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微生物學檢測國家城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)鄭州監(jiān)測站二○一三年一月八日常規(guī)日檢指標檢測方法要點微生物學檢測基礎及要點313332目錄微生物學指標檢測方法要點1、采樣容器一、微生物學檢測基礎及要點（一）樣品的采集采集使用過消毒劑水樣的采樣容器應在清洗晾干后加入硫代硫酸鈉等試劑；采樣容器的瓶蓋應使用牛皮紙/錫紙等進行包裹，并用繩子固定；采樣容器應經(jīng)過160℃的干熱滅菌處理；采樣容器在采樣前不可蕩洗。2、采樣過程從龍頭采集樣品時，應放水至少2分鐘后再取樣，保證樣品具有代表性；采集微生物指標樣品前應對龍頭進行消毒；采樣過程中應避免對瓶口及瓶塞造成污染；采集的微生物樣品應在4小時內(nèi)進行檢測。一、微生物學檢測基礎及要點（二）樣品的檢測1、檢測環(huán)境2、相關設備無菌室、緩沖間、操作間；紫外線消毒30分鐘，消毒后再過20分鐘才能進入；緩沖間配備有專用的衣帽鞋。干燥箱；培養(yǎng)箱；高壓滅菌器；冰箱；紫外燈；微生物檢測過濾器；顯微鏡等。一、微生物學檢測基礎及要點（二）樣品的檢測3、試劑配制4、檢測過程按照標準檢測方法自行配置；購買成品的培養(yǎng)基，按照說明書進行配置；所有試劑均應采用適當?shù)姆绞竭M行消毒處理；試劑配置過程中不得隨意離開。檢測前應做好個人衛(wèi)生的處理，尤其是應用肥皂進行手部清洗；檢測程序要嚴格按照作業(yè)指導書進行操作；檢測中所有接觸樣品的器具使用前均應進行滅菌處理。一、微生物學檢測基礎及要點（二）樣品的檢測5、檢測輔助記錄6、質(zhì)控措施采樣容器、平皿、吸管、培養(yǎng)基等的消毒記錄；無菌室的環(huán)境監(jiān)控記錄；廢棄物的處理記錄；培養(yǎng)箱、冰箱、紫外燈等的監(jiān)控記錄。每批樣品至少做一個環(huán)境、培養(yǎng)基空白樣品；每批樣品平行樣不得少于10%，至少兩個；定期進行環(huán)境空白、試劑空白的檢測；采樣菌種、微生物質(zhì)控試劑進行質(zhì)控檢測。常規(guī)日檢指標檢測方法要點微生物學檢測基礎及要點313332目錄微生物學指標檢測方法要點大腸埃希氏菌檢測總大腸菌群檢測31菌落總數(shù)檢測333234耐熱大腸菌群檢測二、微生物學指標檢測方法要點“兩蟲”檢測35總大腸菌群檢測31二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測311、總大腸菌群概念

總大腸菌群系一群在37℃培養(yǎng)24h至48h能夠發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。總大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛(wèi)生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。一般認為該菌群細菌可包括埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和檸檬酸桿菌屬等。2、總大腸菌群的來源

總大腸菌群分布較廣，調(diào)查研究表明，主要來自人和溫血動物糞便，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因；同時，總大腸菌群還可能來自植物和土壤，在營養(yǎng)豐富的水體中檢出，即在非糞便污染的情況下，也有檢出的可能性。二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測314、總大腸菌群的限值

GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》中規(guī)定，任意100mL水樣中不得檢出總大腸菌群.3、總大腸菌群的檢測意義

大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示飲用水中是有否糞便污染。當飲用水受到糞便等污染時，一般除了會有正常菌群外，還可以推測出飲用水中存在著腸道致病菌（如沙門氏菌、志賀氏菌等）污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅。而從水中直接檢驗腸道致病菌不僅方法復雜，需時間長且也不一定能分離出來。所以在實際工作中，常采用機體腸道內(nèi)的某些正常菌群，作為水被糞便污染的標志，進而標志飲用水中被腸道致病菌污染的可能性（存在風險）。一般地說，總大腸菌群能夠指示腸道傳染病菌存在的可能性，但它不是專一的指示菌。二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31

總大腸菌群的測定，GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》中規(guī)定有三種方法：發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法。一般來說，發(fā)酵法適用于飲用水、水源水尤其是濁度較高的水樣，濾膜法適用于飲用水及濁度低的水源水水樣。（一）多管發(fā)酵法（檢驗程序）乳糖初發(fā)酵實驗復發(fā)酵實驗分離培養(yǎng)結(jié)果報告具體操作詳見GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》。操作過程中注意以下要點：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。

將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測312、革蘭氏染色實驗

由于微生物細胞含有大量水分，機體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差,必須進行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構。革蘭氏染色法不僅能觀察到細菌的形態(tài)，而且還可將所有細菌區(qū)分為兩大類：染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，染色反應呈紅色的稱為革蘭氏陰性細菌。（1）染色原理（2）革蘭氏染色步驟

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復染→水洗→干燥→觀察

檢測已處理的出廠水或清潔水時可以直接接種5管10mL水樣雙料培養(yǎng)基；檢測水源水或污染較嚴重水樣時，應加大稀釋度，每個稀釋度接種5管，每個水樣共接種15管。1、初發(fā)酵實驗二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31A.涂片

取干凈的載玻片于實驗臺上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量培養(yǎng)物與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。

手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進行染色。

在涂片薄膜上滴加染色液（草酸銨結(jié)晶紫）一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。后水洗。B.干燥

涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。C.固定D.染色二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31E.媒染

加革蘭氏碘液媒染1min后，水洗。

用復染劑（沙黃復染液）復染1min，水洗。

用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥后鏡檢。用吸水紙時切勿將菌體擦掉。F.脫色

斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時20~30s，隨即水洗。G.復染H.干燥二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31大腸桿菌（Escherichiacoli）革蘭氏染色圖革蘭氏染色陰性桿菌（紅色）

二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31（3）革蘭氏染色實驗注意事項a．革蘭氏染色成敗的關鍵是脫色時間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認為革蘭氏陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被誤認為是革蘭氏陽性菌。因此必須嚴格把握脫色時間。

b．選用培養(yǎng)18-24小時菌齡的細菌為宜，若細菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應。

c.干凈的玻片、熱固定、每一步水洗要徹底并且吸干等也是實驗成功的關鍵。二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測313、復發(fā)酵實驗4、結(jié)果報告

根據(jù)復發(fā)酵陽性結(jié)果證實有總大腸菌群存在的管數(shù)，查MPN檢數(shù)表，即可得到總大腸菌群最可能數(shù)（MPN/100mL）。

將經(jīng)過涂片、鏡檢證明是革蘭氏陰性無芽孢桿菌的菌落剩余部分，再接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每管可接種分離自同一初發(fā)酵管的最典型菌落1～3個，置37℃培養(yǎng)24小時，如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實有總大腸菌群的存在。二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31（二）濾膜法（操作程序）濾膜濾器滅菌

濾膜法，又稱微孔濾膜過濾法，是用濾膜將一定體積水中的總大腸菌群截留于膜片上，然后移于鑒別培養(yǎng)基上，養(yǎng)分通過膜片的毛細管供應，經(jīng)37℃培養(yǎng)后膜片上可出現(xiàn)總大腸菌群的典型菌落，便于直接記數(shù)。本方法與發(fā)酵法相比優(yōu)點是可以縮短陽性報告時間（48小時），具有高度重現(xiàn)性、使用器材少，適用于大量樣品（出廠水和管網(wǎng)水）的檢測。過濾水樣濾膜培養(yǎng)菌落鑒別發(fā)酵證實結(jié)果報告具體操作詳見GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》。操作過程中注意以下要點：二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測311、培養(yǎng)基與試劑

采用濾膜法測定生活飲用水及水源水中的總大腸菌群時，如果每天水樣較少時，試劑可以選用市售的成品品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基。制備培養(yǎng)基時，應嚴格按照廠商提供的使用說明配制，如質(zhì)量（體積）、pH、制備條件、滅菌條件、操作步驟等，最后制成平皿放入冰箱保存。此種已制成的培養(yǎng)基保存不宜超過兩周，如培養(yǎng)基已由淡粉色變成深紅色，則不能再用；如果每天水樣較多，可以先制成儲備培養(yǎng)基，高壓滅菌后儲存于冰箱內(nèi)，檢測水樣時，再將儲備培養(yǎng)基加熱溶化，加入一定量的已滅菌的堿性品紅和亞硫酸鈉，制成平皿培養(yǎng)基使用。

目前我們使用的濾膜系一種硝化纖維制成的膠質(zhì)膜，用4%硝化纖維乙醇丙酮溶液，在溶劑蒸發(fā)后所形成的微孔膠膜，厚0.1mm，孔徑0.45μm。使用前，將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需要更換水洗滌2～3次，以除去殘留溶劑。濾器使用前滅菌，用點燃的酒精棉球火焰滅菌，也可用蒸汽滅菌器高壓滅菌20分鐘。2、濾膜與濾器的滅菌二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測313、濾膜培養(yǎng)

將一定量的水樣通過裝有濾膜并已滅菌的濾器，以負壓抽慮干后將濾膜移于鑒別培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃，培養(yǎng)24h。需要注意的是，水樣量的控制，是以濾膜上的菌落數(shù)不超過100個為宜。因此檢測出廠水或清潔水的時，可以直接過濾100mL水樣，如果是檢測水源水、污染較嚴重水樣或未知水樣（如沒有余氯）時，應加大稀釋度，過濾不同稀釋度的水樣。

挑取濾膜上生長的具有一定特征的典型和可疑菌落作革蘭氏染色實驗4、菌落鑒別5、發(fā)酵證實

凡革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)24小時，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則判定為總大腸菌群陽性。6、結(jié)果報告

計算濾膜上生長的總大腸菌群數(shù)，以每100mL水樣中的總大腸菌群數(shù)

（CFU/100mL）二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31（三）酶底物法方法介紹1、方法原理

該方法是指在選擇性培養(yǎng)基上能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）的細菌群組，該細菌群組能分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，同時能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使菌落能夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此技術來檢測水中總大腸菌群和大腸埃希氏菌的方法。2、所需主要培養(yǎng)基及設備培養(yǎng)基：本方法采用MinimalMediumONPG-MUG（MMO-MUG)培養(yǎng)基，可選用市售商品化制品。儀器設備：定量盤（定量培養(yǎng)用無菌塑料盤，含51孔或97孔）、程控定量封口機（用于51孔或97孔法定量盤的封口。二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測313、定性分析a.將一個包裝試劑倒入裝有100mL水樣的無菌取樣瓶中。

b.蓋上蓋子搖勻。

c.在36±1℃培養(yǎng)24小時。

d.根據(jù)下表的說明判斷定性檢測結(jié)果。比陽性比色對照品的黃色淺總大腸菌群、大腸埃希氏菌為陰性與陽性比色對照品的黃色相近或更深總大腸菌群為陽性與陽性比色對照品的黃色相近或更深且在紫外燈下顯熒光總大腸菌群、大腸埃希氏菌為陰性二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測313、定量分析a.將一個包裝試劑倒入裝有100mL水樣的無菌取樣瓶中。

b.蓋上蓋子搖勻。

c.將水樣全部倒入51孔或97孔定量盤中，使用專用的程控定量封口機。

d.在36±1℃培養(yǎng)24小時。

e.根據(jù)定性結(jié)果，數(shù)出陽性格子數(shù)后對照MPN表得到定量檢測結(jié)果二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31定量檢測（51孔定量盤）－5步法加入試劑（MMO-MUG)后,搖晃至溶解將溶液倒入51孔定量盤中二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31定量檢測（51孔定量盤）－5步法將定量盤放入程控定量封口機中在36±1℃培養(yǎng)24小時，然后計算呈陽性反應的格子，對照MPN表計數(shù)二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31酶底物法檢測總結(jié)檢測指標培養(yǎng)時間培養(yǎng)溫度（℃）定性檢測定量檢測（100mL)總大腸菌群和大腸埃希氏菌（同時）24小時36±1℃黃色：總大腸菌群陽性黃色+熒光：大腸埃希氏菌陽性51孔：1-200MPN97孔：1-2419MPN二、微生物學指標檢測方法要點總大腸菌群檢測31（四）各檢測方法的優(yōu)缺點比較

在總大腸菌群檢測方法中發(fā)酵法和濾膜法是傳統(tǒng)的檢測方法，操作步驟繁雜、干擾因素多，專一性差，要確認實驗，因此檢測周期較長，需48～72h，不適于大量樣品的分析。但傳統(tǒng)方法具有原理簡單用較低、利于推廣的優(yōu)點，因此仍是常規(guī)監(jiān)測中的主要檢測方法。各檢測方法的優(yōu)缺點比較見下表。檢測方法技術難易步驟確認實驗檢測時間準確度檢測費用發(fā)酵法易繁瑣需要48～72h較準確較便宜濾膜法易繁瑣需要48～72h較準確較便宜酶底物法難簡易不需要18～24h精確昂貴

酶底物法可以較好地彌補傳統(tǒng)方法的不足，該法操作簡便，檢測時間18～24h或更短，結(jié)果可靠，需確認試驗，且可以同時檢測水中大腸菌群和大腸埃希氏菌的污染狀況，能夠較精確地判斷水樣的微生污染狀況。并且此種方法已經(jīng)被世界各國國家及地方實驗室和世界各組織機構認可。二、微生物學指標檢測方法要點耐熱大腸菌群檢測32二、微生物學指標檢測方法要點1、耐熱大腸菌群的概念

耐熱大腸菌群是指在44.5℃溫度下仍能生長的大腸菌群,屬于總大腸菌群的一部分,而且與大腸菌群有相同的生物特性,即都能使乳糖發(fā)酵、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。2、耐熱大腸菌群的來源

耐熱大腸菌群一般有以下4個菌屬細菌組成：埃希氏菌屬、產(chǎn)氣桿菌屬、枸櫞酸菌屬和副大腸菌屬。耐熱大腸菌群中的主要優(yōu)勢菌為埃希大腸桿菌，它只來源于糞便中的細菌。因此，通過對耐熱大腸菌的檢驗就可以直接了解水體是否受到糞便的污染。耐熱大腸菌群檢測32二、微生物學指標檢測方法要點3、耐熱大腸菌群的檢測意義4、耐熱大腸菌群的限值

GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》中規(guī)定，任意100mL水樣中不得檢出耐熱大腸菌群。

總大腸菌群作為飲用水衛(wèi)生細菌學的指標之一,是因為大腸菌群在糞便中大量存在,并且濃度低到1個/100mL

尚可檢出,是糞便污染的敏感指標。然而,大腸菌群除了含有來源于糞便的細菌外,還可能含有來源于非糞便的細菌,如來源于土壤或生活污水的細菌。所以,大腸菌群的存在并不是存在糞便污染的排它性標志。也就是說,水體中有總大腸菌群只能表明水體受到了污染,但不能肯定引起污染的渠道來源于哪里。而如果檢測出耐熱大腸菌群，則可以揭示了水源是直接受到了糞便污染，從而標志被腸道致病菌污染的可能性較大。耐熱大腸菌群檢測32二、微生物學指標檢測方法要點耐熱大腸菌群檢測32（一）多管發(fā)酵法

原理：利用大腸菌群繁殖時使乳糖發(fā)酵并能使乳糖蛋白胨培養(yǎng)液變黃同時產(chǎn)生氣泡的原理。乳糖初發(fā)酵實驗復發(fā)酵實驗樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。

挑選初發(fā)酵陽性結(jié)果的發(fā)酵管（即產(chǎn)酸又產(chǎn)氣），輕微振蕩初發(fā)酵陽性結(jié)果的發(fā)酵管，用3mm接種環(huán)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液中。44.5℃下培養(yǎng)24小時平板分離將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍瓊脂平板上，44.5℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。結(jié)果報告凡平板上有典型菌落者，則證實為耐熱大腸菌群為陽性查MPN表，報告結(jié)果。二、微生物學指標檢測方法要點耐熱大腸菌群檢測32（二）濾膜法

原理：將水樣注入已滅菌的放有微孔濾膜的濾器中（水樣量以濾膜上長菌落20～60個為宜）

，經(jīng)過抽濾。細菌即被截留在濾膜上，然后將濾膜貼于合適的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，44.5℃培養(yǎng)24h能形成特征性菌落以此來檢測水中耐熱大腸菌群的方法濾膜濾器滅菌過濾水樣濾膜培養(yǎng)菌落鑒別發(fā)酵證實結(jié)果報告

本方法與發(fā)酵法相比優(yōu)點是可以縮短陽性報告時間（24小時），具有高度重現(xiàn)性、使用器材少，適用于大量樣品（出廠水和管網(wǎng)水）的檢測。二、微生物學指標檢測方法要點耐熱大腸菌群檢測32（三）檢測中注意的事項

通過對這項工作的開展和多次實驗,我們認為在檢驗過程中應注意以下幾點：1、進行耐熱大腸菌群的檢驗方法有兩種,一種是多管發(fā)酵法,另一種是濾膜法。根據(jù)水體受污染的情況,可采取不同的方法。這與總大腸菌群的檢驗方法范圍是一樣的。一般情況下,根據(jù)我們的水質(zhì)情況，我們采取了濾膜法。這個方法簡單易行,而且結(jié)果只需要24h即可得出,同時比較準確。但是，如果水樣污染嚴重或者是水源水時，建議采取多管發(fā)酵法，如果采取濾膜法，要做好梯度稀釋，以濾膜上長菌落20～60個為宜。2、濾膜法中所需要的MFC固體培養(yǎng)基可以用市售的成品培養(yǎng)基配制。配制好的培養(yǎng)基不要進行高壓滅菌,因玫紅酸若經(jīng)蒸壓滅菌會分解。配制好的MFC平板培養(yǎng)基應放在2℃～10℃的暗處保存，不應超過96h,最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如果培養(yǎng)基的顏色由暗紅色變成混濁的棕色就要棄去不用。3、為了保證培養(yǎng)箱內(nèi)有一定的濕度可以把箱體內(nèi)部底層放一個塘瓷盤,里邊放一塊濕紗布。這是防止溫度高菌體干燥脫水,失去原菌體內(nèi)的水分,影響其生長而采取的措施,若有條件可以用隔水式恒溫培養(yǎng)箱或是恒溫恒濕培養(yǎng)箱。二、微生物學指標檢測方法要點大腸埃希氏菌檢測33二、微生物學指標檢測方法要點1、大腸埃希氏菌概念

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)通常稱為大腸桿菌，屬于埃希菌屬。在此菌屬中與人類生活密切相關的僅有一個種，即大腸埃希氏菌，1885年由Escherich發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動物腸道中的正常棲居菌。大腸埃希氏菌檢測33二、微生物學指標檢測方法要點2、大腸埃希氏菌的來源

大腸埃希氏菌主要附生在人或動物的腸道里，為正常菌群，少數(shù)的大腸桿菌具有毒性，可引起疾病。大腸埃希氏菌又稱大腸桿菌或普通大腸桿菌，它是人和混血動物腸道中的正常寄生細菌。

作為糞便污染的最佳指示菌，大腸埃希氏菌檢出的意義最大，其次是糞大腸菌群，總大腸菌群的檢測意義略差一些。因此，大腸埃希氏菌是糞便污染最有意義的指示菌，已被世界上許多組織、國家和地區(qū)使用。新國標中加入大腸埃希氏菌指標，限值為100mL不得檢出大腸埃希氏菌。并注明：若檢出總大腸菌群，必須進行耐熱大腸菌群或大腸埃希氏菌檢測。若水樣中檢出耐熱大腸菌群或大腸埃希氏菌，則說明水質(zhì)可能受到嚴重污染，必須采取相應措施。

3、大腸埃希氏菌的檢測意義大腸埃希氏菌檢測33二、微生物學指標檢測方法要點（一）多管發(fā)酵法大腸埃希氏菌檢測33

大腸埃希氏菌的測定，GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》中規(guī)定有三種方法：發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法。一般來說，發(fā)酵法適用于飲用水、水源水尤其是濁度較高的水樣，濾膜法適用于飲用水及濁度低的水源水水樣。接種培養(yǎng)結(jié)果觀察報告將總大腸菌群多管發(fā)酵法初發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)氣的管進行大腸埃希氏菌檢測。用燒灼滅菌的金屬接種環(huán)或無菌棉簽將上述試管中的液體接種到EC-MUG管中。將已接種的EC-MUG管在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24±2h將培養(yǎng)后的EC-MUG管在暗處用波長為366nm功率為6W的紫外燈照射，如果有藍色熒光產(chǎn)生則表示水樣中含有大腸埃希氏菌，據(jù)算陽性管數(shù)，查MPN表計數(shù)。二、微生物學指標檢測方法要點（二）濾膜法大腸埃希氏菌檢測33接種培養(yǎng)結(jié)果觀察報告將總大腸菌群濾膜法有典型菌落生長的濾膜進行大腸埃希氏菌檢測。在無菌操作條件下將濾膜轉(zhuǎn)移到NA-MUG平板上，細菌截流面朝上，進行培養(yǎng)。將已接種的NA-MUG平板在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中36℃±1℃培養(yǎng)4h.將培養(yǎng)后的NA-MUG平板在暗處用波長為366nm功率為6W的紫外燈照射，如果菌落邊緣或菌落背面有藍色熒光產(chǎn)生則表示水樣中含有大腸埃希氏菌。記錄有藍色熒光產(chǎn)生的菌落數(shù)并報告，格式同總大腸菌群濾膜法格式。（三）酶底物法（略）具體參見總大腸菌群酶底物法二、微生物學指標檢測方法要點大腸埃希氏菌檢測33（三）檢測中注意的事項

通過對這項工作的開展和多次實驗,我們認為在檢驗過程中應注意以下幾點：1、開展這項檢驗工作條件不很復雜,如果采用傳統(tǒng)方法（發(fā)酵法和濾膜法），我們利用現(xiàn)有的實驗室條件，不添置新的儀器設備。如果采用酶底物法，則需要添加定量盤和程控定量封口機等儀器設備。2、采用發(fā)酵法和濾膜法的培養(yǎng)過程有所區(qū)別。采用發(fā)酵法時，培養(yǎng)溫度為44.5℃±0.5℃，培養(yǎng)時間24±2h；采用濾膜法時，培養(yǎng)溫度為36℃±1℃，培養(yǎng)時間為4h。3、發(fā)酵法所需要的EC-MUG培養(yǎng)基（含有乳糖成分）,配制時應在366nm紫外燈光下自檢無熒光后，在115℃高壓滅菌20min后備用；濾膜法所需的NA-MUG（不含乳糖成分）培養(yǎng)基，在121℃高壓滅菌15min后，傾注平板后備用。兩種方法所需培養(yǎng)基滅菌溫度時間有所不同。二、微生物學指標檢測方法要點菌落總數(shù)檢測34二、微生物學指標檢測方法要點菌落總數(shù)檢測341、菌落總數(shù)概念

水樣在營養(yǎng)瓊脂上有氧條件下37℃培養(yǎng)48h后，所得1mL水樣所含菌落的總數(shù)。2、菌落總數(shù)檢測意義

菌落總數(shù)按上述定義僅能表示能適應特定的培養(yǎng)條件而生長的菌落總的數(shù)量，而不是水中所有全部的細菌數(shù)，因為這種特定的培養(yǎng)條件并不能符合所有細菌生長繁殖的要求。本指標由于有特定的培養(yǎng)條件，因此菌落總數(shù)在評價水是否被污染時帶有局限性，但是還具有相對的意義，在評價水處理的效果方面有一定的作用。二、微生物學指標檢測方法要點（一）水樣采集和送檢1、采樣瓶洗凈、包扎、滅菌2、無菌采樣灼燒水龍頭后，放水5-10min3、中和余氯每500ml水樣，預加1.5%Na2S2O32mL4、送檢時間

<=2h(常溫)，<=4h(冷藏)5、器材與試劑水樣，無菌蒸餾水，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，1ml吸管，10ml吸管，平皿菌落總數(shù)檢測34二、微生物學指標檢測方法要點菌落總數(shù)檢測34（二）檢測步驟1、稀釋水樣：10ml水樣加入90ml無菌蒸餾水、振蕩、徹底混勻2、做1：10系列稀釋三支9ml無菌蒸餾水試管3、傾注培養(yǎng)：1ml稀釋水樣、15ml培養(yǎng)基（45℃）4、倒置培養(yǎng)：37℃，24h傾注培養(yǎng)培養(yǎng)結(jié)果二、微生物學指標檢測方法要點菌落總數(shù)檢測34二、微生物學指標檢測方法要點菌落總數(shù)檢測34（二）培養(yǎng)及計數(shù)1、培養(yǎng)條件：倒置于37±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h。2、計數(shù)時間：到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應將平板放置于0-4℃，但不得超過24h。3、菌落計數(shù)：肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。記下各平板的菌落總數(shù)，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。4、計算方法某稀釋度的菌落數(shù)：兩平板菌落數(shù)取平均值，應選擇菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度（1）僅有一個稀釋度在此范圍：菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)。（2）有兩個稀釋度在30-300之間：菌落數(shù)之比>2，選較小值；菌落數(shù)之比<2，取平均值。（3）所有稀釋度均>300，則取稀釋倍數(shù)最大者乘以稀釋倍數(shù)報告。（4）所有稀釋度均<30，則取稀釋倍數(shù)最小者乘以稀釋倍數(shù)報告。（5）沒有任何稀釋度在30-300之間，則選最接近該范圍者（30或300）乘以稀釋倍數(shù)報告。5、結(jié)果單位：CFU/mL。二、微生物學指標檢測方法要點菌落總數(shù)檢測34（三）注意事項1.無菌操作

2.做好標記

3.何時更換吸管

4.吸吹混勻

5.瓊脂培養(yǎng)基保溫

6.安全常識二、微生物學指標檢測方法要點“兩蟲”檢測35二、微生物學指標檢測方法要點二、微生物學指標檢測方法要點“兩蟲”1.什么是“兩蟲”？賈第鞭毛蟲隱孢子蟲（Giardia）(Cryptosporidium)二、微生物學指標檢測方法要點2.賈第鞭毛蟲的結(jié)構特征賈第鞭毛蟲以孢囊(Cyst)的形態(tài)存在于水中,大小約8～12μm，單細胞的寄生蟲。熒光顯微鏡DIC顯微鏡二、微生物學指標檢測方法要點2.賈第鞭毛蟲的結(jié)構特征Giemsa

染色DIC顯微鏡二、微生物學指標檢測方法要點隱孢子蟲以卵囊(Oocyst)的形式存在于水中,大小為4～6μm.單細胞的寄生蟲.3.隱孢子蟲的結(jié)構特征熒光顯微鏡DIC顯微鏡二、微生物學指標檢測方法要點4.“兩蟲”的分布隱孢子蟲卵囊和賈第蟲孢囊可在水環(huán)境如地表水、地下水、泉水、飲用水(包括只經(jīng)消毒、直接過濾或常規(guī)處理的飲用水)中均可發(fā)現(xiàn).而在有農(nóng)田排水的水域、有動物糞便排入的地表水中,以及污水處理廠排出的水中可能會有較多的卵囊.二、微生物學指標檢測方法要點5.“兩蟲”的危害賈第鞭毛蟲致病劑量為10～100個活孢囊,隱孢子蟲致病劑量僅為1～10個活卵囊.賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊污染飲用水源引起疾病的普遍癥狀是腹瀉、嘔吐、腹痛、低燒等.賈第鞭毛蟲每年感染人數(shù)約為2.5億,隱孢子蟲每年感染人數(shù)約有2.5～5億,對免疫功能正常的人來說,癥狀一般為自限性的,幾乎不導致死亡.但對于免疫功能缺陷者會危及生命,目前尚無特效治療.二、微生物學指標檢測方法要點6.“兩蟲”的相關水質(zhì)標準我國的《城市供水水質(zhì)標準》(CJ/T206—2005)和《生活飲用水衛(wèi)生標準》(GB5749-2006)都在水質(zhì)非常規(guī)指標中規(guī)定了賈第鞭毛蟲和隱