件下酶活力最高。最后作一直觀分析的結(jié)論。以O(shè)D值［|,?,當(dāng)為縱座標(biāo)，因素的水平數(shù)為橫座標(biāo)作圖。*333）最優(yōu)條件的選擇因素：極差最大的因素為影響程度最大