藥物制劑的微生物學(xué)檢測要點(diǎn)復(fù)習(xí)過程

藥物制劑的微生物學(xué)檢測要點(diǎn)一、無菌檢驗(yàn)的基本原則1.嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作

無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止徽生物污染。2.建立方法的驗(yàn)證進(jìn)行藥品的無菌檢查法時，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。3.相關(guān)試劑及培養(yǎng)條件

供試品檢查時，使用的表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對微生物的生長和存活無影響。將供試品分別接種于適合需氧菌、厭氧菌、霉菌生長的培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30～37℃；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23～28℃。4.正確采集樣品

無菌檢驗(yàn)是對整體中部分樣品進(jìn)行隨機(jī)抽檢，來推斷整體是否有菌的情況(無菌或染菌)。因此，在一批藥品的無菌檢驗(yàn)中，取樣數(shù)量愈少，染菌的檢出率愈??；取樣愈多，染菌的檢出率愈大，該批藥品通過無菌檢驗(yàn)的幾率愈小。無菌檢驗(yàn)時取樣量和比例必須嚴(yán)格按規(guī)定執(zhí)行。5.檢查結(jié)果判斷

需氧菌、厭氧菌及霉菌檢查中任何一不符合者，則判供試品不合格。二、無菌檢查的基本方法（一）一般注射劑的無菌檢查

1.一般注射劑指本身不含有任何抗菌或抑菌成分，劑型為水溶性藥品的無菌檢查。2.包含需氧菌、厭氧菌和真菌三類微生物的檢查。3.方法：直接接種法4.將供試品按量分別直接接種于適宜需氧菌、厭氧菌和真菌生長繁殖的一定量培養(yǎng)基中。直接接種法圖示無抗菌作用的供試品抽樣接種于培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基管培養(yǎng)細(xì)菌37℃霉菌、酵母菌25℃接種第二節(jié)藥物的微生物限度檢查藥物的微生物限度檢查，是指非規(guī)定滅菌制劑（如口服藥及外用藥物）及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法。

檢驗(yàn)項(xiàng)目主要有：細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)和控制菌檢測。藥典化學(xué)藥制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求無菌檢查：注射劑、植入劑、沖洗劑。無菌檢查及微生物限度檢查：軟膏劑、眼用制劑、氣霧劑、噴霧劑、散劑、耳用制劑、鼻用制劑、凝膠劑、乳膏劑。

微生物限度檢查：粉霧劑、口服溶液劑、口服混懸劑、口服乳劑、搽劑、洗劑、局部用片劑、酊劑、栓劑、糖漿劑、膜劑、貼劑、灌腸劑、糊劑、涂劑、涂膜劑。原則性要求：丸劑、口服片劑、膠囊劑、顆粒劑。藥典中藥制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求無菌檢查：注射劑。無菌檢查及微生物限度檢查：散劑、軟膏劑、眼用制劑、鼻用制劑、氣霧劑*、噴霧劑。

微生物限度檢查：丸劑、顆粒劑、片劑、錠劑、煎膏劑、膠劑、糖漿劑、合劑、滴丸劑、膠囊劑、酒劑、酊劑、流浸膏劑、浸膏劑、露劑、茶劑、栓劑、貼膏劑(貼劑)、凝膠劑、搽劑、洗劑、涂膜劑.不要求：膏藥。二、口服及外用中藥的微生物學(xué)檢查口服制劑：細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)、大腸桿菌和活螨的檢測外用藥物：綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌一般眼科制劑：細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌

以上藥物均不能檢出致病菌！實(shí)驗(yàn)方法（一）、蜜丸細(xì)菌總數(shù)測定（二）、蜜丸霉菌總數(shù)測定1、無菌條件下隨機(jī)稱取10g蜜丸置研缽中逐漸加入100ml生理鹽水研磨為1：10藥液，分別量取9ml生理鹽水置10ml具塞刻度試管中，其中一支加入1：10藥液1ml后稀釋為1：100后再取1ml加入9ml生理鹽水具塞刻度試管中藥物稀釋為1：1000。2、取10個干烤后玻璃平皿，其中6個平皿，每2個分別加入1：10，1：100，1：1000藥液各1ml，然后加入50℃普通瓊脂培養(yǎng)基、（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）15ml做細(xì)菌培養(yǎng)；剩余的4個平皿，每2個分別加入1：10，1：100，藥液各1ml共4個，然后加入50℃虎紅馬丁培養(yǎng)基15ml做霉菌培養(yǎng)，并立刻轉(zhuǎn)動平板使藥液與培養(yǎng)基充分混勻。10個平板置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后并計數(shù)每個稀釋度的3個平板的菌落均數(shù)。3、選取菌落平均值在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)的測定范圍，將數(shù)得的菌落數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋度得到每克檢測蜜丸中細(xì)菌總數(shù)。選取霉菌菌落平均值在5-50之間的平板作為霉菌總數(shù)的測定范圍，將數(shù)得的菌落數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋度得到每克檢測蜜丸中霉菌總數(shù)。

①當(dāng)僅有1個稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)報告菌數(shù)。②當(dāng)同時有2個稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時，視兩者比值而定。若比值＜2,以兩稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報告菌落數(shù)；若比值＞2但＜5時，以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌落數(shù)；當(dāng)出現(xiàn)比值＞5，或高稀釋級的菌落數(shù)≥低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時，應(yīng)查明原因再行檢查，必要時，應(yīng)進(jìn)行方法的重新驗(yàn)證。高稀釋級的菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)低稀釋級的菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)＝比值菌落數(shù)報告規(guī)則例次菌落均數(shù)比值菌落總數(shù)/g或/ml報告方式/g或/ml稀釋倍數(shù)10-110-210-31136516420-164001600022760295461.6377503800032890271602.227100270004不可計4650513-513000510000527115-2702706不可計30512-3050031000③當(dāng)各稀釋級的平均菌落數(shù)均＜30個，以最低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。④若各稀釋級的平均菌落數(shù)均＞300個，以最高稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。⑤若各稀釋級的平均菌落數(shù)均不在30～300個之間，一個稀釋度大于300個，相鄰另一個稀釋度小于30個，則以接近30～300個的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或測定數(shù)在10個以下時，報告菌數(shù)為＜10個。

被檢藥物細(xì)菌、霉菌總數(shù)應(yīng)在藥典規(guī)定的限量以內(nèi)，否則為不合格。如中藥濃縮丸、中成藥片劑及西藥片劑細(xì)菌數(shù)每克不得超過1000個；中藥蜜丸、小丸每克不得超過10000個。中藥蜜丸、水丸霉菌數(shù)每克不得超過500個；中藥濃縮丸霉菌數(shù)每克不得超過100個。

（二）致病菌檢測

陽性對照試驗(yàn)：供試品進(jìn)行控制菌檢查時，應(yīng)做陽性對照試驗(yàn)。陽性對照試驗(yàn)的加菌量為10～100CFU，方法同供試品的控制菌檢查。陽性對照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。

陰性對照試驗(yàn)：取稀釋液10ml照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。1．大腸埃希菌的檢查

大腸埃希菌是人和動物腸道中寄生的正常菌群，隨糞便排出體外，可直接或間接污染藥物及藥品生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)。服用后有可能被糞便中存在的腸道致病菌或寄生蟲卵等病原體感染。因此，大腸埃希菌被列為糞便污染指示菌，是口服藥品常規(guī)必檢項(xiàng)目。（二）致病菌檢測大腸埃希菌檢查程序

供試品（1:10稀釋）→供試液10ml

↓

不少于100ml的乳糖膽鹽增菌液

↓37℃18~24h

取增菌液劃線轉(zhuǎn)種

↓

伊紅美蘭瓊脂平板（或麥康凱瓊脂平板）

↓┌────────────┐陰性菌落紫黑色、有金屬光澤乳糖發(fā)酵、IMViC試驗(yàn)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、MViC：++--（1）增菌

目的:抑制不需要的細(xì)菌生長，而有利于需檢菌的生長。培養(yǎng)基:乳糖膽鹽(BL)培養(yǎng)基，作用:膽鹽(或去氧膽酸鈉)具有抑制革蘭陽性細(xì)菌生長的作用。

方法：按該品種驗(yàn)證的方法將供試液10ml接種至100ml的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h，必要時可延至48h。（2）分離培養(yǎng)：

伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)或麥康凱瓊脂（MacC）平板將上述培養(yǎng)液劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。

培養(yǎng)基菌落形態(tài)伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB平板）呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤。麥康凱瓊脂（MacC）

鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。

大腸埃希菌菌落形態(tài)特征劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板大腸埃希菌在麥康凱瓊脂平板上發(fā)酵乳糖菌落大腸埃希菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的菌落特征（3）純培養(yǎng)、染色、鏡檢，觀察染色性及形態(tài)（4）生化反應(yīng)

主要是與產(chǎn)氣桿菌進(jìn)行鑒別，大腸埃希菌與產(chǎn)氣桿菌兩者在形態(tài)、染色性、菌落等方面十分相似。因此，須通過生化反應(yīng)來鑒別。挑取可疑菌落做乳糖發(fā)酵試驗(yàn)和IMViC試驗(yàn)——吲哚試驗(yàn)（I）、甲基紅試驗(yàn)(M)、V-P試驗(yàn)(Vi)和枸椽酸鹽利用試驗(yàn)(C)試驗(yàn)。結(jié)果：大腸埃希菌為++--產(chǎn)氣桿菌則為--++

（5）結(jié)果報告完全符合以下結(jié)果：①革蘭氏陰性無芽孢桿菌；②乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣；③IMViC試驗(yàn)反應(yīng)為++--。應(yīng)判定為檢出大腸埃希菌。吲哚試驗(yàn)（I）+-甲基紅試驗(yàn)(M)+-VP試驗(yàn)（Vi）+-枸椽酸鹽利用試驗(yàn)（C）+-I-吲哚（indol）試驗(yàn)色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚

↑吲哚試劑

-+M-甲基紅（methylred）實(shí)驗(yàn)葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇甲基紅-葡萄糖→丙酮酸甲基紅+-+V-VP（Voges-Proskauer）試驗(yàn)葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→二乙?！t色化合物+胍基化合物葡萄糖→丙酮酸××乙酰甲基甲醇--+C-枸櫞酸鹽利用（citrateutilization）試驗(yàn)利用枸櫞酸鹽生長+不能利用--+第三節(jié)藥物的抗菌試驗(yàn)

藥物的抗菌試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱藱z查藥物的抗菌能力，包括藥物的抑菌試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn)。一般先進(jìn)行體外抗菌試驗(yàn)，再進(jìn)行體內(nèi)抗菌試驗(yàn)。該項(xiàng)試驗(yàn)方法

已廣泛應(yīng)用于新藥研究和指導(dǎo)臨床用藥。(一)體外抑菌試驗(yàn)

1.連續(xù)稀釋法

用于測定藥物的最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration，MIC),MIC是指藥物能抑制細(xì)菌生長的最高稀釋度，以μg/ml或U/ml表示，數(shù)值愈小，藥物的抑菌作用愈強(qiáng)。（1）液體培養(yǎng)基稀釋法：

在試管中用液體培養(yǎng)基進(jìn)行2倍系列稀釋藥物→在每管中加等量的試驗(yàn)菌液→16～24h培養(yǎng)→觀察結(jié)果，以能抑制試驗(yàn)菌生長的最低濃度（最高藥物稀釋度）為該藥的MIC。管號抗生素原濃度（μg/ml）抗生素來源管號取藥體積(ml)CAMHB體積（ml)抗生素最終濃度（μg/ml）Log215120(原液)原液19512925121號管（最終濃度，下同）11256835121號管176465644號管（最終濃度，下同）113256644號管131647644號管1783887號管（最終濃度，下同）1142987號管13211087號管171011110號管（最終濃度，下同）110.5-112110號管130.25-213110號管170.125-3液體培養(yǎng)基稀釋法藥敏試驗(yàn)的抗生素溶液稀釋方案

判斷抑菌還是殺菌，應(yīng)將未長菌的試管內(nèi)培養(yǎng)液再移種于瓊脂平板上，如重新長出試驗(yàn)菌，表明該濃度只是抑菌濃度。藥物的抑菌或殺菌作用是在一定條件下相對而言的，這與用藥時培養(yǎng)基的組成、pH及所用的菌種、菌量等因素有關(guān)，所以必須嚴(yán)格控制試驗(yàn)菌、培養(yǎng)基等試驗(yàn)條件。液體培養(yǎng)基稀釋法測定藥物的最小抑菌濃度(MIC)

液體培養(yǎng)基稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）通過平板培養(yǎng)證實(shí)最小殺菌濃度（minimalbactericidalconcentration，MBC）按液體培養(yǎng)基稀釋法操作測出藥物的MIC，將未長菌的各管培養(yǎng)液分別移種到無菌平板上，培養(yǎng)后以無細(xì)菌生長的最低藥物濃度（最高藥物稀釋度）作為該藥物的MBC。（2）固體培養(yǎng)基稀釋法：1）平板法：

方法：將不同濃度的藥液按1︰9混入尚未凝固的瓊脂培養(yǎng)基中→制作成含有遞減濃度藥物的瓊脂平板→將定量的菌液點(diǎn)種法逐個點(diǎn)種于平板→37℃培養(yǎng)24h→測得各種細(xì)菌對藥物的MIC。

應(yīng)用：測定多種細(xì)菌對同一藥物的MIC；各種藥物的抗菌活性測定；新抗菌藥物的篩選。優(yōu)點(diǎn)：不受藥物顏色及渾濁度的影響，且手續(xù)簡便。2）斜面法：方法：將不同遞減濃度的藥液→混入未凝固的裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管中→制成斜面→接種定量的試驗(yàn)菌液→培養(yǎng)→測知MIC（μg/ml）。應(yīng)用：適用于必須較長時間培養(yǎng)的試驗(yàn)菌(如結(jié)核桿菌)或避免孢子飛揚(yáng)污染環(huán)境的霉菌。2.瓊脂擴(kuò)散法

原理：是利用藥物在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散，并在一定濃度范圍內(nèi)抑制細(xì)菌生長，形成無菌生長的透明圈即為抑菌環(huán)。抑菌環(huán)的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（抑菌環(huán)越大，MIC越?。?。

方法：在瓊脂平板上→接種（涂布法或傾注法）試驗(yàn)菌→加藥于平板上→培養(yǎng)18～24h→觀察測量抑菌環(huán)直徑，或抑菌范圍的大小→評價藥物抗菌作用的強(qiáng)弱。

應(yīng)用：用于定性試驗(yàn)；初步判斷藥物的抗菌作用的大小。

（1）濾紙片法：

方法：①無菌濾紙片→蘸取一定濃度的抗菌藥物→放置