實驗三微生物顯微技術(shù)

實驗三微生物顯微技術(shù)實驗三微生物顯微技術(shù)必做：四大類微生物的鏡下特征革蘭氏染色酵母菌的計數(shù)選做：芽孢染色微生物大小的測量（1）簡單染色涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢。涂片：取兩塊潔凈無油的載玻片，各滴一小滴生理鹽水(或蒸溜水)于玻片中央，用接種環(huán)挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。干燥、固定：將涂面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥。染色：滴加染液1～2滴于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。呂氏堿性美藍(lán)染色1～2min，石炭酸復(fù)紅(或草酸銨結(jié)晶紫)染色約1min。水洗：傾去染液，用自來水從載玻片一端輕輕沖洗，直至從涂片上流下的水無色為止。干燥：甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風(fēng)吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體）。鏡檢：涂片干后鏡檢。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。注意：滴生理鹽水（蒸餾水）和取菌時不宜過多且涂抹要均勻，不宜過厚。干燥、固定時切勿離火焰太近，以防高溫破壞菌體形態(tài)。水洗時，不要水流直接沖洗涂面。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。水洗時，不要水流直接沖洗涂面。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。（2）革蘭氏染色“三區(qū)”涂片法：在玻片的左、右端各加一滴蒸餾水，用無菌接種環(huán)挑取少量枯草芽孢桿菌與左邊水滴充分混合成僅有枯草芽孢桿菌的區(qū)域，并將少量菌液延伸至玻片的中央。再用無菌的接種環(huán)調(diào)取少量大腸桿菌與右邊的水滴充分混合成僅有大腸桿菌的區(qū)域，并將少量的大腸桿菌液延伸到玻片中央，與枯草芽孢桿菌相混合含有兩種菌的混合區(qū)，干燥、固定。要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色；涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。革蘭氏染色莢膜（3）其他染色芽孢染色鞭毛染色（4）微生物的計數(shù)血球計數(shù)板其他培養(yǎng)法OD值重量法代謝水平比例計數(shù)（一）以數(shù)量變化對微生物生長情況進(jìn)行測定1、顯微鏡直接計數(shù)法1）常規(guī)方法：采用細(xì)菌計數(shù)板或血球計數(shù)板，在顯微鏡下對微生物數(shù)量進(jìn)行直接計數(shù)（計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量）。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；原理：將的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。適用范圍：個體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細(xì)菌等個體較小的細(xì)胞，因為（1）細(xì)菌細(xì)胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。特點：快速，準(zhǔn)確，對酵母菌可同時測定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍(lán)可以區(qū)分死活細(xì)胞。培養(yǎng)法采用培養(yǎng)平板計數(shù)法要求操作熟練、準(zhǔn)確，否則難以得到正確的結(jié)果：樣品充分混勻；同一稀釋度三個以上重復(fù),取平均值；每個平板上的菌落數(shù)目合適（30-300），便于準(zhǔn)確計數(shù)；一個菌落可能是多個細(xì)胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）來表示，而不是直接表示為細(xì)胞數(shù)。膜過濾培養(yǎng)法當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器，然后將將膜轉(zhuǎn)到相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對形成的菌落進(jìn)行統(tǒng)計。Themostprobablenumbermethod（液體稀釋法）對未知樣品進(jìn)行十倍稀釋，然后根據(jù)估算取三個連續(xù)的稀釋度平行接種多支試管，對這些平行試管的微生物生長情況進(jìn)行統(tǒng)計，長菌的為陽性，未長菌的為陰性，然后根據(jù)數(shù)學(xué)統(tǒng)計計算出樣品中的微生物數(shù)目。如某一細(xì)菌在稀釋法中的生長情況如下；稀釋度l0-310-410-5l0-610-710-8

重復(fù)數(shù)555555出現(xiàn)生長的管數(shù)555410

根據(jù)以上結(jié)果，在接種l0-3—10-5稀釋液的試管中5個重復(fù)都有生長，在接種l0-6稀釋液的試管中有4個重復(fù)生長，在接種10-7稀釋液的試管中只有1個生長，而接種10-8稀釋液的試管全無生長。由此可得出其數(shù)量指標(biāo)為“541”，查最大或然數(shù)表得近似值17，然后乘以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)（10-5的稀釋倍數(shù)為100000）。那么，1ml原菌液中的活菌數(shù)＝17×100000=17×105。即每毫升原菌液含活菌數(shù)為l700000個。OD法在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。實驗測量時應(yīng)控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。通常根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細(xì)菌的生長密度要求較高的實驗采用分光光度計一般OD600需標(biāo)準(zhǔn)曲線實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。不能離心，保持懸浮。二微生物生長的測定生理指標(biāo)法