人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案提綱病原學(xué)簡(jiǎn)介樣品采集與運(yùn)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案病原學(xué)簡(jiǎn)介分類(lèi)培養(yǎng)特性生化特征致病因子人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案鏈球菌分類(lèi)伯杰分類(lèi)6大類(lèi)群，29個(gè)種16SrRNA序列同源性和化學(xué)分類(lèi)鏈球菌屬分類(lèi)學(xué)定義無(wú)芽孢革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，細(xì)胞形態(tài)為球形或球桿狀，直徑0.5～2.0微米，細(xì)胞成對(duì)或成鏈排列，有些種具有莢膜?！烁腥矩i鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案鏈球菌分類(lèi)根據(jù)溶血現(xiàn)象分類(lèi)甲型溶血性鏈球菌：稱甲型溶血或溶血，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞并未完全溶解。多為條件致病菌。乙型溶血性鏈球菌：稱乙型溶血或溶血，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞完全溶解，致病力強(qiáng)丙型鏈球菌：無(wú)溶血環(huán)，一般不致病豬鏈球菌α溶血(偶而也有弱β溶血或α溶血、β溶血現(xiàn)象均不明顯)，某些菌株在馬血培養(yǎng)基上β溶血人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案鏈球菌分類(lèi)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的分類(lèi)蘭氏分類(lèi)：按多糖類(lèi)抗原（C抗原）將鏈球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群(其中缺I、J群)，近年又增加U、V群，共20群，每個(gè)群有1個(gè)或多個(gè)種。幾乎所有群的菌株，都能從病豬體內(nèi)分離得到，引起豬病并偶爾經(jīng)傷口感染人的鏈球菌主要有R群的2型豬鏈球菌S群和D群的1型豬鏈球菌F群的咽峽炎鏈球菌L、S、T、U、V群鏈球菌等人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案鏈球菌分類(lèi)豬鏈球菌

血清2型蘭氏分類(lèi)：R群根據(jù)菌體莢膜抗原特性不同，分為35個(gè)血清型：1/2，1～34型致病性最強(qiáng)的是2型，其次為1型2型豬鏈球菌1954年英國(guó)分離1968年命名為莢膜II型豬鏈球菌分為致病力不同的株人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案豬鏈球菌培養(yǎng)特性革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽胞球菌，兼性厭氧營(yíng)養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不良，需補(bǔ)充血液、血清、葡萄糖等在血清肉湯中易形成長(zhǎng)鏈，管底呈絮狀沉淀在綿羊鮮血瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24小時(shí)，形成直徑l～2毫米的細(xì)小菌落，灰白色，半透明，邊緣整齊，凸起，光滑，α溶血（有時(shí)呈弱β溶血或溶血不明顯），48小時(shí)后可有草綠色色素沉著。人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案

豬鏈球菌培養(yǎng)特性剛分離的豬鏈球菌，典型的革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌，鏈長(zhǎng)達(dá)二十多個(gè)二代培養(yǎng)后細(xì)菌形態(tài)不典型，結(jié)晶紫作色不良，多為不成鏈球桿菌，少數(shù)呈短鏈狀。人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案鏈球菌.Gramstain.CDC/Dr.RichardFacklam

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案鏈球菌人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案

豬鏈球菌培養(yǎng)特性10℃培養(yǎng)不生長(zhǎng)，45℃培養(yǎng)生長(zhǎng)，60℃30分鐘試驗(yàn)不生長(zhǎng)55℃30分鐘即可被殺死

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案豬鏈球菌生化特征豬鏈球菌生化特性往往差異較大，一般難以作為分類(lèi)依據(jù)觸酶試驗(yàn)陰性水解七葉苷、淀粉和精氨酸，不水解馬尿酸鹽和明膠分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露糖，不分解阿拉伯糖、鼠李糖和甘露醇人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案致病因子豬鏈球菌2型主要致病因子溶菌酶釋放蛋白（muramidase-releasedprotein,MRP）細(xì)胞外因子（extracellularfactor,EF）豬溶素（suilysin）莢膜多糖用南通地區(qū)分離的人源豬鏈球菌對(duì)兔和小白鼠的攻擊試驗(yàn)表明，豬鏈可使家兔發(fā)病，并引起死亡。而小白鼠不敏感人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案樣品采集與運(yùn)送采樣器材樣品種類(lèi)血液和腦脊液標(biāo)本采集方法樣品運(yùn)輸保存注意事項(xiàng)人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案采樣器材

無(wú)菌封閉性好的試管，最好使用負(fù)壓采血管或帶螺口蓋的塑料管，避免使用玻璃試管?？梢郧宄?biāo)記且標(biāo)記不易脫落的記號(hào)筆?？梢苑奖悴杉M織標(biāo)本的無(wú)菌容器。無(wú)菌的剪刀、鑷子和手術(shù)刀。人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案采樣器材

血平皿(或者血培養(yǎng)瓶)。一次性隔離服、乳膠手套、防護(hù)口罩等帶有冰袋或者冰排的安全可靠的保溫運(yùn)輸容器采樣送檢單人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案樣品種類(lèi)

現(xiàn)癥病人不抗凝全血現(xiàn)癥病人抗凝血發(fā)病4～7天、10～16天不抗凝血腦脊液標(biāo)本尸體解剖應(yīng)無(wú)菌采集肝、脾、心血、胸（腹）水如有病死豬也可進(jìn)行解剖，取肝、脾、腎、心血、肉

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案血液和腦脊液標(biāo)本采集方法

無(wú)菌抽取血液5～10ml分置于有抗凝劑和無(wú)抗凝劑的無(wú)菌試管或者負(fù)壓采血管中按常規(guī)方法腰穿采集適量腦脊液標(biāo)本置于無(wú)菌試管中采集標(biāo)本的同時(shí)接種血平皿或者血培養(yǎng)瓶，置于35～37℃培養(yǎng)人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案樣品運(yùn)輸保存

所有的原始標(biāo)本在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中應(yīng)置于安全可靠容器中。標(biāo)本應(yīng)冷藏運(yùn)輸。需要馬上檢測(cè)的標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)室可暫放4-8℃冰箱。剩余標(biāo)本放置于-70℃保存。

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案注意事項(xiàng)

嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止標(biāo)本污染。用于分離培養(yǎng)的標(biāo)本應(yīng)在抗菌治療前采集。應(yīng)盡可能床邊接種分離培養(yǎng)，如無(wú)法立即接種，應(yīng)在樣品送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行分離。在標(biāo)本采集過(guò)程中，注意安全防護(hù)。使用一次性隔離服、乳膠手套、防護(hù)口罩采取預(yù)防措施，防止針頭等銳器刺傷如發(fā)生傷口意外暴露，應(yīng)及時(shí)清洗和消毒，并預(yù)防性服藥人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

豬鏈球菌檢驗(yàn)程序推片鏡檢分離鑒定檢測(cè)要點(diǎn)人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案豬鏈球菌檢驗(yàn)程序

病人檢樣（腦脊液、血液等）增菌培養(yǎng)（腦心肉湯/牛血清葡萄糖肉湯/血培養(yǎng)瓶）革蘭氏染色觸酶試驗(yàn)

推片鏡檢

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案豬鏈球菌檢驗(yàn)程序(續(xù))羊血瓊脂平板（37℃，5%CO2，24h）α溶血(偶而也有弱β溶血)

PCR檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)生化鑒定人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案推片鏡檢

抗凝血或腦脊液可推片革蘭氏染色鏡檢陽(yáng)性標(biāo)本可見(jiàn)中性粒細(xì)胞內(nèi)吞噬顆粒，偶爾可見(jiàn)革蘭陽(yáng)性球菌人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案感染鼠尾血推片人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案感染兔心臟血推片人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案分離鑒定

血平板直接接種

新鮮羊血瓊脂平板/含8%新生牛血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板血或腦脊液等標(biāo)本直接接種組織標(biāo)本可直接涂抹平板或剪碎用無(wú)菌生理鹽水洗滌，洗液接種平板置37℃5%CO2培養(yǎng)箱或者燭缸中培養(yǎng)24小時(shí)人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案分離鑒定增菌培養(yǎng)待檢標(biāo)本置約10倍體積腦心肉湯/含8%新生牛血清葡萄糖肉湯（附配方）/商品化血培養(yǎng)瓶中增菌培養(yǎng)37℃24小時(shí)增菌培養(yǎng)物接種新鮮羊血瓊脂平板，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱或者燭缸中培養(yǎng)24小時(shí)如果是污染標(biāo)本,則要接種于選擇增菌培養(yǎng)液（含15微克/毫升多粘菌素B，30微克/毫升萘啶酮酸的腦心培養(yǎng)基）進(jìn)行增菌

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案附：葡萄糖肉湯（含8%新生牛血清）

成分：酵母浸膏3克10%葡萄糖溶液20毫升枸椽酸鈉3克磷酸氫二鉀2克牛肉湯900毫升24.7%硫酸鎂20毫升0.5%對(duì)氨苯甲酸5毫升新生牛血清80毫升

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案附：葡萄糖肉湯（含8%新生牛血清）制法除葡萄糖及硫酸鎂外,其他各物混合,加熱溶解,矯正pH至7.6,再煮沸5分鐘用濾紙過(guò)濾并分裝于100毫升三角燒瓶?jī)?nèi),每瓶50毫升,包扎瓶口,高壓滅菌10磅20分鐘將葡萄糖配成10%水溶液,硫酸鎂配成24.7%水溶液,分別高壓滅菌8磅15分鐘每50毫升無(wú)菌肉湯內(nèi)加入無(wú)菌葡萄糖及磷酸鎂水溶液各1毫升,混勻.于37℃培養(yǎng)2天證明無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)后存于冰箱內(nèi)備用。

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案分離鑒定形態(tài)學(xué)鑒定挑取平板上可疑菌落革蘭氏染色鏡檢

篩檢生化試驗(yàn)豬鏈球菌觸酶試驗(yàn)陰性，可與葡萄球菌區(qū)別

血清學(xué)檢測(cè)

標(biāo)準(zhǔn)分型診斷血清，進(jìn)行乳膠凝集試驗(yàn)或玻片凝集試驗(yàn)確定所分離的菌株為R群，與2型豬鏈球菌分型血清反應(yīng)目前國(guó)內(nèi)無(wú)分型診斷血清供應(yīng)。據(jù)報(bào)道,加拿大和澳大利亞有商品化血清分型試劑。

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案分離鑒定生化鑒定血平板上挑選可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色和觸酶試驗(yàn)符合鏈球菌特征，接種血平板純培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定梅里埃API生化鑒定系統(tǒng)API20strep可鑒定2型豬鏈球菌，推薦使用（鑒定程序詳見(jiàn)操作說(shuō)明）人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案分離鑒定PCR檢測(cè)豬鏈球菌種特異性基因16SrDNA豬鏈球菌2型和1/2型型特異的莢膜多糖基因cps2A毒力因子溶菌酶釋放蛋白基因MRP細(xì)胞外蛋白因子基因EF

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案基因鑒定，使用PCR技術(shù)和對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析

檢測(cè)豬鏈球菌種特異性16SrRNA。

上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat

下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案檢測(cè)豬鏈球菌莢膜多糖基因（cps2A）

上游引物：gttgagtccttatacacctgtt

下游引物：cagaaaattcatattgtccacc

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案檢測(cè)溶菌酶釋放相關(guān)蛋白編碼基因片段（mrp）

上游引物：ggtataccttgctggtaccgttc

下游引物：agtctctacagctgtagctgg

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案PCR反應(yīng)的條件：

94℃預(yù)變性5分鐘;94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，25個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃、5分鐘。取5微升擴(kuò)增產(chǎn)物在℅的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。

人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案MultiplexPCRAssayforDetectionofStreptococcussuisSpeciesandSerotypes2and1/2inTonsilsofLiveandDeadPigs.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,July2004,p.3169–3175

PrimerSequence(5’-3’)size(bp)16S-195(s)CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT29416S-489(as2)GTAAGATACCGTCAAGTGAGAAcps2J-sGTTGAGTCCTTATACACCTGTT459cps2J-asCAGAAAATTCATATTGTCCACCCI6-sGTTGAGTCCTTATACACCTGTTACTCAGTGCCGCAGCTAACGCATT

620CI7-asCAGAAAATTCATATTGTCCACCCGACTTCACCCCAATCATCTATCC人感染豬鏈球菌病樣品采集運(yùn)送和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作方案

MultiplexPCRAssaysforSimultaneousDetectionofSixMajorSerotypesandTwoVirulence-AssociatedPhenotypesofStreptococcussui