體外分析技術(shù)

體外分析技術(shù)第一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日1定義與分類一、體外放射分析技術(shù)：在體外實(shí)驗(yàn)條件下，以特異性結(jié)合反應(yīng)為生物學(xué)基礎(chǔ)，以結(jié)合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律為共同方法學(xué)基礎(chǔ)，利用核射線對(duì)體內(nèi)的各種生物活性物質(zhì)進(jìn)行體外定量分析的各種方法。二、分類：1、競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析法（如RIA）2、非競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析法（如IRMA）3、由體外放射分析技術(shù)派生出來的非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)（酶、化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光分析）第二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日2第一節(jié)放射免疫分析法radioimmunoassay，RIA

1959年，美國(guó)的兩位科學(xué)家Berson和Yalow首次將示蹤技術(shù)的高度靈敏性和免疫學(xué)抗原-抗體結(jié)合的高度特異性結(jié)合起來，創(chuàng)立了放射免疫分析技術(shù)，開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測(cè)定技術(shù)的新時(shí)代。RIA

的特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好。經(jīng)不斷改進(jìn)，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)和科學(xué)研究的很多領(lǐng)域。第三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日3一、基本原理競(jìng)爭(zhēng)性抑制被測(cè)量的微量物質(zhì)Ag（未標(biāo)記抗原）和標(biāo)記有放射性核素的該種物質(zhì)*Ag(標(biāo)記抗原)對(duì)其抗體Ab有相同的結(jié)合能力，反應(yīng)時(shí)，Ag和一定量的*Ag競(jìng)爭(zhēng)有限量的Ab。生成的*AgAb的量隨Ag的增加而減少，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。反應(yīng)達(dá)到平衡后，分離*AgAb（B）與*Ag（F），B、F或B/F與Ag的量呈函數(shù)關(guān)系，利用這一函數(shù)關(guān)系求出待測(cè)抗原的的濃度。第四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日4反應(yīng)式第五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日5具體方法用一系列濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)抗原（濃度遞增的標(biāo)準(zhǔn)品）在嚴(yán)格相同的條件下與一定量的*Ag和有限量的Ab共同反應(yīng)，反應(yīng)達(dá)到平衡后，分離B與F，測(cè)定B的放射性做為縱坐標(biāo)，以每一反應(yīng)管的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)被測(cè)抗原試管中的B的CPM值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出該抗原的濃度第六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日6函數(shù)式第七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日7標(biāo)準(zhǔn)曲線第八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日8得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線之所以是曲線而不是直線，這是可逆反應(yīng)的質(zhì)量作用定律決定的。函數(shù)式見上圖根據(jù)放射免疫分析法的基本原理，建立放射免疫分析必須具備以下技術(shù)條件：1、可靠的標(biāo)準(zhǔn)品2、高比活度的標(biāo)記品3、高親和力的抗體4、合適的分離技術(shù)5、理想的曲線擬合方式第九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日9二、基本方法（一）基本試劑放射免疫分析反應(yīng)需要三種基本試劑：

1、標(biāo)準(zhǔn)品（非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)抗原）

2、標(biāo)記抗原

3、抗體第十頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日101、標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品是樣品定量的基礎(chǔ)，它的質(zhì)和量的變化直接影響待測(cè)樣品的測(cè)定值。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的要求如下：1）標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品應(yīng)屬于同一種物質(zhì)；2）在與抗體反應(yīng)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品應(yīng)有相同的活性和親和能力；3）高度純化，不含有影響分析的雜質(zhì)；4）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的定量一定要精確第十一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日112、標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原是樣品測(cè)量的基礎(chǔ)對(duì)標(biāo)記抗原的要求是：

1）比活度和放射化學(xué)純度必須足夠高——以保證分析的靈敏度標(biāo)記抗原的放化純必須不小于95%2）放射性核素的半衰期合適

3）標(biāo)記抗原的生理活性未改變

4）標(biāo)記抗原的應(yīng)有較高的穩(wěn)定性第十二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日123、抗體在放射免疫分析中，抗體質(zhì)量的好壞是影響放射免疫分析的關(guān)鍵因素之一。高質(zhì)量的抗體必須具備三個(gè)條件：高親和力、高特異性、高滴度第十三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日131）高親和力只有高親和力的抗體才能得到斜率高的標(biāo)準(zhǔn)曲線，而斜率高的標(biāo)準(zhǔn)曲線是高靈敏度和高精密度的必備條件。親和力測(cè)定方法最常用的是Scatchard作圖法（P36）

KA值越大（即直線斜率越大），抗體的親和力越大方法的靈敏度和精密度越高第十四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日142）高特異性抗體必須與反應(yīng)系統(tǒng)中抗原以外的物質(zhì)尤其是抗原類似物結(jié)合得少，以免影響分析結(jié)果抗體特異性的測(cè)定：方法：測(cè)抗體的交叉反應(yīng)率交叉反應(yīng)率越小，抗體的特異性越高第十五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日153）高滴度滴度是抗體實(shí)際應(yīng)用時(shí)的稀釋倍數(shù)抗體的滴度越高，其中的干擾物質(zhì)的影響就越小。滴度的測(cè)定：以一定濃度的*Ag與稀釋度不同的抗體進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)*Ag的結(jié)合率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的抗體的稀釋度即為該抗體的滴度。這時(shí)的抗體濃度就是實(shí)際使用時(shí)的濃度。

第十六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日16（二）分離技術(shù)1、聚乙二醇（PEG）沉淀法2、雙抗體沉淀法3、雙抗體+PEG法4、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法5、活性炭吸附法：葡聚糖包被的活性炭6、微孔濾膜過濾法：玻璃或醋酸纖維濾膜7、磁化分離技術(shù)：氧化鐵-活性炭（-抗體）8、固相分離技術(shù)：

1）第一抗體與試管聯(lián)接

2）第二抗體與試管聯(lián)接第十七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日17（三）數(shù)據(jù)處理1、logit-log模型2、四參數(shù)logistic模型：3、四參數(shù)質(zhì)量作用定律模型U={（A-D）/[1+（X/C）B]}+D其中U為各試驗(yàn)管結(jié)合率（含NSB）A、B、C、D分別為0劑量時(shí)的結(jié)合率，logit-log函數(shù)的斜率，各點(diǎn)實(shí)際結(jié)合率下降一半時(shí)X的量，NSB。第十八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日18三、質(zhì)量控制

QualityControl,QC（一）定義：質(zhì)量控制就是控制誤差，即對(duì)分析工作中的誤差進(jìn)行經(jīng)常性的檢查，遇有質(zhì)量異常則及時(shí)采取對(duì)策，以保證分析誤差控制在可接受的范圍內(nèi)。放射免疫分析是一類高靈敏度的超微量分析技術(shù)，極易受各種因素的影響而使檢測(cè)結(jié)果失真，因此必須有嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系。第十九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日19（二）誤差的來源1、系統(tǒng)誤差：這種誤差表現(xiàn)為檢測(cè)結(jié)果呈傾向性的偏高或偏低，常有一些可以確定的因素導(dǎo)致，如：量器不準(zhǔn)、試劑不純、標(biāo)準(zhǔn)品的定量不準(zhǔn)、儀器狀態(tài)不佳、分離效果不好、不適當(dāng)?shù)那€擬合模型等等，系統(tǒng)誤差是通過努力可以消除的。2、隨機(jī)誤差：這種誤差多由難以確定且無法控制的原因引起，誤差的出現(xiàn)是隨機(jī)的，由各種偶然因素造成，符合正態(tài)分布，如量取液體或分離時(shí)的誤差。第二十頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日20（三）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制側(cè)重對(duì)檢測(cè)質(zhì)量的控制，它保證從收集樣本開始到發(fā)出報(bào)告為止的全過程中，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)過程中出現(xiàn)的各種誤差，分析產(chǎn)生的原因，找出糾正的辦法，以確保檢測(cè)的質(zhì)量。常用以下指標(biāo)對(duì)檢測(cè)結(jié)果做可靠性評(píng)價(jià)：精密度、準(zhǔn)確度、特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、有效性第二十一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日211、精密度（precision）是指在相同條件下對(duì)某一樣品多次檢測(cè)所得結(jié)果的符合程度，即復(fù)管的重復(fù)性，它是最重要的質(zhì)量參數(shù)。常用精密度圖來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的精密度水平。2、準(zhǔn)確度（accuracy）是指測(cè)定值與真值的接近程度，用回收率來評(píng)價(jià)，回收率是反應(yīng)測(cè)定值偏差的質(zhì)控指標(biāo)。3、靈敏度（sensitivity）是指檢測(cè)能與零劑量區(qū)分的最小檢測(cè)量。累計(jì)10次測(cè)定結(jié)果，計(jì)算出零標(biāo)準(zhǔn)管的結(jié)合率為X—2SD時(shí)對(duì)應(yīng)的劑量值，即為靈敏度。第二十二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日224、特異性（specificity）是指該反應(yīng)體系不受干擾物質(zhì)物質(zhì)影響的程度。常用的指標(biāo)是交叉反應(yīng)率。5、穩(wěn)定性（stability）是指測(cè)定試劑在合理保存和正確使用條件下，在規(guī)定的有效期內(nèi)，保持其全部原有性能不變的能力。常用指標(biāo)有：零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率（B0%≥20%）、非特異性結(jié)合率（NSB%≤5%）、標(biāo)準(zhǔn)曲線上的質(zhì)控指標(biāo)等。6、有效性（effectivity）主要指臨床診斷符合率及臨床使用評(píng)價(jià)，檢測(cè)結(jié)果在正常和異常之間有良好的區(qū)分，得出可信的結(jié)論。第二十三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日23第二節(jié)免疫放射分析

immunoradiometricassay,IRMA免疫放射分析技術(shù)是1968年由Miles和Hales創(chuàng)立的，IRMA是非競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析技術(shù)的代表。第二十四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日24一、基本原理用放射性核素標(biāo)記抗體作示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的標(biāo)記抗體，抗原與標(biāo)記抗體進(jìn)行全量反應(yīng)，多余的抗體用一定的手段除去，測(cè)定復(fù)合物的放射性，其活度與待測(cè)抗原量正相關(guān)。第二十五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日25RIA和IRMA低劑量區(qū)的不確定因素示意圖第二十六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日26IRMA的標(biāo)準(zhǔn)曲線第二十七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日27IRMA的特點(diǎn)1、屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)；2、抗原抗體復(fù)合物的與抗原的量正相關(guān)3、在低劑量區(qū)不會(huì)有不確定因素4、IRMA的非特異性結(jié)合對(duì)低劑量區(qū)的影響大第二十八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日28二、基本方法1、雙抗體夾心法2、標(biāo)記第三抗體法3、生物素-親和素系統(tǒng)的應(yīng)用第二十九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日29第三十頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日30第三十一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日31RIA和IRMA的區(qū)別項(xiàng)目RIAIRMA反應(yīng)機(jī)制競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)反應(yīng)試劑抗原、標(biāo)記抗原、抗體抗原、過量的標(biāo)記抗體分離方法只需一個(gè)抗原決定族需兩個(gè)或兩個(gè)以上抗原決定族復(fù)合物的放射性與待測(cè)抗原量呈負(fù)相關(guān)與待測(cè)抗原量呈正相關(guān)NSB的影響主要影響高劑量區(qū)主要影響低劑量區(qū)第三十二頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日32體外分析常用檢查項(xiàng)目項(xiàng)目方法及正常值臨床意義T3放免1.0-3.2nmol/l判斷甲狀腺功能及腎病\肝病\糖尿病\腫瘤心肌梗死等引起的低T3T4綜合征T4放免70-180nmol/l同上FT3放免3.2-9.2pmol/l同上，判斷甲亢復(fù)發(fā)及妊娠時(shí)甲狀腺功能FT4放免8.2-26pmol/l

同上甲狀腺球放免〈30%甲狀腺自身免疫疾病特異指蛋白抗體標(biāo)，橋本氏甲狀腺炎第三十三頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日33甲狀腺微放免〈20%甲狀腺自身免疫疾病特異指粒體抗體標(biāo)，橋本氏甲狀腺炎TSH免放0.4-3.1μIU/ml鑒別原發(fā)與繼發(fā)甲低,評(píng)價(jià)下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能,垂體瘤,庫(kù)欣綜合征甲狀腺放免4-14.5μg/ml診斷甲癌\慢性淋巴細(xì)胞性球蛋白甲狀腺炎/甲亢,尤其監(jiān)測(cè)甲癌復(fù)發(fā)

診斷甲狀腺疾病,對(duì)非甲狀腺疾病嚴(yán)重程度的判斷\預(yù)后\療效觀察均有重要意義,甲減替代治療觀察TSH受體放射受體<9U/l甲亢\甲亢預(yù)后,甲亢ATD停抗體藥指標(biāo).判斷甲亢有無復(fù)發(fā).第三十四頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日34促甲狀腺素放免法43±25pg/ml鑒別原發(fā)和繼發(fā)性釋放激素甲低甲狀旁腺素放免<70.5pmol/l甲狀旁腺病,判斷骨代謝.慢性腎衰\甲旁亢\甲旁腺瘤時(shí)增高,甲旁減\高鈣尿癥時(shí)減低腫瘤標(biāo)志物鐵蛋白放免,男25~264μg/l缺鐵性貧血,輔助診斷再障\急女25~264μg/l慢性白血病\惡性淋巴瘤\多發(fā)性骨髓瘤。原發(fā)性肝癌部分升高，腫瘤骨髓、肝、脾轉(zhuǎn)移時(shí)顯著增加前列腺特放免，<2.6μg/l前列腺癌\前列腺肥大\前列腺炎診異抗原斷及療效觀察.前列腺癌時(shí)顯著升高,肥大時(shí)輕度升高.第三十五頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日35CEA放免，<20μg/l結(jié)腸\直腸\胃\肺\乳腺惡性腫瘤時(shí)動(dòng)態(tài)升高,對(duì)腫瘤診斷\復(fù)發(fā)\預(yù)后判斷\療效觀察有意義.AFP放免，<25μg/l診斷原發(fā)性肝癌.急慢性活動(dòng)性肝炎\胎兒畸形也可升高.可作肝癌手術(shù)和化療后預(yù)后觀察.NSE放免，<15μg/l小細(xì)胞未分化肺癌\腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤\神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤\腦損傷降鈣素放免，<29.3pmol/l甲狀腺隋樣瘤,早期診斷小細(xì)胞肺癌,甲亢時(shí)異常升高,判斷腎功能\鈣磷代謝.前列腺酸性放免，<4μg/l前列腺癌時(shí)明顯升高,肥大時(shí)輕度升高,磷酸酯酶可作前列腺癌療效監(jiān)測(cè).血β2微球放免，<2300μg/l多發(fā)性骨髓瘤\肝胃結(jié)腸癌\白血病時(shí)蛋白顯著升高.慢性腎炎和腎衰時(shí)血濃度升高.第三十六頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日36糖類抗原放免<20mg/l腫瘤診斷\預(yù)后,放化療及手術(shù)后的療CA-50效觀察CA-199放免<37U/ml胰腺癌\膽管癌陽(yáng)性檢出率高,結(jié)腸癌\胃癌\肝癌等輔助診斷和療效隨訪.CA-242放免<25U/ml胰腺癌\肝癌診斷,高特異CA-125放免<35U/ml婦科腫瘤的診斷與鑒別診斷有重要價(jià)值CA-153放免<30U/ml乳癌診斷特異,乳癌肝及骨轉(zhuǎn)移\卵巢癌\子宮內(nèi)膜癌一定程度增高腎上腺及腎臟

尿免疫球蛋白放免<8mg/l早期診斷腎臟受損\受損部位及程度判斷尿白蛋白放免<10mg/l同上尿β2微球蛋白放免<230mg/l同上第三十七頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日37血漿皮質(zhì)醇RIA判斷腎上腺皮質(zhì)\垂體功能.Cushing上午8時(shí):50~280μg/l綜合征,腎上腺腫瘤、腫瘤、應(yīng)激午夜:20~80μg/l妊娠、服用避孕藥等增高，腎上腺胰島激素皮質(zhì)功能減退時(shí)減低胰島素放免4~16.8mU/l升高時(shí)有利于糖尿病分型診斷C肽放免0.8~4.0μg/l糖尿病分型\治療\判斷預(yù)后胰高血糖素放免11~37pmol/l糖尿病\急性低血糖時(shí)升高,胰高血糖素瘤時(shí)顯著升高.胰島素抗體放免陽(yáng)性:>5%IDDM早期診斷,胰島素治療糖尿病的療效判斷,評(píng)價(jià)胰島素產(chǎn)品質(zhì)量.骨鈣素放免1.8~8.4μg/l判斷骨代謝\骨質(zhì)疏松情況,了解甲狀腺\甲狀旁腺功能第三十八頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日38肝臟急性黃疸型肝炎\慢性活動(dòng)性肝炎\肝硬化膽酸放免<300μg/dl肝癌\膽汁淤積時(shí)明顯升高,慢性遷延性肝炎及膽囊炎輕度升高。妊娠膽淤明顯升高。透明質(zhì)酸放免<120μg/l肝硬化\肝纖維化\慢性肝炎時(shí)升高,肝硬化惡變時(shí)顯著升高,可鑒別慢性活動(dòng)性與遷延性肝炎層粘連蛋白放免<120μg/l同上III型膠原放免<120μg/l同上IV型膠原放免35~65μg/l同上,肝纖維化早期診斷指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶酶法:5~40U/l肝細(xì)胞損害靈敏指標(biāo),常見于急性病毒性肝炎\慢性活動(dòng)性肝炎及其他原因所致肝損害.門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶酶法:8~40U/l同上Γ谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶酶法:男11~50U/l診斷肝膽疾病,原發(fā)性肝癌\女7~23U/l胰腺癌時(shí)增高.第三十九頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日39性激素RIA男:4~87ng/l不孕癥及胎盤功能判斷雌二醇女:24~315ng/lLHRIA男:5~30IU/L性腺功能狀態(tài),睪丸精原細(xì)胞癌\原女:卵泡期2~30IU/L發(fā)性閉經(jīng),性早熟等排卵期40~200IU/L黃體期0~20IU/L絕經(jīng)期35~210IU/L孕酮RIA男0.35±0.19μg/L妊娠時(shí)增高,葡萄胎比正常妊娠時(shí)女:卵泡期0.75±0.38μg/L高,先兆流產(chǎn)\絨毛膜上皮細(xì)胞癌\排卵期2.05±1.11μg/L嚴(yán)重妊毒癥等降低黃體期11.6±6.7μg/L絕經(jīng)期0.31±0.22μg/L第四十頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日40睪酮RIA男:260~1250ng/dl性腺功能判斷.睪丸良性間質(zhì)細(xì)胞瘤女:2~54ng/dl女性男性化腫瘤升高;隱睪炎,垂體\性腺功能減退.hCGβRIA<3.1μg/L早孕,絨毛膜上皮細(xì)胞癌,葡萄胎及療亞單位效觀察,宮外孕,睪丸腫瘤,先兆流產(chǎn)的動(dòng)態(tài)觀察.垂體催RIA男:6.2~13μg/L下丘腦\,垂體病變,內(nèi)分泌疾病,惡性乳素女:9~14μg/L腫瘤,腎功能衰竭,生理月經(jīng)期或泌乳期ACTHRIA原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)功能減退\先天性腎上腺皮質(zhì)8AM:2.3~17.9pmol/l增生,異源性分泌\庫(kù)欣病升高;繼發(fā)性4PM:1.7~16.6pmol/l皮質(zhì)功能減退,皮質(zhì)腫瘤,醫(yī)源性降低

第四十一頁(yè)，共四十三頁(yè)，2022年，8月28日41生長(zhǎng)激素RIA<3.0μg/L巨人癥\肢端肥大癥\低血糖時(shí)升高;侏儒癥\垂體前葉功能減退癥\某些激素藥物影響減低FSHRIA男:5~30IU/L女:卵泡期3~30IU/L性功能狀態(tài),睪丸精原細(xì)胞癌,原發(fā)性排卵期12~30IU/L閉經(jīng),性早熟等黃體期5~15IU/L絕經(jīng)期323~333IU/L抗利尿RIA1~5μg/L腎性尿崩\急性腦出血\肝病\慢性腎激素