第二章 海洋生物技術(shù)之生物活性物質(zhì)課程之三

海洋生物活性物質(zhì)

MARINEBIOACTIVESUBSTANCE海洋生物活性物質(zhì)一、概論二、海洋生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)類型三、海洋生物活性物質(zhì)研究領(lǐng)域四、海洋藥物開發(fā)的成功案例3.3海洋微生物活性物質(zhì)簡介海洋微生物活性物質(zhì)

海洋動植物的活性物質(zhì)有80%是由其共附生的微生物產(chǎn)生的。

如：海兔毒素—巨大鞘絲藻大環(huán)內(nèi)酯類（如海鞘素、苔蘚蟲素等）—顫藻屬、前溝藻大田軟海綿酸、石房蛤毒素、西加魚毒—微藻不飽和脂肪酸、河豚毒素等海洋微生物的主要特點(diǎn)嗜鹽性適冷性適壓性低營養(yǎng)性趨化性和附著生長：微生物黏膜發(fā)光性海洋微生物主要類群細(xì)菌放線菌真菌古菌約180種弧菌特殊性抗生素酵母菌海洋霉菌木生真菌多為極端環(huán)境菌海洋微生物資源及應(yīng)用

在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的作用：重要的分解者和生產(chǎn)者生物活性物質(zhì)：醫(yī)藥；酶；其他環(huán)境凈化其他應(yīng)用危害（如赤潮）紅潮一紅潮二海洋微生物種群是陸地的20倍以上，達(dá)到上億種，但已經(jīng)研究和鑒定過的還不到其總量的1%。由于特殊的生存環(huán)境，海洋微生物擁有與陸地不同的基因和代謝途徑，能生產(chǎn)具有特殊結(jié)構(gòu)和生理活性的代謝產(chǎn)物，為研究與開發(fā)海洋微生物藥物和其他微生物產(chǎn)品提供了豐富的資源。與其它海洋生物資源相比，海洋微生物具有生長周期短、代謝易調(diào)控、菌種易改良、選育簡單以及可大規(guī)模發(fā)酵實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)勢。海洋微生物產(chǎn)品“研發(fā)鏈”發(fā)現(xiàn)中試產(chǎn)業(yè)化目標(biāo)導(dǎo)向探索導(dǎo)向重點(diǎn)項(xiàng)目？20世紀(jì)80年代以來，世界一些沿海發(fā)達(dá)國家紛紛將開發(fā)海洋作為其基本國策，把有效利用海洋生物資源、大力發(fā)展海洋生物產(chǎn)品作為研究重點(diǎn)和優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域。美、日、英、法、俄等國家分別推出了“海洋微生物專項(xiàng)”、“海洋微生物生物工程”、“深海之星”、“歐洲冷酶計(jì)劃”等計(jì)劃和項(xiàng)目，投入巨資發(fā)展海洋微生物技術(shù)，取得了引人注目的成就，促進(jìn)了一批新興產(chǎn)業(yè)的形成和發(fā)展。技術(shù)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢國際上批準(zhǔn)的抗感染藥物頭孢霉素就來源于真菌；發(fā)現(xiàn)的15000多個(gè)海洋天然產(chǎn)物中，72%來源于海洋微生物；其中約1/2具有各種生物活性；有10余個(gè)化合物已進(jìn)入臨床研究，如來源于海洋藍(lán)細(xì)菌的Cyanovirin-N（抗AIDS）已進(jìn)入II/III期臨床；來源于深海嗜熱古菌的Taq酶已創(chuàng)造了90億美元的經(jīng)濟(jì)效益；低溫酶在洗滌、食品工業(yè)、環(huán)境生物治理、生物催化中已得到廣泛應(yīng)用。國內(nèi)海洋微生物產(chǎn)品的研究與開發(fā)海洋微生物天然產(chǎn)物：分離獲得了20325株海洋微生物，分離鑒定出619個(gè)活性化合物(其中新結(jié)構(gòu)129個(gè))；海洋微生物藥物先導(dǎo)化合物：近10個(gè)高活性、結(jié)構(gòu)新穎的抗腫瘤、抗病毒、抗菌和免疫抑制活性的天然產(chǎn)物確定為具有藥用開發(fā)前景的先導(dǎo)化合物；海洋微生物藥物：1個(gè)藥物進(jìn)入臨床研究（K-001）；2個(gè)藥物基本完成臨床前研究（YCP、雷普克）；海洋微生物酶：海洋蛋白酶、溶菌酶和脂肪酶進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化，克隆獲得了一批新穎生物酶基因(幾丁質(zhì)酶、β-瓊膠酶A和B、海洋適冷蛋白酶等)并進(jìn)行了產(chǎn)業(yè)化前期研究；海洋微生物農(nóng)藥：完成了農(nóng)用海洋微生物菌株及其活性產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模及部分田間藥效評價(jià)。完成了II期臨床試驗(yàn)：對胃癌、腸癌、肝癌及淋巴瘤有較好療效，多數(shù)病例生存質(zhì)量提高。

獲得國內(nèi)外專利授權(quán)抗腫瘤海洋新藥K-001抗腫瘤新藥真菌多糖YCP建立了穩(wěn)定的中試發(fā)酵工藝，解決了藥源問題制訂原料藥的初步質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了制劑工藝的研究，確定了凍干制劑的處方基本完成臨床前研究申請國際專利1項(xiàng)StructureoftherepeatingunitofYCP臨床前研究I類抗腫瘤新藥藻膽蛋白-雷普克建立了原料藥的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)完成了藥效藥理學(xué)試驗(yàn)，一般藥理學(xué)研究開始進(jìn)行雷普克的藥代動力學(xué)和長毒研究海洋微生物酶制劑產(chǎn)業(yè)化

在洗滌劑、紡織、飼料、醫(yī)療等多個(gè)行業(yè)中推廣應(yīng)用產(chǎn)品500余噸，新增產(chǎn)值6186.9萬元獲得復(fù)合酶產(chǎn)品報(bào)批文1項(xiàng)、獸用生物制品批準(zhǔn)文1項(xiàng)及生產(chǎn)許可證、新產(chǎn)品企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)3項(xiàng)，申請發(fā)明專利11項(xiàng)

青島科谷酶業(yè)有限公司(總投資7424萬元)，國家發(fā)改委立項(xiàng)，年生產(chǎn)7900噸，建成發(fā)酵、提取及輔助生產(chǎn)車間21000㎡在養(yǎng)殖行業(yè)中的應(yīng)用在洗滌行業(yè)中的應(yīng)用

重組海洋幾丁質(zhì)酶生產(chǎn)幾丁寡糖中試生產(chǎn)低分子量寡糖具有多種生物活性，在口腔醫(yī)學(xué)、人體免疫、抗癌領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用獲得較為理想的幾丁質(zhì)酶工業(yè)生產(chǎn)菌株建立幾丁寡糖噸級生產(chǎn)線完成高純度幾丁寡糖的制備工藝藥物先導(dǎo)化合物1403C（抗腫瘤）IC50＜10μg/mL，對多藥耐藥性乳腺癌細(xì)胞具有強(qiáng)活性?？鼓[瘤作用與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。LD5016mg/kgACT-007（抗腫瘤）PTK和PKC抑制劑，IC503-80μM；小鼠口服LD50>50mg/kg；體內(nèi)藥效學(xué)試驗(yàn)（Lewis肺癌）的抑瘤率超過25%MacrolactinO（抗腫瘤、抗病毒）對黑色素瘤細(xì)胞IC50為3.5μg/mL，對I型和II型單純皰疹病毒的IC50為5.0和8.3μg/mL，阻斷HIV在T-細(xì)胞中的復(fù)制雙酚類（免疫抑制劑）免疫抑制效應(yīng)強(qiáng)于環(huán)孢素A，抑制T細(xì)胞功能，下調(diào)Th1型細(xì)胞因子。安全（LD502.45g/kg）?；瘜W(xué)合成成本低FC（免疫抑制劑）具有和臨床一線藥物環(huán)孢素A相等的免疫抑制效應(yīng)，40mg/kg腹腔注射安全。抑制T細(xì)胞功能，下調(diào)Th1型細(xì)胞因子倍半萜類生物（抗腫瘤）對P-388、A549細(xì)胞具有較好細(xì)胞毒活性，其IC50為6.19μg/mL，安全性較強(qiáng)（對小鼠LC50為250μg/ml）二酮哌嗪PJ157（抗腫瘤）對多種人腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用和腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，對S180的抑制率為51％，2.1mg/Kg未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用海藻糖酶應(yīng)用于海藻糖的生產(chǎn)，產(chǎn)品可作為新一代生物制劑（蛋白制劑、活疫苗）保護(hù)劑，500L試產(chǎn)成功。酶活性超過國外同類產(chǎn)品。海洋低溫纖維素酶用于纖維素和木質(zhì)素的高效和低能消耗降解，用于制備清潔能源，200L試產(chǎn)成功。酶活性超過國外同類產(chǎn)品。海藻多糖降解酶獲得新型褐藻膠裂合酶、瓊膠酶、卡拉膠酶，產(chǎn)物中有些為寡糖藥物原料。已建立了產(chǎn)率高、成本低的酶制備工藝。新穎海洋生物酶BSw10005生物殺菌劑海單胞菌制劑。對枯萎病菌、玉米葉斑病菌、黃萎病菌、小麥赤霉病菌、瓜炭疽病菌、甜瓜果腐病菌、禾谷鏈孢菌和海洋弧菌等均有抑制作用。已完成盆栽試驗(yàn)。農(nóng)用抗菌素康寧霉素對番茄潰瘍病菌、尖孢鐮刀菌、小麥根腐病菌和立枯絲核菌均有很強(qiáng)的抑制作用。結(jié)構(gòu)清楚，作用機(jī)理明確。已完成盆栽試驗(yàn)。生物農(nóng)藥B-9987來源于海洋芽孢桿菌，對霜霉病、早疫病、灰霉病、稻瘟病具有明顯防效（盆栽和田間試驗(yàn)）。新型殺蟲劑H1893來源于海洋真菌（H1893），其代謝產(chǎn)物對伊蚊幼蟲、致倦庫蚊幼蟲及家蠅成蟲、斜紋夜蛾幼蟲、甜菜夜蛾幼蟲和柑橘全爪螨有很高的毒殺活性。新穎海洋生物農(nóng)藥發(fā)展趨勢迄今為止，國內(nèi)外已從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種具有廣闊應(yīng)用前景的活性化合物，但由于絕大多數(shù)的活性化合物在海洋微生物中含量低，成為海洋微生物產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用的瓶頸。因此，菌株的選育、發(fā)酵工藝的優(yōu)化與放大、活性物質(zhì)的規(guī)?；苽涞汝P(guān)鍵技術(shù)及其中試研究得到了極大的關(guān)注。國際上已經(jīng)從海洋微生物資源的獲取趨于海洋微生物產(chǎn)品的開發(fā)與其生產(chǎn)制備相關(guān)高新技術(shù)的研發(fā)上。重點(diǎn)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)海洋微生物的大規(guī)模培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)海洋微生物產(chǎn)物的大規(guī)模制備和質(zhì)量控制技術(shù)與國際接軌的海洋微生物產(chǎn)物的安全性評價(jià)與代謝研究等技術(shù)第四節(jié)

海洋天然產(chǎn)物研究實(shí)例美國UniversityofIllinois.1972年發(fā)現(xiàn)加勒比海背囊類動物紅樹海鞘(Ecteinascidia

turbinata)有抗腫瘤活性成分。1990年確定其結(jié)構(gòu)，為大環(huán)內(nèi)酯生物堿化合物（四氫異喹啉類化合物）；1996年全合成。目前正在進(jìn)行Ⅱ期臨床。1972-1996(fromcrudeextractstototalsynthesis).作用機(jī)制：通過與DNA結(jié)合后抑制腫瘤DNA轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也能抑制多藥耐藥基因（mdr21）活性，可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡，其作用呈劑量依賴方式。研究還發(fā)現(xiàn)ET-743能夠在高濃度時(shí)引起腫瘤細(xì)胞死亡，在低濃度可以影響腫瘤細(xì)胞周期。在美國和歐洲進(jìn)行的期臨床中對實(shí)體瘤顯示出較好的療效。很可能成為第一個(gè)正式應(yīng)用于臨床的海洋抗癌藥。加勒比海海鞘(E.turbinata)豐度有限，可以以細(xì)菌pseudomonasflourenscens中發(fā)現(xiàn)的safracinB為前身物質(zhì)，通過半合成途徑獲得ET-743。西班牙馬爾制藥公司利用養(yǎng)殖的加勒比海海鞘增加了臨床實(shí)驗(yàn)用ET-743的供應(yīng)（每年40t）。美國佛羅里達(dá)州規(guī)定允許采集30kg加勒比海海鞘，但取樣量不能超過群體的50％，不能移動天然地基。ET-743與一種微生物的代謝物非常類似，由這種微生物可以合成ET-743。有趣的是，ET一743與一種微生物代謝物非常類似，由這種微生物可以合成ET-743。草苔蟲bryostatins抗癌活性成分研究草苔蟲（Bugulaneritina）是一種海洋底棲動物，廣泛分布于世界各海洋。自1968年首次發(fā)現(xiàn)它的抗癌活性以來，從中已分離得到十幾個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類化合物Bryostatins。草苔蟲（Bugulaneritina）是一種海洋底棲動物，廣泛分布于世界各海洋。自1968年首次發(fā)現(xiàn)它的抗癌活性以來，從中已分離得到十幾個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類化合物Bryostatins。本文將從專利文獻(xiàn)的角度追溯這些Bryostatins抗腫瘤物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和研究歷程。

苔蘚蟲的Brystatin-1化學(xué)結(jié)構(gòu)時(shí)間研究機(jī)構(gòu)海洋動物化學(xué)物質(zhì)活性專利1983美國Arizona州立大學(xué)BugulaneritinaL.Amatneaconvoluta(Bryozoanphylum)bryostatin1-3抗腫瘤活性US45607741984Arizona州立大學(xué)BugulaneritinaL.Amatneaconvoluta(Bryozoanphylum)Bryostatin4-8抗腫瘤活性US46110661986Arizona州立大學(xué)Bugulaneritina(Linneaeus)(Bryozoanphylum)Bryostatin9-13抗腫瘤活性US48332571996Arizona州立大學(xué)腫瘤研究院和化學(xué)系Bugulaneritina(Linneaeus)(Bryozoanphylum)bryostatin16-18抗腫瘤活性EP03245741997第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院BugulaneritinaL.Bryostatin19抗腫瘤活性CN97106686.81998第二軍醫(yī)大學(xué)BugulaneritinaL.CN98121986.11999美國衛(wèi)生部和Arizona州立大學(xué)董事會C-26位修飾的bryostatin1、2、4-13抗腫瘤活性US60605052003第二軍醫(yī)大學(xué)BugulaneritinaL.草苔蟲總內(nèi)酯抗SARS病毒和保護(hù)被感染細(xì)胞CN03129469.3

生物勘探過程通常分為2個(gè)階段。初級采集是從大量物種中各提取少量樣本，以鑒別hit或可能的先導(dǎo)物，隨著工藝(如小型化)的改進(jìn)和天然產(chǎn)物化學(xué)的發(fā)展，在過去30年中初級采探階段的對每個(gè)物種取樣量顯著減少。例如，在1974-1981年間，澳大利亞悉尼羅氏海洋藥物研究所需要l0kg(濕重)樣本來篩選、分離和鑒定一個(gè)化合物結(jié)構(gòu)。而在2004年，一些研究者宣稱鑒定一個(gè)活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)只需100g樣本，篩選水平僅為20-40g或單一樣本，但通常的樣本采集量為0.5-1kg，鑒別出hit或者先導(dǎo)物后進(jìn)行第2階段的采集過程。第二階段的采集(二次采集)量比第一階段要大，這是因?yàn)椋?)一些化合物在天然產(chǎn)物中的濃度非常低，需要大規(guī)模的采集才能滿足研發(fā)過程的需要；2)活性化合物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性使得工業(yè)合成極其困難，且并不經(jīng)濟(jì)。二次采集量的大小取決于有機(jī)體中化合物的含量(通常是l0-4-l0-6，甚至低至10-9)、試驗(yàn)的類型和范圍、需要的劑量(標(biāo)準(zhǔn)是效率最高，毒性最小，化合物的可溶性、替代物的可獲得性和許可限制。1988年在加利福尼亞南部的二次采集中，從13t東太平洋苔蘚蟲(Bugulaneritina)中僅分離到18g抗腫瘤活性化合物bryostatin1，這種化合物被用于臨床前研究和臨床試驗(yàn)。例如東太平洋苔蘚蟲(一種普遍存在的污泥有機(jī)物)的二次采集