SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量解析

蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法【試驗?zāi)康摹坷斫怆娪痉y定蛋白質(zhì)分子量的原理。駕馭SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法的基本操作學(xué)會繪制標(biāo)準曲線?！驹囼炘怼烤郾０纺z由丙烯酰胺（Acr）和N，N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）聚合而成，是一種具有交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，可以產(chǎn)生分子篩效應(yīng)，其孔徑大小可以通過配置藥品的濃度來限制，常用作電泳的載體。本試驗利用了聚丙烯酰胺凝膠的電泳和分子篩雙重作用。

十二烷基硫酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，它的疏水端可以與蛋白質(zhì)分子結(jié)合。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的質(zhì)量比為1.4:1，使蛋白質(zhì)帶上密度相同的負電荷，其電荷強度遠遠強于蛋白質(zhì)原有的電荷，這就掩蓋因為蛋白質(zhì)種類不同而造成的電荷差異，使電泳的遷移率僅與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。因此，我們可以測定標(biāo)準蛋白質(zhì)的遷移率，通過標(biāo)準蛋白質(zhì)相對遷移率的對數(shù)對相對分子量作圖，得到標(biāo)準曲線，依據(jù)標(biāo)準曲線計算出未知蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。本試驗就是依據(jù)這個原理進行測定的?！驹囼炂鞑摹緿YCZ-24D型垂直板電泳儀移液管若干100mL燒杯微量進樣器瘦長頭吸管【試劑配制】1.分別膠和濃縮膠

試劑名稱Acr/gBis/g1mol/L鹽酸/mL三甲基氨基甲烷（Tris）/g定容體積/mL分離膠貯存液300.8100（棕色瓶，冰箱中保存）分離膠緩沖液4836.3100濃縮膠貯存液100.5100（棕色瓶，冰箱中保存）濃縮膠緩沖液485.98100【試劑配制】2.電泳緩沖液（Tris-甘氨酸緩沖液，pH=8.3）：取Tris6.0g，甘氨酸28.8g，SDS1.0g，用去離子水溶解后定容至1L。3.樣品溶解液（用于溶解標(biāo)準蛋白質(zhì)及樣品蛋白質(zhì)）：取SDS0.1g，巰基乙醇0.1mL，甘油1.0mL，溴酚藍28.8g，0.2mol/L磷酸緩沖液0.5mL，加重蒸餾水至10mL。4.染色液：0.25g考馬斯亮藍R-250，加入454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸。5.脫色液：75mL冰乙酸，875mL水與50mL甲醇6.10%過硫酸鈉、10%SDS、1%四甲基乙二胺（TEMED）【試劑配制】【試驗材料及預(yù)處理】

選用5種相對分子質(zhì)量已知的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準蛋白質(zhì)：溶菌酶（Mr=14300）胰凝乳蛋白酶原（Mr=25000）胃蛋白酶（Mr=35000）卵清蛋白（Mr=43000）血清白蛋白（Mr=67000）

可以配成單一標(biāo)準蛋白質(zhì)溶液，也可配制成混合蛋白質(zhì)標(biāo)準溶液。將標(biāo)準蛋白質(zhì)和待測蛋白質(zhì)用樣品溶解液溶解，使?jié)舛葹?.5mg/mL，沸水浴加熱3min，冷卻至室溫備用。對以上標(biāo)準蛋白質(zhì)相對遷移率的測定，以相對遷移率的對數(shù)對標(biāo)準蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量作圖，可得標(biāo)準曲線，由標(biāo)準曲線求出待測蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。

【試驗步驟及操作方法】

1.安裝垂直板電泳槽將密封膠條放在平直玻璃板上，將凹形玻璃板與平直玻璃板重疊。用手將兩塊玻璃板夾住，放入電泳槽內(nèi)。用蒸餾水檢漏【試驗步驟及操作方法】2.凝膠制備（1）分別膠分別膠按下表加入試劑試劑體積操作分離膠貯存液5.0分離膠緩沖液2.510%SDS0.2去離子水10.21%TEMED2.0混勻10%過硫酸銨0.1置于磁力攪拌器中攪拌2min混合后的分別膠溶液，用瘦長頭吸管加入玻璃板縫隙內(nèi)，加膠高度距離樣品模板梳齒下端約1cm，用吸管在凝膠表面輕輕加一層蒸餾水（約3-4cm），使凝膠隔絕空氣，并保持膠面平整。等待分別膠凝固后，將水倒出并用濾紙吸干剩余的水。（2）.濃縮膠濃縮膠按下表加入試劑

試劑體積操作濃縮膠貯存液3.00濃縮膠緩沖液1.251%TEMED2.00去離子水4.6010%過硫酸銨0.05置于磁力攪拌器中攪拌2min用瘦長頭習(xí)慣將分別膠溶液加入分別膠上方，距離段玻璃板上沿0.5cm處，然后輕輕加上模板梳，等待濃縮膠凝固后，當(dāng)心取出模板梳，用手夾住兩塊玻璃板，取出膠室，去掉密封膠框，用1%電泳緩沖液瓊脂膠密封底部，再將膠室放入電泳槽，然后加入電泳緩沖液，內(nèi)槽加到凹口以上，外槽加到具平直玻璃板上沿3mm處。3.電泳用微量進樣器取10-15μL樣品，當(dāng)心加入到凝膠凹槽內(nèi)，待全部樣品全部加完之后，打開電源起先電泳。電泳起先時，將電流調(diào)至10mA，待樣品到達分別膠與濃縮膠交界時，將電流調(diào)整至20-30mA，當(dāng)溴酚藍遷移到分別膠底部時，可以關(guān)閉電源停止電泳。4.染色與脫色取出玻璃膠室，輕輕撬開玻璃板，取出凝膠。將凝膠轉(zhuǎn)移到裝有染色液的培育皿中，染色1h左右，然后取出，用蒸餾水漂洗凝膠，轉(zhuǎn)入脫色液中脫色，同時放在搖床上震蕩，期間更換3-4次脫色液，直到可以清晰的辨別蛋白質(zhì)條帶。5.結(jié)果處理以標(biāo)準蛋白質(zhì)的相對遷移率的對數(shù)對相對分子質(zhì)量作圖，得到標(biāo)準曲線，依據(jù)標(biāo)準曲線求出待測蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量【留意事項】每次試驗必需繪制標(biāo)準曲線，不得運用上一次的標(biāo)準曲線處理好的蛋白質(zhì)樣品液假如長期存放，運用前應(yīng)先在沸水浴中加熱1min以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。若樣品為溶液，則須要降樣品溶解液濃度提高一倍，再與樣品等體積混合。在向玻璃縫隙中注膠時，應(yīng)保持在一點加入，而加水時，要不斷移動吸管。進樣時，要留意不要太快或?qū)疾奂拥奶珴M，防止樣品溢出，對其他凹槽造成交叉污染。Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，甲醇也是劇毒