副溶血性弧菌檢驗標準操作程序

副溶血性弧菌檢驗標準操作程序副溶血性弧菌檢驗標準操作程序概況副溶血性弧菌于1950年從日本一次暴發(fā)性食物中毒中分離發(fā)現(xiàn)。該菌存在于近海的海水、海底沉積物和魚類、貝殼等海產品中。在37℃、pH7.7、含氯化鈉3～4%的環(huán)境中生長最好。主要引起食物中毒，尤以日本、東南亞、美國及我國臺北地區(qū)多見，也是我國大陸沿海地區(qū)食物中毒中最常見的一種病原菌。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序副溶血性弧菌檢驗標準操作程序副溶血性弧菌檢驗標準操作程序范圍本標準規(guī)定了食品中副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）的檢驗方法。本標準適用于水產品及食物中毒樣品中副溶血性弧菌的檢驗，其他食品可參照使用。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序食品種類動物性水產品：鮮凍水產品（定性檢測）：新鮮水產品和冷凍水產品；生食水產品（定性、定量檢測）：新鮮的、冷藏、冷凍的海水或淡水魚類、甲殼類、貝殼類和軟體動物等，未經腌制、加熱，可以直接食用的。

副溶血性弧菌檢驗標準操作程序設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：?恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。?冰箱：2℃～5℃。?均質器及無菌均質袋、均質杯或滅菌乳缽。?天平：感量0.1g。?無菌試管：18mm×180mm、15mm×100mm。?無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。?無菌錐形瓶：500mL、250mL。?無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。?VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)[1]。?滅菌手術剪、鑷子。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序樣品制備?非冷凍樣品采集后應立即置7℃～10℃冰箱保存，盡可能及早檢驗；冷凍樣品應在45℃以下不超過15min或在2℃～5℃不超過18h解凍；如果樣品需要冷凍貯存，應在樣品中加等量緩沖甘油-氯化鈉溶液（液體樣品應加雙料），推薦貯存溫度為-70℃以下。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序樣品制備魚類和頭足類動物取表面組織、腸或鰓。貝類取全部內容物，包括貝肉和體液；副溶血性弧菌檢驗標準操作程序副溶血性弧菌檢驗標準操作程序副溶血性弧菌檢驗標準操作程序副溶血性弧菌檢驗標準操作程序樣品制備甲殼類取整個動物，或者動物的中心部分，包括腸和鰓。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序副溶血性弧菌檢驗標準操作程序樣品制備如為帶殼貝類或甲殼類，則應先在符合生活飲用水衛(wèi)生標準的流水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無菌操作打開外殼，按上述要求取相應部分。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序樣品制備以無菌操作取檢樣25g（mL），加入3％氯化鈉堿性蛋白胨水225mL，用旋轉刀片式均質器以8000r/min均質1min，或拍擊式均質器拍擊2min，制備成1:10的均勻稀釋液。如無均質器，則將樣品放入無菌乳缽中磨碎，然后放在500mL的滅菌容器內，加225mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水，并充分振蕩。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序增菌定性檢測將上述1:10稀釋液于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序增菌定量檢測用滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內，振搖試管混勻，制備1:100的稀釋液。另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次制備10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。根據食品衛(wèi)生標準要求或對檢樣污染情況的估計，選擇三個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度接種3支含有9mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種1mL。置36℃±1℃恒溫箱內，培養(yǎng)8h～18h。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序分離在所有顯示生長的試管或增菌液中用接種環(huán)沾取一環(huán)，于TCBS平板或科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離。一支試管劃線一塊平板。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序使用TCBS瓊脂劃線不可密集副溶血性弧菌檢驗標準操作程序分離典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈現(xiàn)為圓的、半透明的、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質感，直徑2mm～3mm。從培養(yǎng)箱取出TCBS平板后，應盡快（不超過1h）挑取菌落或標記要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為圓的、半透明的、表面光滑的粉紫色菌落，直徑2mm～3mm。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序TCBS瓊脂上面的副溶血性弧菌副溶血性弧菌檢驗標準操作程序四種顯色培養(yǎng)基副溶血性弧菌檢驗標準操作程序純培養(yǎng)挑取3個或以上的可疑菌落，劃線3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序初步鑒定氧化酶試驗：挑選純培養(yǎng)的單個菌落進行氧化酶試驗，副溶血性弧菌為氧化酶陽性。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序初步鑒定涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序初步鑒定挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，轉種3％氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃±1℃培養(yǎng)24h觀察結果。副溶血性弧菌在3％氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動力。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序TSA＋TTC可以方便觀察副溶血性弧菌動力副溶血性弧菌檢驗標準操作程序初步鑒定嗜鹽性試驗：挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，分別接種于不同氯化鈉濃度的胰胨水中，36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無氯化鈉和10％氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長，在7％氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序確定鑒定生化試驗：分別接種含3％氯化鈉的甘露醇、賴氨酸、MR-VP培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h后觀察結果。隔夜培養(yǎng)物進行ONPG試驗。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序MR-VP試驗副溶血性弧菌檢驗標準操作程序ONPG試驗副溶血性弧菌檢驗標準操作程序確定鑒定API20E生化鑒定試劑盒或VITEK：刮取3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上的單個菌落，用生理鹽水制備成濁度適當?shù)募毎麘腋∫?，使用API20E生化鑒定試劑盒或VITEK鑒定。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序生化特性分解葡萄糖產酸不產氣，不分解乳糖、蔗糖。H2S﹙－﹚、V-P﹙－﹚、動力（＋）。甘露醇（＋）、賴氨酸（＋）、ONPG（－）。副溶血性弧菌檢驗標準操作程序副溶血性弧菌檢驗標準操作程序副溶血性弧菌檢驗標準操作程序報告當檢出的可疑菌落生化學性狀符合表1要求時，可以報告檢出副溶血性弧菌。如果進行定量檢測，根據證實為副溶血性弧菌陽性的試管管數(shù)，查MPN檢索表，報告g