總谷胱甘肽(T-GSH)檢測試劑盒(DTNB速率比色法)

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總谷胱甘肽(T-GSH)檢測試劑盒(DTNB速率比色法)寫為G-SH或GSH(GSSG)，其存在形式會(huì)隨著細(xì)胞內(nèi)代謝的情況而發(fā)生相互轉(zhuǎn)變。(T-GSH(DTNB)(TotalGlutathioneAssay(T-GSHG還原成的H和樣品本身含有的GSH都與發(fā)色底物DTNB反應(yīng)，生成黃色的TNB和GSSG。前后兩個(gè)反應(yīng)合并起來，總谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相當(dāng)于一個(gè)呈色的限速反應(yīng)，總谷胱甘肽(T-GSH)含量決定了黃GSH標(biāo)準(zhǔn)比較，獲得樣品的總谷胱甘肽(T-GSH)即(GSSG+GSH)含量。可用于檢測血漿、血清、組織、細(xì)胞等樣編號(hào)TO1049編號(hào)TO1049Storage名稱100T試劑(A):還原型谷胱甘肽(GSH)標(biāo)準(zhǔn)10mg4℃避光試劑(B):GSHassaybuffer250mlRT試劑(C):DTNB40mgRT避光試劑(D):蛋白沉淀劑4gRT避光試劑(E):NADPH10mg-20℃避光試劑(F):DMSO1.5mlRT避光試劑(G):ddH2O50mlRT避光試劑(H):GSH還原酶原液90μl-20℃避光使用說明書1份自備材料：北京雷根生物技術(shù)有限公司1、離心管或小試管2、蒸餾水3、離心機(jī)4、水浴鍋5、96孔板6、酶標(biāo)儀或生化分析儀操作步驟(僅供參考)：1、配制GSH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液：取還原型谷胱甘肽(GSH)標(biāo)準(zhǔn)加入ddH2O，溶解并混勻，即為還原型GSH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液(10mM)。一部分立即使用，其余適當(dāng)分裝后-20℃保存。2、配制BB中加入儲(chǔ)存液(40mg/ml-20℃保存。3、配制50×GSH還原酶：按GSH還原酶原液：GSHassaybuffer混合，即為50×GSH還原酶。-20℃保存，3個(gè)月有效。4、配制T-GSH檢測工作液：按下表配制T-GSH檢測工作液。GSHassaybuffer1個(gè)樣品1.6ml10個(gè)樣品16ml50個(gè)樣品80mlDTNB儲(chǔ)存液5μl50μl250μl50×GSH還原酶43.2μl432μl2160μl5、配制蛋白沉淀工作液：在本試劑盒提供的蛋白沉淀劑中加入ddH2O，配制成5%的水溶液，即為蛋白沉淀工作液，4℃保存。6、配制標(biāo)準(zhǔn)品：把還原型GSH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液(10mM)用蛋白沉淀工作液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后依次稀釋成25151052μMGSH5025151052μMGSH標(biāo)準(zhǔn)溶液6個(gè)點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：由于GSHGSH7、配制NADPH工作液：在本試劑盒提供的10mgNADPH中加入1mlddH2O，溶解并混勻，即為NADPH儲(chǔ)存液(10mg/ml)。一部分立即使用，其余適當(dāng)分裝后-20℃保存。取按NADPH儲(chǔ)存液(10mg/ml)加入GSHassaybuffer，充分混勻，即為NADPH工作液(0.12mg/ml)。8、準(zhǔn)備樣品：清為血漿。對(duì)于紅細(xì)胞，用PBS洗滌兩次。取約紅細(xì)胞沉淀或血漿，加入蛋白沉淀工Vortex4℃或冰浴放置(T-GSH)測定，樣品需暫時(shí)4℃保存?zhèn)溆?，不立即測定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過1010北京雷根生物技術(shù)有限公司而對(duì)于血漿樣品，應(yīng)直接取進(jìn)行測定。②組織樣品的制備：取組織用液氮速凍，迅速研磨，加入300μl蛋白沉淀工作液，充分x4℃孵育4℃離心10min(T-GSH)測定。樣品需暫時(shí)4℃保存?zhèn)溆茫涣⒓?70℃保存，但不宜超過10天。對(duì)于處理好的組織樣品通常需用蛋白沉淀工作液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定，稀釋倍數(shù)通常為5～20洗滌細(xì)胞1次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。加入細(xì)胞沉淀3倍體積的蛋白沉淀工作液，充分Vortex10ml℃或冰上孵育5min品需暫時(shí)4-7010天。對(duì)于處理好的組織樣品通常需用蛋白沉淀工作液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定室溫或25℃孵育5min。NADPH工作液(0.12mg/ml)室溫或25℃孵育5min。NADPH工作液(0.12mg/ml)加入物(ml)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管蛋白沉淀工作液0.08——系列標(biāo)準(zhǔn)品(2～50μM)—0.08—待測樣品——0.08GSH檢測工作液10、T-GSH檢測：立即用酶標(biāo)儀或自動(dòng)生化分析儀于處每隔檢測一次，空白管調(diào)零，共檢測6min(亦可加入NADPH工作液反應(yīng)6min后檢測，只檢測1次)，以檢測其反應(yīng)速率ΔA/min。如果酶標(biāo)儀不能檢測410nm，可測定405～420nm處吸光度。計(jì)算：①動(dòng)力學(xué)測定法：根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)測定得到的吸光度值計(jì)算出，以GSH標(biāo)準(zhǔn)的濃度(50、25、15、10、5、2μM)為橫坐標(biāo)，以ΔA410/min為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測的的使用量，可以計(jì)算出每毫克組織或細(xì)胞中的總谷胱甘肽的含量，通過測定蛋白濃度，從而計(jì)算出樣品的蛋白量，最后計(jì)算出每mg蛋白中總谷胱甘肽的含量。北京雷根生物技術(shù)有限公司即反應(yīng)6min僅測定1GSH標(biāo)準(zhǔn)的濃度251510、52μM)為橫坐標(biāo)，以為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出總谷胱甘肽的含量。終點(diǎn)測定法比動(dòng)力學(xué)法快捷。根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)mg蛋白中總谷胱甘肽的含量。成年全血GSH1.02～mmol/L成年全血GSH1.02～mmol/L注意事項(xiàng)：1、GSH比較穩(wěn)定，血液樣品以ACD抗凝后冰箱4℃保存，3～4周內(nèi)穩(wěn)定。2、請(qǐng)盡量用新鮮的細(xì)胞進(jìn)行測定，而不要使用凍存的細(xì)胞進(jìn)行測定，避免使酶活性下降。3、全血GSH與吸煙和鍛煉成正比。4、測定各孔時(shí)，各孔溫度均需達(dá)到室溫或25℃，否則影響結(jié)果。5、輕度溶血樣本對(duì)GSH測定無影響。6、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一