感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化(C)

感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化1編輯ppt導(dǎo)入大腸桿菌:

氯化鈣轉(zhuǎn)化法electroporation

電擊法又叫電穿孔法體外包裝感染法重組DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞:DNA-磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體介導(dǎo)法、原生質(zhì)體融合法

酵母菌轉(zhuǎn)化法:

完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法電擊法

2編輯ppt大腸桿菌(Escherichiacoli)大腸桿菌(Escherichiacoli)大約含3000kb的環(huán)狀染色體DNA的棒狀細(xì)菌。革蘭氏陰性、兼性厭氧。最適生長(zhǎng)溫度37℃，PH7.0～7.6(一般7.4)，保存加甘油，培養(yǎng)皿密封。大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線可分為遲緩期(生長(zhǎng)滯后期)、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(20~30min)、穩(wěn)定期(飽和期)，約1×109~2×108/mL和衰老期。3編輯ppt4編輯ppt

大腸桿菌的不同菌株的保存期差別較大。有些菌株在液體培養(yǎng)基中，4℃可保存幾個(gè)月，而有些菌株在相同條件下只能保存幾天。如在相同條件下，大腸桿菌K12株比大腸桿菌X1776株保存期長(zhǎng)。所以菌株首先應(yīng)劃平板分離單個(gè)菌落，經(jīng)擴(kuò)增后再做抗藥性等鑒定，然后應(yīng)用或保存。保存一般用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的細(xì)菌。根據(jù)不同需要做短期、中期或長(zhǎng)期保存。2.菌株的保存5編輯ppt①LB瓊脂平板劃線，37℃，倒置平板培養(yǎng)(16-24hr)，形成單一菌落后，用石臘紙(parafilm)將平皿四周封嚴(yán)(使平皿隔絕空氣)，倒置放入4℃或-20℃冰箱中，可保存數(shù)周。

E.coli菌株的生存期差別大：有些菌株在液體培養(yǎng)基中，4℃能存活幾個(gè)月。有些菌株只能活幾天。②穿刺瓊脂(stabagar)，室溫，避光可保存數(shù)年。③冰凍：?jiǎn)我痪洌后w培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，稀釋后倒入10-50%甘油培養(yǎng)基中，分裝，置-20～

-70℃?？山?jīng)過(guò)30次凍融，細(xì)菌仍然存活。菌LB中過(guò)液培養(yǎng)，加入等體積2×冰凍培養(yǎng)基。液氮速凍后置-70℃，可經(jīng)15次凍融，保存5年以上。具體保存方法：6編輯ppt瓊脂穿刺培養(yǎng)基2×冰凍培養(yǎng)基瓊脂（Difco）6gK2HPO4

12.6g細(xì)菌胰蛋白胨（Difco）10gN++-檸檬酸0.19gNaCl8gMgSO4＞H2O0.18gHCl20mg(NH4)2SO4

1.8gddH2O至1LKH2PO4

3.6g甘油88gdH2O至1L菌株保存液的配制7編輯ppt高壓滅菌 Phagemid -20℃ Enzyme -20℃ Buffers -20℃ Primer -4℃ Thiodeyivatives -20℃ Ribonucleotides -20℃ Helperphage -4℃ 置于—20℃或—80℃，并一個(gè)月檢查一次 8編輯ppt抗生素工作濃度松馳型質(zhì)粒嚴(yán)緊型質(zhì)粒

氨芐青霉素(Amp)50mg/mL（水）60ug/mL20ug/mL

氯霉素(Cm)34mg/mL（乙醇）170ug/mL25ug/mL

卡那霉素(Kan)50ug/mL（水）50ug/mL10ug/mL

鏈霉素(Sm)10mg/mL（水）50ug/mL10ug/mL

四環(huán)素(Tc)5mg/mL（乙醇）50ug/mL10ug/mL抗生素的配制9編輯ppt大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和貯存

在基因工程研究過(guò)程中，常常需要將外源DNA與載體DNA連接，重組后，導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞中，進(jìn)行DNA復(fù)制，擴(kuò)增或表達(dá)，噬菌體單鏈或雙鏈DNA導(dǎo)入大腸桿菌宿主菌中復(fù)制擴(kuò)增。但很久以前人們就試圖將DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌但都沒有成功。因此長(zhǎng)期以來(lái)人們一直認(rèn)為大腸桿菌缺乏天然的轉(zhuǎn)化機(jī)理。1970年M.Mandela和A.Higa提出，在轉(zhuǎn)化DNA之前，預(yù)先用氯化鈣溶液處理大腸桿菌，能夠人為地誘導(dǎo)這些大腸桿菌細(xì)胞呈現(xiàn)感受態(tài)，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。從而提高重組DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化頻率。目前對(duì)這種機(jī)制尚不清楚。10編輯ppt感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)：將質(zhì)粒DNA或重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到宿主菌中之前，必須使細(xì)菌呈感受狀，即有能力攝取DNA的狀態(tài)。(主要介紹用氯化鈣溶液處理大腸桿菌制備感受態(tài)細(xì)胞的方法)①取出大腸桿菌HB101菌種管劃LB瓊脂平板，-70℃保存，37℃過(guò)夜(一般16小時(shí))。②取一個(gè)菌落接種于3~5mlLB培養(yǎng)管中，37℃振培養(yǎng)，過(guò)夜(8~16小時(shí))。③取出1mL過(guò)液菌加入新鮮配制的LB培養(yǎng)液50mL中(2%接種量)。37℃振蕩培養(yǎng)，2~4小時(shí)。測(cè)定光密度值(約5×107個(gè)細(xì)胞/mL)，OD550達(dá)0.3~0.5。注意：不同的大腸桿菌菌株，每mL培養(yǎng)物中細(xì)菌存活數(shù)與光密度值間關(guān)系不同。

HB101，OD600=0.5（約×107個(gè)細(xì)胞/mL）

X1776，OD600=0.2（約×107個(gè)細(xì)胞/mL）11編輯ppt④細(xì)菌培養(yǎng)管取出置水浴中，10~15分鐘。⑤細(xì)菌移入預(yù)冷的離心管中，4℃4000GSA轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)離心5分鐘；棄上清，留沉淀置于冰浴中。⑥加0.1mol/LCaCl2(預(yù)冷)溶液25mL，將沉淀充分懸浮，置冰浴中20~30分鐘。延長(zhǎng)CaCl2處理時(shí)間，可增加感受態(tài)，所以也可在0℃過(guò)夜。⑦4℃，4000~2500rpm轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，留沉淀，置冰浴中。⑧用預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液2.5mL，小心輕輕懸浮沉淀，4℃過(guò)夜。可直接使用。⑨次日加20%(最終濃度)滅菌預(yù)冷甘油。⑩分裝成每Eppendorf管200uL。

新鮮感受態(tài)細(xì)胞用于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化最好。但新鮮感受態(tài)細(xì)胞0℃~4℃貯存不超過(guò)3天。長(zhǎng)期保存，必須將細(xì)胞在-70℃干冰或液氮?dú)怏w部分速凍5分鐘，再置于-80℃冰箱中保存，一般可保存1年。12編輯ppt①

CaCl2處理4℃，0.1M低滲CaCl2處理使細(xì)菌表面的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細(xì)胞壁或局部溶解細(xì)胞壁，俗稱“打孔”，使DNA分子能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。②

CaCl2處理使感受態(tài)細(xì)胞的表面形成一種能接受DNA的酶位點(diǎn)，使DNA分子能進(jìn)入細(xì)胞。在細(xì)菌中能發(fā)展為感受態(tài)細(xì)胞占極小數(shù)，只有感受態(tài)的細(xì)胞才能穩(wěn)定的攝取外來(lái)DNA分子。保持感受態(tài)的時(shí)間約1~2天，一般出現(xiàn)在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的后期。兩種假設(shè)：13編輯ppt5.DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

抗生素

抽濾除菌并均置

-20℃保存。抗生素不耐熱，在加入到瓊脂板中時(shí)，應(yīng)等瓊脂冷至48~50℃時(shí)再加入抗生素

Mg++是四環(huán)素拮抗物，需加MgCl2時(shí)改加NaCl(6g/L)

四環(huán)素光敏感應(yīng)避光保存（1）抗性瓊脂板中抗生素的配制14編輯ppt①感受態(tài)細(xì)胞新鮮配制的或從-80℃凍存取出后置于冰水中融化。②取出分裝到Eppendorf管中，每管100~200uL。③加入需轉(zhuǎn)化的DNA溶液25ul充分混勻(1~5ug/mLDNA)。④冰水中放置30分鐘。⑤37℃或42℃水浴2分鐘。(熱休克)⑥冰浴2min。⑦每管再加入1mLLB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。⑧取出后稍加離心，去掉部分上清，留500uL或250mL

LB則全部鋪板。（2）轉(zhuǎn)化步驟15編輯ppt⑨取100~200uL，置于有選擇性標(biāo)記的瓊脂培養(yǎng)皿上，用無(wú)菌玻璃棒涂勻；靜置5~10分鐘。⑩倒置37℃培養(yǎng)12~18小時(shí)(一般過(guò)夜)；次日，挑選單菌落，擴(kuò)增，提取DNA酶切，電泳檢測(cè)，篩選重組子。

并設(shè)下列對(duì)照：A．不加需轉(zhuǎn)化的DNA溶液（用蒸餾水或LB培養(yǎng)基代替）。B．用普通LB瓊脂平板代替有選擇性標(biāo)記的瓊脂平板。

DNA超螺旋轉(zhuǎn)化最好

DNA環(huán)狀次之

DNA線狀有干擾作用

1ugpBR322DNA轉(zhuǎn)化入HB101可得：5×106/2×107轉(zhuǎn)化子。

DNA分子量小比分了量大的轉(zhuǎn)化率高，一般不超過(guò)10kb，最高限為15kb。一般1ugDNA可得5×107~1×108個(gè)轉(zhuǎn)化菌。16編輯ppt（3）注意事項(xiàng)①宿主菌取出時(shí)應(yīng)注意菌株名及編號(hào)。②檢查宿主菌，應(yīng)無(wú)質(zhì)粒污染，無(wú)抗菌素抗性。③整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)保持無(wú)菌狀態(tài)。④LB培養(yǎng)液中不能有抗生素。⑤不同受體菌，培養(yǎng)要求不同。如K802株，OD550=0.5

最好，而X1776株，OD550=0.2~0.3最好。

質(zhì)粒的DNA比較小，有助于其轉(zhuǎn)于宿主細(xì)胞中的效率。轉(zhuǎn)化效率與質(zhì)粒大小成反比。而質(zhì)粒大于15kb時(shí)，轉(zhuǎn)化率成為限制因素。同時(shí)質(zhì)粒大，復(fù)制的拷貝數(shù)低。17編輯ppt（4）質(zhì)粒的三種構(gòu)型①超螺旋閉合環(huán)狀DNA，cccDNA。②開環(huán)DNA，至少一股DNA上有缺口，一處或多處使DNA鮮旋。③線狀DNA

瓊脂糖(Agrose)電泳可將這三種構(gòu)型的DNA分開，Agrose電泳中cccDNA位置最前。18編輯ppt二、閱讀微生物的基因型符號(hào)

在描述一個(gè)微生物的品系時(shí)，最重要的事就是區(qū)分它的基因型和表現(xiàn)型?；蛐驼f(shuō)明它的遺傳決定子，這是看不見的特性；而表現(xiàn)型反映的是可觀察到的特性。

1．由于一個(gè)微生物的基因組中有成百個(gè)基因。因此，一般而言，在描述一個(gè)品系的基因型時(shí)只給出它與野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些與野生型相同的基因。也就是說(shuō)，在它們名稱后面所給出的是這些品系的基因組中發(fā)生了突變的基因。如：某菌，trp、his和metA，是表示它的trp、his和metA基因座是突變了的，其他基因組仍然正常。在上下文貫通地具體描述微生物的某個(gè)基因(如trp)時(shí)，可以用trp+，或者只是簡(jiǎn)單地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到它時(shí)都寫作trp+。有些突變型是缺失突變，就用△表示，如△lon表示lon基因的缺失突變。19編輯ppt2．有些細(xì)菌中有附加體或者其他特殊的傳導(dǎo)噬菌體。最常見的是性因子F。細(xì)菌中有F因子的描述為F+；沒有的為F-。有些F因子上面帶有細(xì)菌的某些基因，這樣的F因子寫作Fˊ，它所帶基因的描述方法同上。例如Flac+，proA+，B+表示F因子上面帶有細(xì)菌的lac和proA，B基因。又如，F(xiàn)lacZ，proA+，B+表示F因子上面帶有l(wèi)ac和proA，B基因，但是，其中的Z基因是突變的基因。

3．校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花繚亂。因?yàn)橐吧推废惦m然不帶有校正基因，它的基因型卻理所當(dāng)然地應(yīng)當(dāng)寫作sup+，表現(xiàn)型則應(yīng)該寫為Sup-?？墒?，帶有sup基因的突變型品系的基因型必需寫為sup-或者sup，它的表現(xiàn)型是Sup+。也就是說(shuō)，字面上的概念與實(shí)際上的情況正好倒了一個(gè)個(gè)兒。因此，在閱讀它時(shí)要特別小心，以免搞錯(cuò)。此外，在談到特殊的校正基因時(shí)，它的表現(xiàn)型常用數(shù)字來(lái)表示，如Sul；但是，它的基因型卻用字母來(lái)表示supD。鑒于這種情況，有人建議對(duì)校正基因野生型(Su-)的品系干脆不用任何符號(hào)，只標(biāo)出突變型品系(Su+)的特殊基因座位符號(hào)，如supD和supE等。20編輯pptJM83，F(xiàn)-，ara，△(lac-proAB)，rpsL，Ф80d，lacZ△M15是這樣一個(gè)品系：不帶F因子，ara基因座突變(因此不能代謝阿拉伯糖)，lac操縱子缺失(因此不能利用乳糖)，30S核糖體的S12亞基突變(因此有鏈霉素抗生)，β-D-半乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含X-gal的平板中有α-互補(bǔ)作用。如果將克隆的pUC質(zhì)粒的重組DNA轉(zhuǎn)化入這個(gè)細(xì)菌，就可以通過(guò)藍(lán)/白菌斑來(lái)篩選出轉(zhuǎn)化子)。野生的大腸桿菌具有大約4700kbp的DNA分子，上面有約2800個(gè)基因。當(dāng)這些基因中有突然變異發(fā)生時(shí)，基因產(chǎn)物隨之變化，并且有可能給大腸桿菌帶來(lái)可以觀察到的變化。這種能夠觀察到的特征叫做大腸桿菌的表現(xiàn)型(Phenotype)，而把基因的構(gòu)成叫做大腸桿菌的基因型(Genotype)。試舉一例來(lái)說(shuō)明上述概念：21編輯ppt

通常情況下，基因工程中使用的大腸桿菌的基因型只有在基因發(fā)生變異，表現(xiàn)型發(fā)生變化時(shí)才被表示。但是需要特別的表示時(shí)，則在野生的基因型上加“+”，在變異的基因型上加“-”以示區(qū)別。表示方法是用基因產(chǎn)物或其作用的名稱的三個(gè)斜體字素表示(如DNAAedninemethylase-dam)。如果不同的基因變導(dǎo)致相同的作用結(jié)果，則加上一個(gè)大寫字母(如Recombination-recA、recB、recC)。某個(gè)基因或者是某領(lǐng)域缺失時(shí)，在基因型前向加上“△”表示，如“從lac到proAB基因缺失時(shí)表示為△(lac-proAB)。野生的大腸桿菌本來(lái)還有具有F因子等的質(zhì)粒DNA，并且感染噬菌體。把被野生的大腸桿菌感染的噬菌體特稱為原噬菌體(Prophage)，例如e14。一般當(dāng)這些質(zhì)粒或原噬菌體缺失或變異時(shí)也用“()”或“/”等加以區(qū)別表示。22編輯ppt表現(xiàn)型是用羅馬字母體表示(第一個(gè)字母大寫)。一般通過(guò)變異而獲得了能夠觀察到的抗藥性或者活性表達(dá)等特征時(shí)，用“+”表示(Steptomycin抗性：Str+)；相反地當(dāng)成為藥物敏感性或者活性喪失時(shí)，用“-”表示(Ampicillin敏感性：Amp-)?；蛐捅憩F(xiàn)容易混淆，使用時(shí)注意。*基因工程中經(jīng)常使用的大腸桿菌幾乎都來(lái)自于K-12菌株，最近也常使用由B株及C株來(lái)源的大腸桿菌。*大腸桿菌B株原來(lái)就為lon-，另外MV1184株不具有琥柏抑制基因(Ambersuppressorfree)，由于這些都是原始菌株所不具備的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。23編輯pptsupE(suppressor)抑制基因

supE變異時(shí)，即使存在終止密碼UAG，此處也會(huì)插入谷氨酰胺(Glutamine)，從而可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。

supF(suppressor)抑制基因

supF變異時(shí)，即使存在終止密碼子UAG，此處也會(huì)插入酪氨酸(Tyrosine)，從而可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。停止密碼回復(fù)24編輯pptrecA(recombination)重組相同的DNA重組活性缺失由于導(dǎo)入DNA與宿主DNA的重組受到阻害，可以保持插入DNA的穩(wěn)定性。與recA13宿主菌相比，recA1宿主菌能夠使插入DNA穩(wěn)定存在。

recB，C(recombination)重組內(nèi)切核酸酶V變異。抑制重組并能影響放射線損傷的修復(fù)。

traD(transmissibility)遺傳穩(wěn)定性在質(zhì)粒F因子內(nèi)部，與大腸桿菌的結(jié)合有關(guān)。

TraD變異后，F(xiàn)因子自身的傳遞能力顯著下降。重組機(jī)能缺失25編輯pptdam(DNAadeninemethylase)DNA腺嘌呤甲基化酶宿主菌來(lái)源的腺嘌呤甲化酶(GmATC)缺失

dcm(DNAcytsinemethylase)DNA胞嘧啶甲基化酶宿主菌來(lái)源的胞嘧啶甲基化酶（CmCWGG）缺失

hsdR(hostspecificitydefective)宿主特異性缺陷宿主菌來(lái)源的I型限制酶Ecok(或EcoB)的切斷部位蛋白變異轉(zhuǎn)化的外源DNA不被限制酶EcoK切斷，可以進(jìn)行克隆

hsdM(hostspecificitydefective)

宿主菌來(lái)源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的甲基化酶部位蛋白變異

hsdS（hostspecificitydefective）宿主菌來(lái)源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的識(shí)別部位蛋白變變異轉(zhuǎn)化的外源DNA不被限制酶EocK切斷，可以進(jìn)行克隆對(duì)插入DNA具有直接作用因子的缺失26編輯ppt

endA(endonuclease)內(nèi)切核酸酶宿主菌來(lái)源的非特異性內(nèi)切核酸酶I活性缺失，可以提高純化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量。

NcrA(methylcytsinerestriction)mCG序列的甲基化活性缺失。

mcrB，C(methylcytsinerestriction)GmC序列的甲基化活性缺失。

mrr(methylationrequiringrestricion)mA以及mC序列的甲基化活性缺失。27編輯ppt

rpsL(ribosomalproteinsmallsubunit)

由30S核糖體蛋白變異而獲得鏈霉素(Steptomycine)抗性(Strr)。

gyrA(gyrase)

由DNA回旋酶亞基A的變異而獲得的萘啶酮酸(Nalidxicacid)抗性(Nalr)。

Tn5(transposon)

轉(zhuǎn)座子變異，獲得卡那霉素(Kanamycine)抗性(Kmr)。

Tn10(transposon)

轉(zhuǎn)座子變異，獲得四環(huán)素（Tetracycline）抗性（Tetr）。抗藥性的變異28編輯pptlon(longform)

分解異型蛋白質(zhì)的ATP依賴型蛋白分解酶活性缺失。大腸桿菌B株原來(lái)就為lon-?？梢种破浔磉_(dá)的融合蛋白質(zhì)的分解。

omp(outermembraneprotein)外膜蛋白膜結(jié)合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表達(dá)的融合蛋白質(zhì)的分解。宿主蛋白酶缺失29編輯pptlacIq(lactose)

乳糖操縱子中控制β-半乳糖苷酶表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白基因。由于lacIq變異，表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白過(guò)量形成，因此從乳糖啟動(dòng)子開始的轉(zhuǎn)錄過(guò)程完全受到抑制。

lacZ(lactose)β-半乳糖苷酶活性缺失

lacZ△M15β-半乳糖苷酶蛋白的w-fragment得到表達(dá)。當(dāng)與多數(shù)載體質(zhì)粒中所具有的α-fragment共同存在時(shí)，可使β-半乳糖苷酶的活性回復(fù)(α-互補(bǔ)性)。在含有X-gal的平板培養(yǎng)基上，可以通過(guò)藍(lán)白菌的差別選擇重組體。

deoRdeoR變異，可以選擇性地改善大分子DNA的轉(zhuǎn)化。有利于選擇轉(zhuǎn)化體的基因30編輯ppt

dut(dUTPase)dUTP酶

dUTP分解酶活性缺失，當(dāng)dUTP分解酶存在時(shí)，dUTP不能摻入到DNA鏈中。

ung(Urasil-N-glycosylase)尿嘧淀-N-糖苷酶尿嘧啶-N-糖苷酶活性缺失。當(dāng)具有這種基因時(shí)，可以特異性地分解DNA含U的那條鏈。

mutS(mutator)突變子未被甲基化的新合成DNA鏈的錯(cuò)配序列修復(fù)受到阻礙。有利于點(diǎn)突變的基因31編輯ppt

leuB(leucine)亮氨酸在最小培養(yǎng)基中必須添加亮氨酸(Leu)proAB(proline)脯氨酸脯氨酸代謝基因變異。在最小培養(yǎng)基中只有添加脯氨酸才能生長(zhǎng)。用于確認(rèn)JM109等大腸桿菌菌株的F因子是否脫落。

Thi-1(thiamine)硫胺素

硫胺素代謝基因變異，在最小培養(yǎng)基中必須添加硫胺素。菌株篩選用基因32編輯ppt

LacZ、lac5、

trpE、bio、bio256從大腸桿菌lac、trp和bio區(qū)置換而來(lái)

imm80、QSR80從φ80噬體置換而來(lái)

imm434從φ434噬菌體置換而來(lái)

imm21從φ21噬菌體置而來(lái)

int29從φ29噬菌體置換而來(lái)

b2、b1007、b527、b189B域的缺失突變，使att位點(diǎn)受破壞并因而阻止溶源化

KH52φ80噬菌體DNA的缺失突變

KH53類似于λ噬菌體cI區(qū)域的φ80噬菌體區(qū)域的缺失突變，可有效地防止溶源化

KH54Rex－cI區(qū)域的缺失突變，可有效地防止溶源化

nin5轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)tR2的缺失突變，可使延遲早期轉(zhuǎn)錄不依賴于N基因產(chǎn)物，并且也刪除了ral基因附近的BamHI位點(diǎn)

ninL44轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)tR2的缺失突變，可使延遲早期轉(zhuǎn)錄不依賴于N基因產(chǎn)物，并且也刪除了ral基因附近的BamHI位點(diǎn)。

WL113從33240位的SalI到34500位的BamHI之間的1，3kb缺失突變，不損傷gam基因，但kil，cⅢ、ssb和ral基因被刪除。

sslIλ1-2從第一到第二個(gè)SalI之間的0.5kb缺失突變，gam基因和部分bet基因被刪除。33編輯ppt續(xù)上表shndⅢλ2-3λ噬菌體第二與第三個(gè)HindⅢ之間的2.3kb缺失突變，部分b區(qū)被刪除sxIλ1oXbaI酶切后經(jīng)外切核酸酶消化而造成的0.5kb缺失突變

鼠填充片段大腸桿菌填充片段

lac操縱基因+

腺病毒DNA在重組體中將被置換的載體DNA片段BluescriptM13-重組入λZAP載體的噬菌粒，當(dāng)用M13輔助噬菌體感染后，噬菌粒部分可在體內(nèi)被切下。lacY、lacZ、lacPO

、lacIq、ampr插入ΛOPF8的lac和氨芐青霉素抗生基因Aam、Bam、Eam、

Wam、gamam可被supE和（或）supF抑制的琥珀突變。intamInt基因內(nèi)的BamHI位點(diǎn)被消除后形成的琥珀突變。Sam7、Sam100參與溶解細(xì)菌細(xì)胞膜的一個(gè)基因內(nèi)的琥珀突變。該突變可被supF抑制，但不被supE抑制，失卻野生型S基因產(chǎn)物后，引起感染性噬菌體顆粒在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生積累。cIts857使cI基因產(chǎn)物對(duì)熱不穩(wěn)定的溫度敏感突變chi促進(jìn)λ噬菌體定向重組的特定八核苷酸序列g(shù)amGam基因編碼大腸桿菌recBC外切核酸酶的抑制物，因此可使Q型DNA復(fù)制有效地轉(zhuǎn)向滾環(huán)復(fù)制。Gam基因產(chǎn)物對(duì)于λ噬菌體有recA-菌株（Fec表型）和P2噬菌體溶源的recA+菌株（Spi表型）內(nèi)的生長(zhǎng)非常重要。exobet(red)Exo和bet是位于λ噬菌體red區(qū)域的兩個(gè)基因（red表示兩個(gè)基因或任一個(gè)基因）。這兩處基因產(chǎn)物參與當(dāng)從Q型DNA復(fù)制向滾環(huán)復(fù)制轉(zhuǎn)變時(shí)的重組過(guò)程。這兩個(gè)基因產(chǎn)物對(duì)于λ噬菌體在recA-菌株（Fec表型）和P2噬菌體溶源的recA+菌株（Spi表型）內(nèi)的生長(zhǎng)非常重要。34編輯ppt常用細(xì)菌菌株C600F-thi-1thrleuB6lacY1ton21supE44λ-常用于制備裂解物及增殖λgt10的抑制型菌株

該菌株也叫CR34C600:HflA150(Y1073)F-thi-1thrleuB6lacY1tonA21supE44λ-hflA150(chr:Tn10)·hostforrepressingbackgroundplaquesofλgt10whenestablishingcDNAlibrariesDH5F-endA1recA1hsdR17(rk-mk+)λdeoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostforpBR322orothernon-Pucvectors·usefulforcDNAcloningDH5αF-φ80dlacZ△M15(lacZYA-argF)U169endA1recA1hsdR17(rk-mk+)deoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostforpUCandotherα-complementationvectors;pBR322·usefulforcDNAcloningDH5αFˊFˊ-φ80dlacZ△(lacZYA-argF)U169endA1hsdR17(rk-mk+)deoRthi-1supE44λ-gryA96relA1·HostforgrowthofM13,phagemids,orothermale-specificbacteriophage·providesα-complementationforM13mpvectors35編輯ppt續(xù)上表DH5αFˊIQFˊproAB+lacIqZ△M15zzf::Tn5[Kmr]/φ80dlacZ△M15△(lacZYA-ARGf)U169andA1recA1hsdR17(rk-mk+)deoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostofrexpressionfromthelacpromother·hostforgrowthofM13,phagemids,orothermale-specificbacteriophage·providesα-complementationforM13mpvectorsDH5α-MCRF-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ△M15△(lacZYA-argF)U169endA1recA1deoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostforpUCandotherα-complementationvectors;pBR322·usefulforgeneratinggenomiclibrariescontainingmethylatedcytosineoradenineresiduesDH10BF-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ△M15△lacX74endA1recA1deoR△(ara,leu)7697araD139galUgalKnupGrpsLλ-·hostforpUCandotherα-complementationvectors;pBR322·usefulforgeneratinggenomiclibrariescontainingmethylatedcytosineoradenineresidues·usfulforplasmidrescueproceduresDH10BACF-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ△M15△lacX74endA1recA1deoR△(ara,leu)7697araD139galUgalKnupGrpsLλ-/bmon14272/Pmon7124·hostforpEASTtBACvectors·usefulforgeneratingrecombinantbacmidDNAforuseinBEVStechnology36編輯ppt續(xù)上表DH10B(ZIP)F-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ△M15△lacX74endA1recA1deoR△(ara,leu)7697araD139galUgalKnupGrpsLλxisbind-pZIP1(P1ori-kanr-cre)·