微生物菌種篩選與分離

微生物菌種分離

篩選與育種

發(fā)酵工程的生產(chǎn)水平由生產(chǎn)菌種的性能、發(fā)酵條件、提取工藝和生產(chǎn)設(shè)備。其中生產(chǎn)菌種是最重要的，生產(chǎn)菌種最初都來(lái)源于自然界（土壤、空氣、江、河、湖、海）。

一個(gè)菌種能否滿(mǎn)足工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際需要，是否有工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值極為重要。

工業(yè)生產(chǎn)對(duì)生產(chǎn)菌種自身的特性提出了許多要求，這些要求是評(píng)價(jià)生產(chǎn)菌種優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)和菌種選育工作的研究目標(biāo)。

一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)良的生產(chǎn)菌種應(yīng)該具備如下的基本特性：①具有在較短的發(fā)酵周期內(nèi)產(chǎn)生大量發(fā)酵產(chǎn)物的能力。②在發(fā)酵過(guò)程中不產(chǎn)生或少產(chǎn)生與目標(biāo)產(chǎn)品性質(zhì)相近的副產(chǎn)物及其他產(chǎn)物。③生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速率快。④能夠高效地將原料轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品。⑤有廣泛利用不同來(lái)源原材料的能力，并對(duì)發(fā)酵原料成分波動(dòng)敏感性較小。⑥對(duì)需要添加的前體物質(zhì)有耐受能力，并且不能將這些前體物質(zhì)作為一般碳源利用。⑦發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的泡沫要少。⑧具有抗噬菌體感染的能力。⑨遺傳特性穩(wěn)定，保證發(fā)酵過(guò)程能夠長(zhǎng)期、穩(wěn)定地進(jìn)行，同時(shí)有利于實(shí)施最佳的工藝控制。

以上是對(duì)優(yōu)良菌種特性的要求，也是菌種選育工作研究和需要解決的問(wèn)題。生產(chǎn)菌種選育方法：

自然選育、誘變選育、抗噬菌體菌種選育、雜交育種、原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程技術(shù)等。第一節(jié)自然選育

自然選育:

不經(jīng)人工處理，利用微生物自然突變進(jìn)行菌種選育的過(guò)程。自然突變?cè)颍?/p>

1.多因素低劑量的誘變效應(yīng)，

2.互變異構(gòu)效應(yīng)。多因素低劑量的誘變效應(yīng)：是指自然界中低劑量的宇宙射線(xiàn)、各種短波輻射、誘變物質(zhì)和微生物自身代謝產(chǎn)生的誘變物質(zhì)等作用引起的突變。互變異構(gòu)效應(yīng)：指四種堿基第六位上的酮基或氨基的瞬間變構(gòu)，會(huì)引起堿基的錯(cuò)配。

例如胸腺嘧啶（T）和鳥(niǎo)嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出現(xiàn)，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亞氨基式出現(xiàn)。平衡是傾向于酮式或氨基式的，因此DNA雙鏈中以AT和GC堿基配對(duì)為主。但在偶然的情況下，當(dāng)T以烯醇式出現(xiàn)時(shí)的一瞬間，DNA鏈正好合成到這一位置上，與T配對(duì)的就不是A，而是G；若C以亞氨基式出現(xiàn)時(shí)的一瞬間，新合成的DNA鏈這一位置上，與C配對(duì)的就不是G，而是A。據(jù)統(tǒng)計(jì)，這種堿基錯(cuò)誤配對(duì)引起自然突變的幾率為10-5~10-9。自然突變結(jié)果：

1.菌種退化--產(chǎn)物產(chǎn)量或質(zhì)量下降；

2.菌種進(jìn)化--對(duì)生產(chǎn)有益的突變。

注意：

在工業(yè)生產(chǎn)中，由于各種條件因素的影響，自然突變是經(jīng)常發(fā)生的，也造成了生產(chǎn)水平波動(dòng)，所以要注意從高水平的生產(chǎn)批次中，分離高生產(chǎn)能力的菌種再用于生產(chǎn)。

自然選育是一種簡(jiǎn)單易行的選育方法。但是自然選育的效率低，因此經(jīng)常與其它育種方法交替使用，以提高育種效率。自然選育程序:取樣→菌懸液→稀釋→平板分離→單菌落→能力檢測(cè)→菌種。

第二節(jié)誘變選育

微生物有一套嚴(yán)密的代謝機(jī)制。其過(guò)程是被嚴(yán)格調(diào)控的，所有的代謝產(chǎn)物都不會(huì)過(guò)量積累。因此從自然環(huán)境中分離的菌種生產(chǎn)能力有限，一般不能滿(mǎn)足生產(chǎn)的實(shí)際需要。

誘變育種是提高菌種生產(chǎn)能力，使所需要的代謝產(chǎn)物過(guò)量積累的有效方法之一。

3．1誘變育種的原理

誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，突變主要包括染色體畸變和基因突變兩大類(lèi)。

染色體畸變：是指染色體或DNA片段發(fā)生缺失、易位、逆位、重復(fù)等。

基因突變：是指DNA中的堿基發(fā)生變化即點(diǎn)突變。誘變育種：

是利用物理、化學(xué)誘變劑處理微生物細(xì)胞，提高基因突變頻率，再通過(guò)適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。

常用的誘變劑--物理、化學(xué)和生物的三大類(lèi)，見(jiàn)下表。2．2誘變育種的基本方法

誘變育種----誘變和篩選誘變----包括出發(fā)菌株選擇、誘變劑種類(lèi)和劑量選擇，以及合理使用方法。篩選----初篩和復(fù)篩，測(cè)定菌種的生產(chǎn)能力。1）．出發(fā)菌株的選擇①誘變出發(fā)菌株要有目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)能力；②其它生產(chǎn)性能如生長(zhǎng)繁殖快、營(yíng)養(yǎng)要求低、產(chǎn)孢子多且早；③對(duì)誘變劑敏感，則變異幅度大；④產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面情況。另外，可選擇已經(jīng)過(guò)誘變處理的菌株，這樣的菌株對(duì)誘變劑的敏感。2）．誘變劑的使用方法誘變的方法：?jiǎn)我徽T變和復(fù)合誘變。單一誘變：指只用一種誘變劑處理菌種。復(fù)合誘變：指兩種以上誘變劑處理菌種。復(fù)合誘變處理包括同一誘變劑多次處理、兩種以上誘變劑同時(shí)、先后處理或多次處理。3）．誘變劑劑量選擇

對(duì)不同微生物使用的劑型、劑量不同，誘變劑的劑量與致死率有關(guān)，而致死率又與誘變率有一定的關(guān)系。因此，用致死率作為誘變劑劑量選擇的依據(jù)。

一般來(lái)說(shuō)，誘變率隨誘變劑劑量的增加而提高，但達(dá)到一定程度以后，再提高劑量反使誘變率下降。近年來(lái)已將處理劑量從過(guò)去的致死率99％～99.9%降至70％～80％，甚至更低。2．3突變菌株的篩選

誘變后，正向突變的菌株通常較少，菌種性能有可能發(fā)生各種各樣的變異，如營(yíng)養(yǎng)、抗性、代謝、形態(tài)、生長(zhǎng)繁殖和溫度等。這些變異菌種可用各種方法篩選。通過(guò)初篩和復(fù)篩后，還要經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化研究，確定最佳發(fā)酵條件，使高產(chǎn)菌株生產(chǎn)能力充分發(fā)揮出來(lái)。1）．營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株的篩選

營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株的誘變育種具有重要的理論研究和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，已廣泛地在氨基酸、核苷酸生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。在營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株中，生物合成途徑中某一步發(fā)生了酶缺陷，合成反應(yīng)不能完成，末端產(chǎn)物不能積累，因此末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用被解除。只要在培養(yǎng)基中限量加入所要求的末端產(chǎn)物，克服生長(zhǎng)障礙，就能使中間產(chǎn)物積累。2）．抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种仆蛔兙甑暮Y選

末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)在生物合成途徑中是普遍存在的，除了采用篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株來(lái)降低末端產(chǎn)物的濃度外，更加有效的辦法是篩選抗阻遏和抗反饋抑制突變株。這兩種突變均是由于代謝失調(diào)，它們有共同的表型，即在細(xì)胞中已經(jīng)有了大量的末端產(chǎn)物時(shí)，仍不斷合成這一產(chǎn)物。3）．組成型突變株的篩選

在酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)中，常采用在發(fā)酵過(guò)程中分批限量加入誘導(dǎo)物的方法，提高誘導(dǎo)酶的活性。為解除對(duì)誘導(dǎo)物的依賴(lài)，可通過(guò)誘變改變菌種的遺傳特性，篩選組成型突變株。突變發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或操縱基因，都可獲得組成型突變株。篩選的方法是設(shè)計(jì)某種有利于組成型菌株生長(zhǎng)，并限制誘導(dǎo)型菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，造成組成型菌株生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)或適當(dāng)?shù)姆直鎯深?lèi)菌落的方法，選出組成型突變菌株。

4)．抗性突變株的篩選

①抗生素抗性突變。②抗噬菌體菌株的選育。③條件抗性突變。④敏感突變。

第三節(jié)雜交育種

雜交育種：是將不同菌株的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換、重組，使不同菌株的優(yōu)良性狀集中在重組體中，克服長(zhǎng)期誘變引起的生活力下降等缺陷。通過(guò)雜交還可以擴(kuò)大變異范圍，改變產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，創(chuàng)造出新品種。

3.1細(xì)菌的雜交育種

細(xì)菌的雜交可以通過(guò)細(xì)菌接合、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、R因子轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方法促使基因重組。3.2放線(xiàn)菌的雜交育種

放線(xiàn)菌的雜交包括混合培養(yǎng)法、平板雜交法和玻璃紙轉(zhuǎn)移法三種：金霉素、新霉素、紅霉素和新生霉素等抗生素產(chǎn)生菌的雜交育種中，都有成功的報(bào)道。3.3霉菌的雜交育種1．準(zhǔn)性生殖準(zhǔn)性生殖是指真菌不通過(guò)有性生殖的基因重組過(guò)程。準(zhǔn)性生殖過(guò)程包括異核體形成、二倍體形成和體細(xì)胞的重組。

3.4酵母的雜交育種

酵母菌是雙單性微生物，存在著單倍體和二倍體生活史；酵母雜交育種有三種雜交方式：即孢子與孢子、單倍體細(xì)胞與孢子、以及細(xì)胞間雜交。

第四節(jié)原生質(zhì)體融合技術(shù)

對(duì)微生物育種來(lái)說(shuō)，有性重組的局限性很大，迄今發(fā)現(xiàn)有雜交現(xiàn)象的微生物并不多，這就妨礙了基因重組在微生物育種中的應(yīng)用。原生質(zhì)體融合技術(shù)提供了充分利用遺傳重組雜交的方法。

原生質(zhì)體融合技術(shù)首先是在動(dòng)植物細(xì)胞融合研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，然后才應(yīng)用于真菌、細(xì)菌和放線(xiàn)菌。由于這一技術(shù)可以打破種屬間的界限，提高重組頻率，擴(kuò)大重組幅度，而倍受關(guān)注。

4.1原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性

原生質(zhì)體融合方法:首先用酶分別酶解兩個(gè)出發(fā)菌株的細(xì)胞壁，在高滲環(huán)境中釋放出原生質(zhì)，將它們混合，在助融劑或電場(chǎng)作用下，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞融合，實(shí)現(xiàn)遺傳重組。4.2原生質(zhì)體融合方法

原生質(zhì)體融合技術(shù)包括:原生質(zhì)體制備，原生質(zhì)體融合，原生質(zhì)體再生和融合子篩選等步驟。1）原生質(zhì)體制備

使用各種酶分別酶解兩個(gè)出發(fā)菌株的細(xì)胞壁，釋放出原生質(zhì)體;為防止原生質(zhì)體內(nèi)部滲透壓過(guò)高而破裂，必須將原生質(zhì)體釋放到高滲溶液中。各種微生物細(xì)胞壁組成不同，須采用不同的原生質(zhì)體制備方法。

革蘭氏陽(yáng)性枯草桿菌和巨大芽抱桿菌的細(xì)胞壁——溶菌酶；黃色短桿菌的原生質(zhì)體制備是先加青霉素培養(yǎng)1.5h后，再用酶消化；革蘭氏陰性細(xì)菌則要采用EDTA加溶菌酶，或甘氨酸一溶菌酶一EDTA，或在含青霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)等條件下制備原生質(zhì)體；

鏈霉菌一般在含甘氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，用溶菌酶消化；酵母的原生質(zhì)體制備是首先接種在疏基乙醇和EDTA的溶液中培養(yǎng)，再用細(xì)胞壁溶解酶消化獲得。或者用蝸牛酶或纖維素酶消化時(shí)，添加疏基乙醇來(lái)提高原生質(zhì)體的形成率。幾丁質(zhì)酶、蝸牛酶、纖維素酶、硫酸脂酶多用于制備霉菌的原生質(zhì)體。2)原生質(zhì)體融合和再生

兩個(gè)出發(fā)菌株制備的原生質(zhì)體可以通過(guò)化學(xué)因子或電場(chǎng)誘導(dǎo)的方法進(jìn)行融合?；瘜W(xué)因子誘導(dǎo)：采用聚乙二醇（PEG）4000和6000作為融合劑，并加Ca2+和Mg2+等陽(yáng)離子。電融合過(guò)程是原生質(zhì)體在電場(chǎng)中極化成偶極子，并沿電力線(xiàn)方向排列成串，再加直流脈沖擊穿原生質(zhì)體膜，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。

融合后的原生質(zhì)體具有生物活性，但由于缺少細(xì)胞壁，不是正常的細(xì)胞，不能在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。所以要涂布在高滲培養(yǎng)基上令其再生。可以增加高滲培養(yǎng)基的滲透壓或添加蔗糖來(lái)增加再生率。3)融合子的檢出

融合子是在選擇性培養(yǎng)基上檢出，即通過(guò)兩個(gè)遺傳標(biāo)記互補(bǔ)確定的，如利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)，在基本培養(yǎng)基上識(shí)別融合子。當(dāng)親株沒(méi)有或很少標(biāo)記的情況下，可利用滅活的原生質(zhì)體（單親株或雙親株滅活均可）融合，篩選有生物活性的重組子。

此外可以利用熒光染色，將兩個(gè)親株用不同的熒光色素染色并融合后，在落射熒光裝置的立體顯微鏡下觀察融合子；如在一個(gè)個(gè)體上觀察到雙親的兩種熒光色素，即為融合子。

通過(guò)上述方法產(chǎn)生的融合子如果產(chǎn)生了雜合雙倍體或單倍重組子，其遺傳性狀比較穩(wěn)定。但也可能產(chǎn)生的融合子是一種短暫的融合，會(huì)再次分離成親本類(lèi)型。所以還要再進(jìn)行多次篩選，找到穩(wěn)定的融合子。第五節(jié)基因工程技術(shù)

基因工程或DNA體外重組技術(shù)：將外源DNA通過(guò)體外重組后，導(dǎo)人受體細(xì)胞，使其在受體細(xì)胞中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的技術(shù)?；蚬こ叹a(chǎn)生的主要程序包括：目的基因的克隆，DNA重組體的體外構(gòu)建，重組DNA導(dǎo)人宿主細(xì)胞以及基因工程菌的選擇。第六節(jié)菌種保藏

菌種的保藏方法很多，其基本原理是：根據(jù)微生物的生理生化特性，人為地創(chuàng)造