免疫組化結(jié)果的分析和判斷電子教案

免疫組化結(jié)果分析(fēnxī)和判斷第一頁，共44頁。第一節(jié)免疫組化結(jié)果(jiēguǒ)的判斷原則

免疫組化結(jié)果(jiēguǒ)的判斷原則概括起來有以下幾點：第二頁，共44頁。

⒈必須同時設對照染色(rǎnsè)。沒有對照染色(rǎnsè)的免疫組化染色(rǎnsè)結(jié)果是不可信的。⒉抗原表達必須在特定部位。如LCA應定位在細胞膜上；CK應定位在細胞漿內(nèi)；PCNA及p53蛋白應定位在細胞核內(nèi)；EMA應定位在細胞膜上，等等。不在抗原所在部位的陽性著色，一概不能視為陽性。第三頁，共44頁。

⒊陰性結(jié)果不能視為抗原不表達。由于檢測方法靈敏度有高低之分，有時可因染色方法靈敏度不夠，而導致陰性反應，判斷(pànduàn)時應注意。第四頁，共44頁。

⒋盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣(biānyuán)細胞的陽性表達，特別是酶免疫標記。因為這類陽性著色多系內(nèi)源干擾，或系人為因素所致。第五頁，共44頁。

⒌對免疫組化標記結(jié)果的意義不能絕對化，應結(jié)合臨床(línchuánɡ)資料、X線等影像學及實驗結(jié)果綜合分析。第六頁，共44頁。第二節(jié)對照(duìzhào)染色設計第七頁，共44頁。(一）對照染色的目的設對照的目的是為了排除假陰性和假陽性。假陰性的原因主要有三：①組織處理不當，抗原丟失過多或被遮蔽；②抗體失活、效價過低或稀釋度不合適（主要指一抗，即特異性抗體）；③染色步驟(bùzhòu)遺漏及差錯，或顯色劑的選擇、緩沖液的pH和離子強度不當?shù)取５诎隧?，?4頁。假陽性均系由多種因素造成的非特異著色所致，原因主要有：①自發(fā)熒光或內(nèi)源酶等干擾；②抗體試劑不純(特別是一抗）；③操作失誤，如污染、切片干枯或顯色劑操作不當(bùdānɡ)等；④Fc受體的干擾，等等。第九頁，共44頁。（二）對照的種類及其選用(xuǎnyòng)目的對照染色大致可分為陽性組織對照、陰性組織及陰性試劑對照和自身對照四大類：第十頁，共44頁。⒈陽性組織對照指用已證實含有靶抗原的同源及不同源組織切片或細胞(xìbāo)涂片與待檢實驗切片同時作同樣處理和免疫染色的組織對照。正確的結(jié)果應呈現(xiàn)陽性，目的是為了證實所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。第十一頁，共44頁。⒉陰性組織對照指用已證實不含靶抗原的同步處理和免疫標記染色的組織對照。正確的結(jié)果應為陰性，目的(mùdì)是除外假陽性。第十二頁，共44頁。⒊陰性試劑對照是指用于證實在免疫組化染色中所用試劑，尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性而所設立的同步免疫染色對照，包括有：空白對照；替代對照；吸收試驗(shìyàn)和抑制試驗(shìyàn)，等。目的在于除外假陽性和證實所用免疫組化試劑及其技術(shù)方法的有效性和待檢實驗切片免疫標記陽性結(jié)果的可靠性。第十三頁，共44頁。⑴空白對照指以緩沖液（PBS、TBS等）取代第一抗體（主要的，必要時還可做第二抗體及橋聯(lián)抗體的空白取代），其他各步不變的試劑(shìjì)對照染色，結(jié)果應為陰性。第十四頁，共44頁。⑵取代對照(duìzhào)指以所用方法第一抗體同源動物的正常血清，或與本實驗無關(guān)的抗體(靶生物缺如的)取代第一抗體，其他步驟不變的試劑對照(duìzhào)染色，結(jié)果應為陰性。⑶吸收試驗是指用事先經(jīng)過量抗原吸收的第一抗體上清液取代第一抗體，其他步驟不變的免疫染色試劑對照(duìzhào)。結(jié)果應是陰性或陽性著色明顯減弱（吸收不全時）。第十五頁，共44頁。⑷抑制試驗是指用標記抗體和未標記抗體（可以是一抗，也可以是二抗或橋抗體）兩者的混合物作試劑，其他步驟不變的免疫組化染色試劑對照，結(jié)果其陽性著色(zhuósè)應成比例的減弱（等量或1：9）。此試劑對照多用于直接法。第十六頁，共44頁。這類陰性(yīnxìng)試劑對照的選用原則是：①空白對照不能省，其他對照在預實驗中應盡量多做，尤其是應用新抗體試劑；②對照必需與實驗片同步進行染色；③對照的結(jié)果應附合要求。第十七頁，共44頁。⒋自身對照是指在同一標記切片上的自身組織成分的陰性背景對照。即與靶抗原陽性反應細胞或成分相鄰的陰性背景結(jié)構(gòu)的顯色，結(jié)果應為陰性或著色較淺，需與陽性著色成分呈鮮明對比。目的在于排除內(nèi)源性干擾產(chǎn)生的假陽性和因抗原彌散移位(yíwèi)造成的錯誤結(jié)果。第十八頁，共44頁。第三節(jié)非特異染色(rǎnsè)第十九頁，共44頁。非特異染色是指免疫組化染色過程(guòchéng)中產(chǎn)生的非靶抗原的呈色結(jié)果，屬假陽性，又稱背景著色，能嚴重干擾免疫組化染色結(jié)果的正確判斷，應竭力避免或減輕。其原因涉及免疫組化染色流程的各個環(huán)節(jié)，可來自：第二十頁，共44頁。①內(nèi)源性干擾(自發(fā)熒光、內(nèi)源酶、內(nèi)源性生物素等)；②試劑污染(質(zhì)量差，交叉反應，F(xiàn)c受體干擾等)；③組織處理不當(組織固定不及時或固定不良所導致的抗原彌散移位、洗滌(xǐdí)不充分所導致的游離試劑殘留等)。第二十一頁，共44頁。糾正的方法視原因(yuányīn)而異，可在預實驗基礎(chǔ)上，采用有針對性的糾正對策，即對癥下藥(具體糾正方法不展開講了，同學們可以自己閱讀講義p123-126)。第二十二頁，共44頁。第四節(jié)陽性標記(biāojì)的形態(tài)特征和判斷第二十三頁，共44頁。免疫組化標記具有一定形態(tài)特點，若能熟練掌握則有助于對免疫組化標記結(jié)果的正確判斷。特點包括定性、定位(dìngwèi)和定量三方面。第二十四頁，共44頁。免疫顯色強度和陽性細胞密度是定性定量指標，實際工作中常采用強度和密度結(jié)合的方法綜合計量，與抗原含量有關(guān)；陽性細胞的著色形態(tài)及組織(zǔzhī)分布特點主要是定位指標，與功能有關(guān)。第二十五頁，共44頁。一、陽性標記免疫特征：分"弱(+)、中(++)、強(+++)"三級。免疫熒光(yíngguāng)法（FITC為例）則表現(xiàn)為淺綠色熒光(yíngguāng)、明顯綠色熒光(yíngguāng)和亮綠色耀眼熒光(yíngguāng)；第二十六頁，共44頁。免疫酶標記（HRP-DAB/H2O2）則表現(xiàn)(biǎoxiàn)為淡黃色細顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，后者耀眼易見。一般圖片照像，原則上多取強陽性區(qū)域。第二十七頁，共44頁。二、陽性標記細胞學特征（以HRP-DAB/H2O2為例）可分為(fēnwéi)①胞膜型；②胞核型；③胞質(zhì)(漿)型；④微絨毛型和⑤復合型（胞膜-胞質(zhì)兼有，胞核-胞質(zhì)兼有，或微絨毛-胞質(zhì)兼有）等五種陽性細胞類型。這與抗原所在部位相關(guān)聯(lián)，但應注意排除因組織固定不好引起的抗原彌散假象，尤其是復合型圖像。第二十八頁，共44頁。第二十九頁，共44頁。第三十頁，共44頁。第三十一頁，共44頁。第三十二頁，共44頁。三、陽性標記組織學特征（以HRP-DAB/H2O2為例）免疫組化染色陽性細胞在組織中的分布排列形式可以有如下7種：①局灶型；②彌漫型；③片塊型；④網(wǎng)狀型；⑤腺管型；⑥腔緣型和⑦菊團型，等。這主要取決于抗原抗體(kàngtǐ)復合物在細胞內(nèi)的分布和陽性細胞在組織內(nèi)的群體分布特點。第三十三頁，共44頁。四、陽性標記強度特征依照(yīzhào)細胞陽性著色程度（抗原含量），可分為弱陽性（+）┅1分；中等陽性（++）┅2分；強陽性（+++）┅3分。依照(yīzhào)陽性細胞數(shù)量，可分為：弱陽性（+，指陽性細胞總數(shù)在25%以下）；第三十四頁，共44頁。中等(zhōngděng)陽性（++,指陽性細胞總數(shù)在25%—49%)；強陽性（+++，指陽性細胞總數(shù)在50%以上)。目前多采用積分綜合計量。計算公式為：（+）%x1+（++）%x2+（+++）%x3；總數(shù)值<1.0者為（+），1.0-1.5者為(++),>1.5者為(+++)。至少隨機觀察5-10個HPF。第三十五頁，共44頁。第五節(jié)染色失敗(shībài)的可能原因第三十六頁，共44頁。免疫組化染色的基本要求有二：①實驗切片的陽性抗原定位準確，呈色鮮明，背景(bèijǐng)著色淺或無，二者的比值應大于1（陽性/背景(bèijǐng)）；②對照染色的結(jié)果應附合要求。否則，所得實驗結(jié)果都是錯誤的，或為假陽性或為假陰性。第三十七頁，共44頁。假陽性是指實驗切片呈陽性，陰性組織(zǔzhī)對照或陰性試劑對照也呈陽性的結(jié)果，謂之假陽性。其原因與內(nèi)源性干擾，試劑不純，交叉反應等有關(guān)。第三十八頁，共44頁。假陰性是指實驗切片呈陰性，陽性組織對照(duìzhào)及陰性試劑對照(duìzhào)也均呈陰性的結(jié)果，謂之假陰性。其原因與組織處理不當，組織細胞抗原丟失或試劑錯誤(如漏加、錯加、失效、變質(zhì)等),操作失誤等有關(guān)。第三十九頁，共44頁。對照結(jié)果(jiēguǒ)判斷：表中1～5結(jié)果無效，6、7結(jié)果可靠（＋）（＋）（＋）（－）（＋）（＋）（－）檢測標本含抗體，結(jié)果可靠（＋）（－）（－）7檢測標本不含抗體結(jié)合可靠（－）（－）（－）6非特異染色（＋）（＋）（－）5陽性對照不含定位抗原（＋）（－）（－）4陰性對照內(nèi)含定位抗原(＋)(－)（－）（＋）3非特異性染色（＋）（＋）（＋）2抗體失活，操作有誤（－）（－）（－）1結(jié)果判斷檢測結(jié)果替代對照陰性對照陽性對照第四十頁，共44頁。染色失敗原因： 均為陰性 均為弱陽性（除陰性對照） 背景(bèijǐng)染色過深 陽性對照好，待檢標本弱陽性 陽性對照無背景(bèijǐng)，待檢標本背景(bèijǐng)深第四十一頁，共44頁。判斷原則(yuánzé)：

實驗設計 抗體選擇 抗原定位性 抗原分布不均一性第四十二頁，共44頁。識別假陰性抗原丟失或減弱 抗體失活 操作不當識別假陽性