第二節(jié) 高效液相色譜儀

高效液相色譜儀滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校代榮琴高效液相色譜（HPLC）儀又稱高速液相色譜儀、高壓液相色譜儀等，是應(yīng)用高效液相色譜原理，主要用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機(jī)化合物的儀器。優(yōu)點(diǎn)：分離效率高、選擇性好、檢測(cè)靈敏度高和分析速度快等。高效液相色譜儀廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、食品科學(xué)、藥物研究以及環(huán)境研究中。第二節(jié)高效液相色譜儀第二節(jié)高效液相色譜儀一、高效液相色譜儀工作原理高壓輸液泵將儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相泵入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)由進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，并被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內(nèi)。由于樣品液在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)歷多次反復(fù)的吸附-解吸附分配過程，而各組分在流動(dòng)相和固定相中分配系數(shù)不同，其移動(dòng)速度差別較大，因此被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出。通過檢測(cè)器時(shí)樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)并傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)。第二節(jié)高效液相色譜儀第二節(jié)高效液相色譜儀依據(jù)分離機(jī)制差異，HPLC可分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法、分子排阻色譜法。第二節(jié)高效液相色譜儀液固色譜法

使用固體吸附劑。根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而使組分得以分離。分離過程是一個(gè)吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5～10μm。適用于分離分子量200～1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物。第二節(jié)高效液相色譜儀

液液色譜法：根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。根據(jù)極性不同

正相色譜法（NPC）

反相色譜法（RPC）根據(jù)固定相工藝不同

涂布式

化學(xué)鍵合式第二節(jié)高效液相色譜儀離子交換色譜法：固定相是離子交換樹脂，主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。第二節(jié)高效液相色譜儀離子對(duì)色譜法：又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。第二節(jié)高效液相色譜儀分子排阻色譜法：固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。第二節(jié)高效液相色譜儀二、儀器基本結(jié)構(gòu)溶劑輸送系統(tǒng)：儲(chǔ)液器、輸液泵、脫氣裝置和梯度洗脫裝置進(jìn)樣系統(tǒng)：各種進(jìn)樣器分離系統(tǒng)：色譜柱（預(yù)柱、柱溫控制器）檢測(cè)系統(tǒng)：各種檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理與記錄系統(tǒng)：數(shù)據(jù)工作站。第二節(jié)高效液相色譜儀HPLC儀結(jié)構(gòu)框圖第二節(jié)高效液相色譜儀溶劑輸送系統(tǒng)儲(chǔ)液器：一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成；容量為1～2L，用來(lái)貯存流動(dòng)相。須對(duì)溶劑惰性，需經(jīng)常清洗并更換流動(dòng)相。脫氣裝置：去除流動(dòng)相中的氣泡。一般采用真空脫氣機(jī)進(jìn)行在線脫氣。第二節(jié)高效液相色譜儀第二節(jié)高效液相色譜儀輸液泵：是HPLC儀中關(guān)鍵部件之一，其功能是將儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。常使用柱塞往復(fù)泵。第二節(jié)高效液相色譜儀第二節(jié)高效液相色譜儀高壓輸液泵柱塞往復(fù)泵的特點(diǎn)：液缸容積小，易于清洗和更換流動(dòng)相，適于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達(dá)4×107Pa。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來(lái)克服。第二節(jié)高效液相色譜儀梯度洗脫裝置

HPLC有等強(qiáng)度和梯度洗脫兩種方式。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度。梯度洗脫裝置等強(qiáng)度洗脫梯度洗脫第二節(jié)高效液相色譜儀梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）

梯度洗脫裝置原理示意圖液A比例閥A液B比例閥B混合器高壓泵色譜柱液A泵A液B泵B混合器色譜柱(a)外梯度洗脫(b)內(nèi)梯度洗脫第二節(jié)高效液相色譜儀進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。現(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器第二節(jié)高效液相色譜儀六通閥進(jìn)樣示意圖第二節(jié)高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器第二節(jié)高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器示意圖第二節(jié)高效液相色譜儀色譜柱色譜柱：色譜儀的核心部件。柱材質(zhì)：不銹鋼管或玻璃管，內(nèi)徑3-6毫米。

長(zhǎng)度可根據(jù)需要確定。

柱填料分類

液—固：固體吸附劑

液—液：擔(dān)體+固定液第二節(jié)高效液相色譜儀

12345678910色譜柱1－不銹鋼管柱2，7－螺帽3，9－壓圈4，8－密封圈5－不銹鋼過濾片接頭10－細(xì)不銹鋼管第二節(jié)高效液相色譜儀檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的含量變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。HPLC儀的檢測(cè)器要求靈敏度高、噪音低（即對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。第二節(jié)高效液相色譜儀常用檢測(cè)器紫外檢測(cè)器(UVD)：應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器，噪音低，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度均不敏感，適用于梯度洗脫，不破壞樣品。第二節(jié)高效液相色譜儀紫外檢測(cè)器第二節(jié)高效液相色譜儀紫外分光檢測(cè)器第二節(jié)高效液相色譜儀熒光檢測(cè)器（FD）：熒光檢測(cè)器采用激發(fā)光照射樣品，通過光電倍增管檢測(cè)樣品所發(fā)出的熒光（發(fā)射光），記錄色譜圖。熒光檢測(cè)器在選擇性和靈敏度方面優(yōu)于紫外檢測(cè)器。1光電倍增管2發(fā)射濾光片3透鏡4樣品流通池5透鏡6光源7透鏡8激發(fā)濾光片第二節(jié)高效液相色譜儀電化學(xué)檢測(cè)器（ECD）：根據(jù)電化學(xué)原理和物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。在高效液相色譜中對(duì)那些沒有紫外吸收或不能發(fā)出熒光但具有電活性的物質(zhì)，可采用此法。第二節(jié)高效液相色譜儀示差折光檢測(cè)器（DRID）：通過檢測(cè)不同物質(zhì)折射率的變化而進(jìn)行樣品各組分的分析。DRID是一種非選擇性檢測(cè)器，幾乎對(duì)所有被測(cè)對(duì)象均有響應(yīng)，且不破壞被測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)。但靈敏度較低，不適于做痕量分析，不適于梯度洗脫。第二節(jié)高效液相色譜儀數(shù)據(jù)處理與記錄系統(tǒng)運(yùn)用數(shù)據(jù)處理站或工作站處理數(shù)據(jù)。色譜數(shù)據(jù)處理站包括硬件和軟件兩個(gè)部分。除進(jìn)行色譜數(shù)據(jù)處理外，工作站還參與儀器的自動(dòng)控制。第二節(jié)高效液相色譜儀三、儀器操作條件的選擇基質(zhì)（擔(dān)體）陶瓷性質(zhì)的無(wú)機(jī)物基質(zhì)：硅膠和氧化鋁。剛性大，在溶劑中不容易膨脹，傳質(zhì)速度快，柱效高。但其比表面積小，柱容量低，進(jìn)樣量小，要求檢測(cè)器的靈敏度高；第二節(jié)高效液相色譜儀有機(jī)聚合物基質(zhì)：交聯(lián)苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。剛性小、易壓縮，溶劑或溶質(zhì)容易滲入有機(jī)基質(zhì)中，導(dǎo)致填料顆粒膨脹，最終使柱效降低。第二節(jié)高效液相色譜儀基質(zhì)種類及其性質(zhì)硅膠氧化鋁苯乙烯-二乙烯苯甲基丙烯酸酯耐有機(jī)溶劑++++++++++適用pH范圍++++++++抗膨脹/收縮++++++++耐壓+++++++++表面化學(xué)性質(zhì)+++++++++效能+++++++注：+++好++一般+差第二節(jié)高效液相色譜儀化學(xué)鍵合固定相將有機(jī)官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學(xué)鍵合相。鍵合相的性質(zhì)：鍵合相的鍵合量(常用含碳量(C%)來(lái)表示)。硅膠鍵合相應(yīng)在pH2～8的介質(zhì)中使用。鍵合相的種類:極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL);非極性鍵合相主要有各種烷基(C1～C18)和苯基、苯甲基等.第二節(jié)高效液相色譜儀固定相的選擇分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對(duì)雙鍵異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化合物的分離有較好的選擇性.分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相.C18是應(yīng)用最為廣泛的非極性鍵合相，它對(duì)各種類型的化合物都有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。第二節(jié)高效液相色譜儀流動(dòng)相：理想的流動(dòng)相溶劑應(yīng)具備以下特征：不改變填料的性質(zhì)；純度；必須與檢測(cè)器匹配；低粘度；對(duì)樣品較好的溶解度；樣品易于回收，應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。第二節(jié)高效液相色譜儀流動(dòng)相的選擇:在化學(xué)鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關(guān)。在正相色譜中，溶劑的洗脫強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而增加；正相色譜的流動(dòng)相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。

第二節(jié)高效液相色譜儀在反相色譜中，溶劑的洗脫強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而減弱。反相色譜的流動(dòng)相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。甲醇-水系統(tǒng)是反相色譜最常用的流動(dòng)相。乙腈-水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)。但乙腈毒性和價(jià)格均較甲醇高。第二節(jié)高效液相色譜儀HPLC用水HPLC應(yīng)用中要求超純水，如檢測(cè)器基線的校正和反相柱的洗脫。第二節(jié)高效液相色譜儀柱溫色譜柱及某些檢測(cè)器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.5℃之間。溫度對(duì)溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動(dòng)相的粘度都有影響。為保持柱溫的恒定，HPLC一般都配置有柱溫箱。第二節(jié)高效液相色譜儀儀器維護(hù)與故障處理輸液泵1．輸液泵的維護(hù)實(shí)驗(yàn)室常用備件包括墊圈、接頭、凸輪、泵頭、止回閥和連接件等?；钊蛷椈傻炔怀Q。腐蝕性溶劑或緩沖液在泵內(nèi)存放不可過夜，使用腐蝕性物質(zhì)后要沖洗，先用水后用甲醇。第二節(jié)高效液相色譜儀每次更換溶劑都須記錄。避免電機(jī)過熱，帶電機(jī)的泵要定期加油。流動(dòng)相在使用前要脫氣，避免使用揮發(fā)性很大的溶劑（戊烷、乙醚等），防止系統(tǒng)產(chǎn)生氣泡。經(jīng)常檢查壓力限制開關(guān)，檢查流速。第二節(jié)高效液相色譜儀輸液泵常見故障及排除方法既無(wú)壓力指示，又無(wú)液體流過泵密封墊圈磨損，需更換；或有大量氣泡進(jìn)入泵體可在泵工作的同時(shí)，用一個(gè)50mL的玻璃針筒在泵出口處抽氣泡。壓力波動(dòng)大，流量不穩(wěn)定系統(tǒng)中有空氣，排除。第二節(jié)高效液相色譜儀壓力異常升高輸液管被堵塞。多在細(xì)徑的管道和經(jīng)過濾器處發(fā)生堵塞，需及時(shí)清除異物并徹底洗凈。壓力降低系統(tǒng)有泄漏，如進(jìn)樣閥的接頭由于反復(fù)拆裝使不銹鋼墊圈出現(xiàn)刻痕。凡有接頭螺帽處均以擰至不漏液為度，不宜過分?jǐn)Q緊，以免損壞接合處的密封。第二節(jié)高效液相色譜儀進(jìn)樣閥進(jìn)行閥注射孔的導(dǎo)管不宜擰得太緊，否則墊圈被擠壓過度而封死，無(wú)法進(jìn)樣。進(jìn)樣閥的通道十分微細(xì)，樣品須預(yù)先處理，同時(shí)避免注射濃溶液，防止其在進(jìn)樣閥內(nèi)析出結(jié)晶引起堵塞，使系統(tǒng)壓力異常上升。第二節(jié)高效液相色譜儀色譜柱開機(jī)時(shí)，流速和柱壓要逐漸加強(qiáng)，避免柱頭凹陷。在注射樣品前色譜系統(tǒng)須平衡。柱頭不要擰得太緊，過緊易損壞接頭螺紋引起滲漏。第二節(jié)高效液相色譜儀氣流和陽(yáng)光都會(huì)使柱子產(chǎn)生溫度梯度，造成基線漂移。可設(shè)法使柱子絕熱，例如用恒溫爐或恒濕水套使之恒溫，也可用布或毛巾把柱子和接頭包起來(lái)?？膳渲埔桓鶎Ｓ弥米鞒Ｒ?guī)分析，有助于延長(zhǎng)柱子的壽命。若樣品污染柱子，可用適當(dāng)?shù)娜軇◣装俸辽┞龥_柱子過夜。然后再用流動(dòng)相重新平衡柱子30分鐘。第二節(jié)高效液相色譜儀裝卸、更換、貯存需挪動(dòng)柱子時(shí)，動(dòng)作宜輕，不使其受到碰撞，以免柱床因震動(dòng)而產(chǎn)生空隙。使用硅膠為基底的柱子，流動(dòng)相的pH值一般不應(yīng)＞8或＜2，pH＞8會(huì)使硅膠骨架溶解；pH＜2則鍵合相化學(xué)鍵易剝離。第二節(jié)高效液相色譜儀色譜柱在使用過程中，柱壓逐步升高，可能有兩個(gè)原因：柱子被污染或有固體析出造成流路堵塞，固定相顆粒破碎或骨架被溶解。解決的辦法：在分析柱前加一根短保洗柱（內(nèi)徑4×50mm），里面的填料應(yīng)與分析柱相同；避免使用堿性強(qiáng)的流動(dòng)相；如果柱頭部分被污染，可將柱頭部分變色的固定相刮去，另加一些新的作為補(bǔ)充。柱要加標(biāo)簽，新舊分開。第二節(jié)高效液相色譜儀檢測(cè)器

異常峰和噪音更換光源并檢查上述現(xiàn)象是否消失。若流動(dòng)相被污染或混有氣泡，也會(huì)出現(xiàn)相似的情況，應(yīng)去除氣泡?；€漂移樣品池、參比池