第二章基因工程制藥

基因工程制藥基因工程制藥GeneEngineeringforPharmaceutics（三）基因工程制藥1、基因表達是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。2、宿主細胞的分類：①原核細胞，常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等；②真核細胞，常用的有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞。知識回顧基因工程制藥3、影響外源基因在E.coli表達的因素：（1）外源基因的劑量（2）外源基因的表達效率（3）表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性（4）細胞的代謝負(fù)荷（5）工程菌的培養(yǎng)條件知識回顧基因工程制藥4、真核基因在大腸桿菌中的表達形式:⑴以融合蛋白的形式表達藥物基因⑵以非融合蛋白的形式表達藥物基因⑶分泌型表達藥物基因

知識回顧基因工程制藥學(xué)習(xí)內(nèi)容基因工程菌的不穩(wěn)定性基因工程菌的培養(yǎng)基因工程制藥2.5基因工程菌的不穩(wěn)定性及對策基因工程菌的穩(wěn)定性是高水平發(fā)酵生產(chǎn)的基本條件；基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象?；蚬こ讨扑庂|(zhì)粒plasmid

是存在于細菌等微生物細胞染色質(zhì)以外的共價閉環(huán)的雙股DNA分子，具有獨立自主復(fù)制和調(diào)控能力，可賦予宿主細胞一定的生物性狀。2.5.1

質(zhì)粒的不穩(wěn)定性基因工程制藥2.5.1

質(zhì)粒的不穩(wěn)定性分類：分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變?；蚬こ讨扑庂|(zhì)粒分裂不穩(wěn)定的原因⑴含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率，質(zhì)粒丟失率與宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件有關(guān)；⑵這兩種菌比數(shù)率差異的大小。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的原因⑴質(zhì)粒自發(fā)缺失與質(zhì)粒中的短正向重復(fù)序列之間的同源重組有關(guān)，具有兩個串聯(lián)啟動子的質(zhì)粒更容易發(fā)生缺失；⑵無同源性的兩個位點之間也發(fā)生缺失；⑵培養(yǎng)條件。2.5.1

質(zhì)粒的不穩(wěn)定性基因工程制藥質(zhì)粒穩(wěn)定性(stability)的分析方法樣品不含抗性標(biāo)記抗生素

平板培養(yǎng)基10-12h100個菌落含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基

10-12h統(tǒng)計生長菌落數(shù)重復(fù)三次,計算比值

(穩(wěn)定性stability)基因工程制藥2.5.2提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法選擇合適的宿主菌選擇合適的載體選擇壓力分階段控制培養(yǎng)控制培養(yǎng)條件固定化基因工程制藥

宿主菌的遺傳特性對質(zhì)粒的穩(wěn)定性影響很大。宿主菌的比生長速率、基因重組系統(tǒng)的特性、染色體上是否有與質(zhì)粒和外源基因同源序列等都會影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法基因工程制藥

含低拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒的子代菌的頻率較大，因而對這類工程菌增加質(zhì)?？钾悢?shù)能提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性；對同一工程菌來說，通過控制不同的比生長速率可以改變質(zhì)粒的考貝數(shù)。提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法基因工程制藥

菌體生長數(shù)率對質(zhì)?？截悢?shù)和質(zhì)粒穩(wěn)定性有一影響。高生長數(shù)率時質(zhì)?？截悢?shù)下降，但穩(wěn)定性增加。生長數(shù)率/h0.20.4質(zhì)粒拷貝數(shù)10.5×10950400β-半乳糖苷酶工程菌的連續(xù)養(yǎng)3提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法基因工程制藥

選擇壓力：

1）抗生素抗性基因：在培養(yǎng)基中加選擇性壓力如抗生素等，是工程菌增養(yǎng)中提高質(zhì)粒穩(wěn)定性常用的方法。

2）營養(yǎng)缺陷型宿主菌提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法基因工程制藥

外源基因表達水平越高，重組質(zhì)粒越不穩(wěn)定。由于外源基因高效表達造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制。第一階段使菌體生長至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達。

提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法基因工程制藥工程菌的培養(yǎng)條件對其質(zhì)粒的穩(wěn)定性和表達效率影響很大。培養(yǎng)條件的變化對大腸桿菌的比生長速率有很大的影響，而基因重組菌的比生長速率對質(zhì)粒穩(wěn)定性也有很大影響，提高比生長速率有助于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法基因工程制藥固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性。基因重組大腸桿菌進行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的基因產(chǎn)物的產(chǎn)率都有了很大提高。提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法基因工程制藥2.7

基因工程菌的培養(yǎng)培養(yǎng)工藝是發(fā)酵工藝的重要組成部分，對外源蛋白的表達至關(guān)重要，直接影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，從而影響產(chǎn)品成本及市場競爭力。最佳的培養(yǎng)工藝還要考慮對純化工藝的影響?；蚬こ讨扑幓蚬こ叹L代謝的特點菌體的生長通常用比生長速率來表示。比生長速率:菌體生長速率與培養(yǎng)基中菌體濃度之比。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源、控制補料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長。控制菌體的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義?；蚬こ讨扑幋竽c桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。培養(yǎng)條件的改變，都會改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的和成和菌體的生長?；蚬こ讨扑嶸iewpoint1:能量的供應(yīng)決定了菌體的最大比生長速率。Viewpoint2:小分子前體和催化組分（RNA聚合酶，核糖體等）的限制決定了菌體的最大比生長速率。菌體生長調(diào)控的觀點A、菌體的生長與能量的關(guān)系

B、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系基因工程制藥

碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。

碳源物質(zhì)為細胞提供能量，當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用A、菌體的生長與能量的關(guān)系基因工程制藥分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生?；蚬こ讨扑嶣、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體蛋白合成增加，比生長率提高?；蚬こ叹|(zhì)粒的表達需與宿主細胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程菌生長速率降低。中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，其質(zhì)粒對工程菌的生長影響不大。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝），生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)”有關(guān)?；蚬こ讨扑巼?yán)緊反應(yīng)

stringentresponse;stringentcontrol

是指當(dāng)細菌在缺乏合成蛋白質(zhì)所必須的氨基酸時，停止合成核糖體RNA的反應(yīng)?；蚬こ讨扑幓蚬こ叹呐囵B(yǎng)分批培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)透析培養(yǎng)固定化培養(yǎng)培養(yǎng)方式基因工程制藥補料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法。在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境，延長其生長對數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補料措施結(jié)合起來，根據(jù)基因工程菌的生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補料的流加速率。補料分批培養(yǎng)基因工程制藥連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達到一定程度后，開動進料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進行不間斷培養(yǎng)。由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了解決這一問題，人們將工程菌的生長階段和基因表達階段分開，進行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)基因工程制藥透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。透析培養(yǎng)基因工程制藥基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。有人將固定化技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對分泌型菌更為有利。由于這一優(yōu)點，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展。固定化培養(yǎng)基因工程制藥選擇培養(yǎng)方式必須考慮的因素1、培養(yǎng)基2、溶解氧3、溫度4、pH5、蛋白表達相關(guān)因素－表達時機、表達程序等基因工程制藥基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備基因工程菌培養(yǎng)是為了獲得最大量的基因表達產(chǎn)物。由于這類物質(zhì)是相對獨立于細胞染色體之外的重組質(zhì)粒上的外源基因所合成的、細胞并不需要