人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案提綱病原學(xué)簡介樣品采集與運(yùn)送實驗室檢測人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案病原學(xué)簡介分類培養(yǎng)特性生化特征致病因子人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案鏈球菌分類伯杰分類6大類群，29個種16SrRNA序列同源性和化學(xué)分類鏈球菌屬分類學(xué)定義無芽孢革蘭氏陽性細(xì)菌，細(xì)胞形態(tài)為球形或球桿狀，直徑0.5～2.0微米，細(xì)胞成對或成鏈排列，有些種具有莢膜?！烁腥矩i鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案鏈球菌分類根據(jù)溶血現(xiàn)象分類甲型溶血性鏈球菌：稱甲型溶血或溶血，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞并未完全溶解。多為條件致病菌。乙型溶血性鏈球菌：稱乙型溶血或溶血，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞完全溶解，致病力強(qiáng)丙型鏈球菌：無溶血環(huán)，一般不致病豬鏈球菌α溶血(偶而也有弱β溶血或α溶血、β溶血現(xiàn)象均不明顯)，某些菌株在馬血培養(yǎng)基上β溶血人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案鏈球菌分類根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的分類蘭氏分類：按多糖類抗原（C抗原）將鏈球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群(其中缺I、J群)，近年又增加U、V群，共20群，每個群有1個或多個種。幾乎所有群的菌株，都能從病豬體內(nèi)分離得到，引起豬病并偶爾經(jīng)傷口感染人的鏈球菌主要有R群的2型豬鏈球菌S群和D群的1型豬鏈球菌F群的咽峽炎鏈球菌L、S、T、U、V群鏈球菌等人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案鏈球菌分類豬鏈球菌

血清2型蘭氏分類：R群根據(jù)菌體莢膜抗原特性不同，分為35個血清型：1/2，1～34型致病性最強(qiáng)的是2型，其次為1型2型豬鏈球菌1954年英國分離1968年命名為莢膜II型豬鏈球菌分為致病力不同的株人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案豬鏈球菌培養(yǎng)特性革蘭氏陽性無芽胞球菌，兼性厭氧營養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基中生長不良，需補(bǔ)充血液、血清、葡萄糖等在血清肉湯中易形成長鏈，管底呈絮狀沉淀在綿羊鮮血瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24小時，形成直徑l～2毫米的細(xì)小菌落，灰白色，半透明，邊緣整齊，凸起，光滑，α溶血（有時呈弱β溶血或溶血不明顯），48小時后可有草綠色色素沉著。人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案

豬鏈球菌培養(yǎng)特性剛分離的豬鏈球菌，典型的革蘭氏陽性鏈球菌，鏈長達(dá)二十多個二代培養(yǎng)后細(xì)菌形態(tài)不典型，結(jié)晶紫作色不良，多為不成鏈球桿菌，少數(shù)呈短鏈狀。人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案鏈球菌.Gramstain.CDC/Dr.RichardFacklam

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案鏈球菌人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案

豬鏈球菌培養(yǎng)特性10℃培養(yǎng)不生長，45℃培養(yǎng)生長，60℃30分鐘試驗不生長55℃30分鐘即可被殺死

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案豬鏈球菌生化特征豬鏈球菌生化特性往往差異較大，一般難以作為分類依據(jù)觸酶試驗陰性水解七葉苷、淀粉和精氨酸，不水解馬尿酸鹽和明膠分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露糖，不分解阿拉伯糖、鼠李糖和甘露醇人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案致病因子豬鏈球菌2型主要致病因子溶菌酶釋放蛋白（muramidase-releasedprotein,MRP）細(xì)胞外因子（extracellularfactor,EF）豬溶素（suilysin）莢膜多糖用南通地區(qū)分離的人源豬鏈球菌對兔和小白鼠的攻擊試驗表明，豬鏈可使家兔發(fā)病，并引起死亡。而小白鼠不敏感人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案樣品采集與運(yùn)送采樣器材樣品種類血液和腦脊液標(biāo)本采集方法樣品運(yùn)輸保存注意事項人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案采樣器材

無菌封閉性好的試管，最好使用負(fù)壓采血管或帶螺口蓋的塑料管，避免使用玻璃試管?？梢郧宄?biāo)記且標(biāo)記不易脫落的記號筆?？梢苑奖悴杉M織標(biāo)本的無菌容器。無菌的剪刀、鑷子和手術(shù)刀。人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案采樣器材

血平皿(或者血培養(yǎng)瓶)。一次性隔離服、乳膠手套、防護(hù)口罩等帶有冰袋或者冰排的安全可靠的保溫運(yùn)輸容器采樣送檢單人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案樣品種類

現(xiàn)癥病人不抗凝全血現(xiàn)癥病人抗凝血發(fā)病4～7天、10～16天不抗凝血腦脊液標(biāo)本尸體解剖應(yīng)無菌采集肝、脾、心血、胸（腹）水如有病死豬也可進(jìn)行解剖，取肝、脾、腎、心血、肉

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案血液和腦脊液標(biāo)本采集方法

無菌抽取血液5～10ml分置于有抗凝劑和無抗凝劑的無菌試管或者負(fù)壓采血管中按常規(guī)方法腰穿采集適量腦脊液標(biāo)本置于無菌試管中采集標(biāo)本的同時接種血平皿或者血培養(yǎng)瓶，置于35～37℃培養(yǎng)人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案樣品運(yùn)輸保存

所有的原始標(biāo)本在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中應(yīng)置于安全可靠容器中。標(biāo)本應(yīng)冷藏運(yùn)輸。需要馬上檢測的標(biāo)本在實驗室可暫放4-8℃冰箱。剩余標(biāo)本放置于-70℃保存。

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案注意事項

嚴(yán)格無菌操作，防止標(biāo)本污染。用于分離培養(yǎng)的標(biāo)本應(yīng)在抗菌治療前采集。應(yīng)盡可能床邊接種分離培養(yǎng)，如無法立即接種，應(yīng)在樣品送達(dá)實驗室后立即進(jìn)行分離。在標(biāo)本采集過程中，注意安全防護(hù)。使用一次性隔離服、乳膠手套、防護(hù)口罩采取預(yù)防措施，防止針頭等銳器刺傷如發(fā)生傷口意外暴露，應(yīng)及時清洗和消毒，并預(yù)防性服藥人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案實驗室檢測

豬鏈球菌檢驗程序推片鏡檢分離鑒定檢測要點(diǎn)人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案豬鏈球菌檢驗程序

病人檢樣（腦脊液、血液等）增菌培養(yǎng)（腦心肉湯/牛血清葡萄糖肉湯/血培養(yǎng)瓶）革蘭氏染色觸酶試驗

推片鏡檢

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案豬鏈球菌檢驗程序(續(xù))羊血瓊脂平板（37℃，5%CO2，24h）α溶血(偶而也有弱β溶血)

PCR檢測血清學(xué)檢測生化鑒定人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案推片鏡檢

抗凝血或腦脊液可推片革蘭氏染色鏡檢陽性標(biāo)本可見中性粒細(xì)胞內(nèi)吞噬顆粒，偶爾可見革蘭陽性球菌人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案感染鼠尾血推片人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案感染兔心臟血推片人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案分離鑒定

血平板直接接種

新鮮羊血瓊脂平板/含8%新生牛血清的營養(yǎng)瓊脂平板血或腦脊液等標(biāo)本直接接種組織標(biāo)本可直接涂抹平板或剪碎用無菌生理鹽水洗滌，洗液接種平板置37℃5%CO2培養(yǎng)箱或者燭缸中培養(yǎng)24小時人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案分離鑒定增菌培養(yǎng)待檢標(biāo)本置約10倍體積腦心肉湯/含8%新生牛血清葡萄糖肉湯（附配方）/商品化血培養(yǎng)瓶中增菌培養(yǎng)37℃24小時增菌培養(yǎng)物接種新鮮羊血瓊脂平板，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱或者燭缸中培養(yǎng)24小時如果是污染標(biāo)本,則要接種于選擇增菌培養(yǎng)液（含15微克/毫升多粘菌素B，30微克/毫升萘啶酮酸的腦心培養(yǎng)基）進(jìn)行增菌

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案附：葡萄糖肉湯（含8%新生牛血清）

成分：酵母浸膏3克10%葡萄糖溶液20毫升枸椽酸鈉3克磷酸氫二鉀2克牛肉湯900毫升24.7%硫酸鎂20毫升0.5%對氨苯甲酸5毫升新生牛血清80毫升

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案附：葡萄糖肉湯（含8%新生牛血清）制法除葡萄糖及硫酸鎂外,其他各物混合,加熱溶解,矯正pH至7.6,再煮沸5分鐘用濾紙過濾并分裝于100毫升三角燒瓶內(nèi),每瓶50毫升,包扎瓶口,高壓滅菌10磅20分鐘將葡萄糖配成10%水溶液,硫酸鎂配成24.7%水溶液,分別高壓滅菌8磅15分鐘每50毫升無菌肉湯內(nèi)加入無菌葡萄糖及磷酸鎂水溶液各1毫升,混勻.于37℃培養(yǎng)2天證明無細(xì)菌生長后存于冰箱內(nèi)備用。

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案分離鑒定形態(tài)學(xué)鑒定挑取平板上可疑菌落革蘭氏染色鏡檢

篩檢生化試驗豬鏈球菌觸酶試驗陰性，可與葡萄球菌區(qū)別

血清學(xué)檢測

標(biāo)準(zhǔn)分型診斷血清，進(jìn)行乳膠凝集試驗或玻片凝集試驗確定所分離的菌株為R群，與2型豬鏈球菌分型血清反應(yīng)目前國內(nèi)無分型診斷血清供應(yīng)。據(jù)報道,加拿大和澳大利亞有商品化血清分型試劑。

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案分離鑒定生化鑒定血平板上挑選可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色和觸酶試驗符合鏈球菌特征，接種血平板純培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定梅里埃API生化鑒定系統(tǒng)API20strep可鑒定2型豬鏈球菌，推薦使用（鑒定程序詳見操作說明）人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案分離鑒定PCR檢測豬鏈球菌種特異性基因16SrDNA豬鏈球菌2型和1/2型型特異的莢膜多糖基因cps2A毒力因子溶菌酶釋放蛋白基因MRP細(xì)胞外蛋白因子基因EF

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案基因鑒定，使用PCR技術(shù)和對PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析

檢測豬鏈球菌種特異性16SrRNA。

上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat

下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案檢測豬鏈球菌莢膜多糖基因（cps2A）

上游引物：gttgagtccttatacacctgtt

下游引物：cagaaaattcatattgtccacc

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案檢測溶菌酶釋放相關(guān)蛋白編碼基因片段（mrp）

上游引物：ggtataccttgctggtaccgttc

下游引物：agtctctacagctgtagctgg

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案PCR反應(yīng)的條件：

94℃預(yù)變性5分鐘;94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，25個循環(huán)，最后延伸72℃、5分鐘。取5微升擴(kuò)增產(chǎn)物在℅的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案MultiplexPCRAssayforDetectionofStreptococcussuisSpeciesandSerotypes2and1/2inTonsilsofLiveandDeadPigs.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,July2004,p.3169–3175

PrimerSequence(5’-3’)size(bp)16S-195(s)CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT29416S-489(as2)GTAAGATACCGTCAAGTGAGAAcps2J-sGTTGAGTCCTTATACACCTGTT459cps2J-asCAGAAAATTCATATTGTCCACCCI6-sGTTGAGTCCTTATACACCTGTTACTCAGTGCCGCAGCTAACGCATT

620CI7-asCAGAAAATTCATATTGTCCACCCGACTTCACCCCAATCATCTATCC人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實驗室檢測工作方案

MultiplexPCRAssaysforSimultaneousDetectionofSixMajorSerotypesandTwoVirulence-AssociatedPhenotypesofStreptococcussui