DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)知識(shí)講解

DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1、嘗試粗提取植物或動(dòng)物組織中的DNA。2、理解DNA粗提取與DNA鑒定的原理。（重點(diǎn)、難點(diǎn)）3、理解PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程。（重點(diǎn)、難點(diǎn)）4、掌握提取生物大分子的基本過(guò)程和方法。5、理解凝膠色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理?！疽c(diǎn)梳理】要點(diǎn)一、DNA的粗提取和鑒定1、實(shí)驗(yàn)原理【高清課堂：DNA和蛋白質(zhì)技術(shù) 課題1：DNA的粗提取和鑒定】（1）DNA粗提取的原理：薛泄中的溶①提取生物大分子的基本思路是用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子薛泄中的溶②DNA或蛋白質(zhì)等成分在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同。③當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨著NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低，在0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度最??；當(dāng)NaCl溶液濃度大于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨著NaCl溶液濃度的增加而逐漸增（2）進(jìn)一步提純DNA的原理:DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用該原理，可將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。含DNA的絲狀物含DNA的絲狀物95%冷酒精DNA和蛋白質(zhì)的其他性質(zhì):①蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但對(duì)DNA不起作用②大多蛋白質(zhì)在60~80℃高溫下變性，而DNA在高于80℃才變性③洗滌劑能瓦解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA無(wú)影響（3）DNA鑒定的原理：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色DNrt的鑒*DNrt的鑒*2、實(shí)驗(yàn)流程：（1）實(shí)驗(yàn)材料的選取DNA含量高、易破碎且無(wú)顏色干擾的生物組織最好

（2）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液①動(dòng)物細(xì)胞的破碎及過(guò)濾（以雞血為例）DNA位于細(xì)胞中，要使DNA從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)，必須使細(xì)胞破碎。實(shí)驗(yàn)中，通常采用向雞血細(xì)胞液中加入蒸餾水并且攪拌的方法使細(xì)胞破碎。其原理是雞血細(xì)胞在低濃度溶液（蒸餾水）中吸水漲破，同時(shí)，攪拌的機(jī)械作用也加速了雞血細(xì)胞的破裂（包括細(xì)胞膜和核膜的破裂），于是DNA和RNA都釋放出來(lái)，但它們往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。②植物細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料（如洋蔥、菜花等）如果從植物細(xì)胞中提取DNA，則首先要用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。如提取菜花細(xì)胞中的DNA，在切碎的菜花中加入一定量的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集濾液。加入洗滌劑可以瓦解細(xì)胞膜，從而釋放出DNA；加入食鹽能夠使DNA溶解。（3）去除濾液中的雜質(zhì)濾液中含DNA、RNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)。根據(jù)DNA與蛋白質(zhì)在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，通過(guò)控制NaCl溶液的濃度，從而去除雜質(zhì)。具體做法是：在濾液中加入NaCl,使NaCl溶液濃度為2mol/L,過(guò)濾除去不溶的雜質(zhì)，再調(diào)節(jié)：NaCl溶液濃度為0.14mol/L,析出DNA,過(guò)濾去除溶液中的雜質(zhì)，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。要點(diǎn)詮釋：去除濾液中的雜質(zhì)，提純DNA主要有以下幾種方法：方法一：利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度的不同，通過(guò)控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)。具體做法：在濾液中加入NaCl,使NaCl溶液的物質(zhì)的量濃度為2mol/L（DNA溶解度大），過(guò)濾除去不溶的雜質(zhì)，再調(diào)節(jié)NaCl溶液的物質(zhì)的量濃度為0.14mol/L,析出DNA,過(guò)濾去除溶液中的雜質(zhì)，再用物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。方法二：直接在濾液中加入嫩肉粉，反應(yīng)10?15分鐘，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)。方法三：將濾液放在60℃?75℃的恒溫水浴箱中保溫10?15分鐘（此溫度下蛋白質(zhì)變性析出，DNA不受影響），注意嚴(yán)格控制溫度范圍。（4）DNA的析出與鑒定①DNA的析出除去了蛋白質(zhì)的核酸溶液，必須再進(jìn)一步沉淀和濃縮。最常用的方法是酒精沉淀法。即將處理后的溶液過(guò)濾，加入與濾液體積相等的、冷卻的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%）,靜置2min?3min,溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分。②DNA的鑒定取兩支20mL的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5mL,將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將兩支試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化，含DNA的試管溶液變藍(lán)。（5）結(jié)果分析與評(píng)價(jià)若實(shí)驗(yàn)結(jié)果不明顯，可能的原因是：①材料中核物質(zhì)沒(méi)有充分釋放出，如研磨不充分或蒸餾水的量不夠。②加入酒精后搖動(dòng)或攪拌時(shí)過(guò)猛，DNA被破壞。③二苯胺配制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，否則二苯胺變成淺藍(lán)色，影響鑒定效果。要點(diǎn)二、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段未發(fā)布 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段：實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程：邊解旋邊復(fù)制1、實(shí)驗(yàn)原理未發(fā)布 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段：實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程：邊解旋邊復(fù)制(1)條件：DNA模板、解旋酶、DNA聚合酶等、RNA引物4種脫氧核甘三磷酸為原料、需要消耗能量(2)子鏈合成方向：5,-3，要點(diǎn)詮釋：①解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵斷開，DNA聚合酶是將單個(gè)核甘酸加到已有的單鏈片段的3,端上，DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口。②DNA單鏈有方向性，DNA母鏈的3/端對(duì)應(yīng)著子鏈的5/端，即DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?。子鏈合成方向都?,一3’。2、PCR過(guò)程所需條件模板：要擴(kuò)增的DNA片段兩種引物：各自5,端序列相互補(bǔ)的DNA引物(20個(gè)左右堿基的短DNA單鏈)DNA聚合酶：耐高溫的TaqDNA聚合酶原料：dNTP(4種脫氧核甘三磷酸：dATP、dTTP、dGTP和dCTP)3、PCR技術(shù)的原理ofDNAPrimerAnnealing延伸1OofDNAPrimerAnnealing延伸1O5-foldamplificationoltargetDNAfragment要點(diǎn)詮釋：PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。PCR過(guò)程可用下圖表示：（1）變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈0附解聚為單鏈，如下圖:（2）復(fù)性（退火）：系統(tǒng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，如下圖：：山」1口；5，r■T引物I 3引物n（3）延伸：當(dāng)系統(tǒng)溫度上升到72℃左右（溫度為熱穩(wěn)定DNA聚合酶的最適溫度），溶液中的四種脫氧核甘酸（A、T、G、C）在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈，如下圖：一口」」.口口?■:“1口」口」_□￡引物1 ］重復(fù)循環(huán) 引物n54、PCR的實(shí)驗(yàn)操作（1）實(shí)驗(yàn)用具①微量離心管：它是一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5mL。實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所。②微量移液器：用于向微量離心管中轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，每吸取一種試劑后其上的一次性吸液槍頭都必須更換。③PCR儀：該儀器能自動(dòng)調(diào)控溫度，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。在實(shí)驗(yàn)操作中，用微量移液器，按照PCR反應(yīng)體系的配方在微量離心管中依次加入各組分，再設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序就可以了。如果沒(méi)有PCR儀，可以設(shè)置三個(gè)恒溫水浴鍋，溫度分別為94℃、55℃、72℃，在三個(gè)恒溫水浴鍋中來(lái)回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管即可。（2）注意問(wèn)題PCR技術(shù)高度靈敏、極其微量的污染都會(huì)造成非目標(biāo)DNA片段的大量擴(kuò)增。為了避免出現(xiàn)這一現(xiàn)象，PCR操作時(shí)要注意做到：隔離操作區(qū)、分裝試劑、簡(jiǎn)化操作程序等：①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。②PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在一20℃下儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。③在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s,使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。5.PCR擴(kuò)增的計(jì)算與DNA含量的測(cè)定(1)理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算DNA擴(kuò)增與DNA復(fù)制類似，呈指數(shù)擴(kuò)增。若開始只有一個(gè)DNA提供模板，則循環(huán)n次后有2n個(gè)；若開始有N°個(gè)DNA提供模板，則循環(huán)n次后獲得的子代DNA數(shù)目為N°-2n個(gè)。((2)實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定 °DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)?？梢岳肈NA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)定，具體方法如下：T要點(diǎn)三、血紅蛋白的提取和分離1、凝膠色譜法(1)概念：是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。即凝膠過(guò)濾層析，也稱分子排阻色譜法或凝膠滲透層析。這是根據(jù)分子的大小分離蛋白質(zhì)混合物的最有效的方法之一。(2)凝膠色譜法的介質(zhì)：凝膠過(guò)濾所用的介質(zhì)是凝膠珠，其內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠的交聯(lián)度或孔度(網(wǎng)孔大小)決定了凝膠的分級(jí)分離范圍，即能被該凝膠分離開來(lái)的蛋白質(zhì)混合物的相對(duì)分子質(zhì)量范圍。目前經(jīng)常使用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖等。(3)原理：凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)的速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。(如下圖所示)

心相尉分門丘融轉(zhuǎn)小的兆白版山?‘廣r故作用也人屣朕覆粒內(nèi)部而坡滯陽(yáng)(杷對(duì)分」砒睛較大的冊(cè)白質(zhì)披排an任齡股順粒外附*止糖椀之間迅速通過(guò).h，CD策門成由企勒H4⑵洗脫開始.相羯分丁班丫度小的蜜白班行勝逃人疑膠顆粒內(nèi)F相對(duì)分F/出較大的蛋白質(zhì)則被推陽(yáng)干期粒之外T0)相對(duì)分子於fit較小的蛋白質(zhì)被滯都.相對(duì)分子電觀我大的蛋白成向下移如⑶相對(duì)分F.嘀計(jì)不同的向「登金加F；⑸榴射外子質(zhì)出較大的蛋E」成行程較短,已從層析機(jī)中洗脫出東.上對(duì)辦『麻獷較小的支白質(zhì)迷在行世中。要點(diǎn)詮釋:蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運(yùn)動(dòng)情況分析:相對(duì)分子量大相對(duì)分子量小直徑大小大于凝膠顆粒空隙直徑小于凝膠顆?？障吨睆竭\(yùn)動(dòng)方式垂直向下運(yùn)動(dòng)無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)速度較快較慢運(yùn)動(dòng)路程較短較長(zhǎng)洗脫順序先從凝膠珠中洗脫出來(lái)后從凝膠珠中洗脫出來(lái)2、緩沖溶液緩沖溶液是一類能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響，維持pH基本不變的溶液。該溶液的這種抗pH變化的作用稱為緩沖作用。緩沖溶液通常是由1?2種緩沖劑溶于水配制而成，調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例即可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。(1)緩沖溶液的組成：緩沖溶液必須同時(shí)含有兩種物質(zhì)，一種是能抵制外加少量強(qiáng)堿的物質(zhì)，另一種是能抵制外加少量強(qiáng)酸的物質(zhì)。①弱酸和弱酸鹽組合：H2cO3—NaHCO3；CHfOOH-CHfOONa。②弱堿和弱堿鹽組合：NH4OH—NH4Cl。③多元弱酸的酸式鹽和它所對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽；NaH2PO4—Na2HpO4、KH2PO4—K2HpO4。(2)緩沖溶液的作用：在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響，維持pH基本不變。緩沖溶液通常由1?2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。(3)緩沖溶液的配制和pH的測(cè)定：生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進(jìn)行的，為了能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過(guò)程，就必須保持體外溶液的pH與體內(nèi)環(huán)境中的pH基本一致。因此，緩沖溶液的正確配制和pH的準(zhǔn)確測(cè)定，在生物化學(xué)的研究工作中有著極其重要的意義。3、電泳(1)電泳概念：電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。(2)電泳原理：許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核甘酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。（3）常用方法：瓊脂糖凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳由于瓊脂糖本身不帶電荷，所以各種分子在電場(chǎng)中的遷移速度因各種分子的帶電性質(zhì)差異、分子大小、形狀不同而不同，從而得以分離。在凝膠中加入SDS,使蛋白質(zhì)解聚成單鏈，與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，使其遷移速度完全取決于分子的大小。4、血紅蛋白的提取和分離過(guò)程蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定（1）樣品處理①紅細(xì)胞的洗滌洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白。采用低速短時(shí)間離心，吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法去除血漿蛋白；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。要點(diǎn)詮釋：a.洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化。反離心時(shí)轉(zhuǎn)速要低，時(shí)間要短，一般為500r/min,離心2min。c.洗滌三次后，如果上清液中還有黃色，可增加洗滌次數(shù)。②血紅蛋白的釋放：紅細(xì)胞在蒸餾水和甲苯的作用下破裂，釋放出血紅蛋白。③分離血紅蛋白溶液：將混合液進(jìn)行離心后，會(huì)明顯看到試管中的溶液的分層情況：第3層的紅色透明液體是血紅蛋白的水溶液。（2）粗分離一一透析①原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。②過(guò)程：取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中（pH為7.0）,透析12h。③目的：除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)；用于更換樣品的緩沖液。（3）純化一一凝膠色譜操作①凝膠色譜柱的裝填裝填前，凝膠用蒸餾水或者洗脫液充分溶脹。凝膠裝填要均勻，色譜柱內(nèi)不能有氣泡，一旦發(fā)現(xiàn)存在氣泡，必須重裝。裝填完后，立即用300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12h,使凝膠裝填緊密。要點(diǎn)詮釋：a.商品凝膠是干燥的顆粒，使用前需要直接放在洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可以將加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，逐漸升溫至接近沸騰，通常只需1h?2h。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且可以除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣。b.在色譜柱中裝填凝膠的時(shí)候要盡量緊密，以減少凝膠顆粒之間的空隙。一是在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在，因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。二是在凝膠色譜操作過(guò)程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。②樣品的加入和洗脫調(diào)整緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，調(diào)整緩沖液與凝膠面平齊；滴加透析樣品：關(guān)閉下端出口，用吸管小心地將1mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端；樣品滲入凝膠床：加樣后，打開下端出口，使樣品完全滲入凝膠床內(nèi)；再調(diào)整緩沖液面：關(guān)閉出口，小心加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度；洗脫：打開下端出口，用磷酸緩沖液洗脫；收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5mL收集一管，連續(xù)收集要點(diǎn)詮釋：a.滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。b.在蛋白質(zhì)分離過(guò)程中，仔細(xì)觀察紅色區(qū)帶在洗脫過(guò)程中的移動(dòng)情況。如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功。（4）SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，是根據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陽(yáng)離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）按重量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)天然蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)，使蛋白質(zhì)分子相對(duì)遷移率的大小完全取決于相對(duì)分子質(zhì)量的大小，因此可從已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的對(duì)數(shù)和相對(duì)遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出供試品的相對(duì)分子質(zhì)量?！镜湫屠}】類型一：DNA的粗提取和鑒定例1、（2015江蘇高考）圖1、2分別為“DNA的粗提取與鑒定冶實(shí)驗(yàn)中部分操作步驟示意圖，下列敘述正確的是()A.圖1、2中加入蒸餾水稀釋的目的相同B.圖1中完成過(guò)濾之后保留濾液C.圖2中完成過(guò)濾之后棄去濾液D.在圖1雞血細(xì)胞液中加入少許嫩肉粉有助于去除雜質(zhì)【答案】BCD【解析】圖1加蒸餾水的目的是使雞紅細(xì)胞漲破，圖2加蒸餾水是為了稀釋，A錯(cuò)誤。圖1加蒸餾水后，DNA存在于濾液中，B正確。圖2加蒸餾水后，DNA析出，所以棄去濾液，C正確。嫩肉粉主要是蛋白酶，可以將雞血中蛋白質(zhì)水解，D正確?！军c(diǎn)評(píng)】本題考查DNA粗提取和鑒定的過(guò)程，需思考并梳理實(shí)驗(yàn)過(guò)程，在理解的基礎(chǔ)上識(shí)記相關(guān)過(guò)程?！九e一反三】：【變式】下列操作中，對(duì)DNA的提取量影響較小的是（ ）A.使雞血細(xì)胞在蒸餾水中充分破裂，放出DNA等核物質(zhì)B.攪拌時(shí)，要用玻璃棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌C.在析出DNA黏稠物時(shí)，要緩緩加蒸餾水，直至溶液中黏稠物不再增多D.在用酒精沉淀DNA時(shí)，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻【答案】B【解析】題中A、C、D都直接影響DNA的提取量的多少，而B項(xiàng)對(duì)提取量相對(duì)影響較小，只是使得到的DNA不致斷裂。例2、關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)：(1)該實(shí)驗(yàn)依據(jù)的原理是( )A.DNA在：NaCl溶液中的溶解度隨NaCl溶液濃度的不同而不同B.利用DNA不溶于酒精的性質(zhì)，可除去細(xì)胞中溶于酒精的物質(zhì)而得到較純的DNAC.DNA是大分子有機(jī)物，不溶于水而溶于某些有機(jī)溶劑D.在沸水中DNA遇二苯胺會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)(2)實(shí)驗(yàn)的正確操作步驟是( )A.制備雞血細(xì)胞一提取細(xì)胞核物質(zhì)一溶解核內(nèi)的DNA一析出并濾取DNA黏稠物一DNA的再溶解一提取較純凈的DNA一鑒定DNAB.制備雞血細(xì)胞液一提取細(xì)胞核物質(zhì)一溶解并析出DNA-DNA的再溶解一提取較純凈的DNA一鑒定DNAC.制備雞血細(xì)胞液一溶解DNA一提取細(xì)胞核中DNA-DNA的再溶解一提取較純凈的DNA-DNA的鑒定D.制備雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)提取液一溶解并析出DNA一提取較純凈的DNA-DNA的鑒定(3)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中第一次所用NaCl溶液的濃度是；第二次所用NaCl溶液的濃度是；第三次所用NaCl溶液的濃度是。所用酒精最好是，其體積分?jǐn)?shù)為。(4)鑒定DNA的方法是，向溶有DNA絲狀物的試管中加入1^的試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min,冷卻后可觀察到溶液呈;也可取少許DNA絲狀物置于載玻片上，滴一滴溶液，片刻后用水沖洗，可見絲狀物被染成?！敬鸢浮?1)A、B、D(2)A2mol/L2mol/L0.015mol/L冷酒精95%4二苯胺淺藍(lán)色甲基綠藍(lán)綠色【解析】(1)本實(shí)驗(yàn)依據(jù)的原理是A、B、0三個(gè)方面，必須明確的是當(dāng)NaCl溶液的濃度為0.14mol/L時(shí)DNA的溶解度最低，具體操作時(shí)用2mol/L的NaCl溶液，再加水稀釋至黏稠物不再增多時(shí)，表明該溶液濃度即為0.14mol/L。(2)A項(xiàng)為正確的操作程序，B項(xiàng)漏掉YDNA的再溶解前要過(guò)濾，C項(xiàng)中提取細(xì)胞核中DNA的敘述欠妥，應(yīng)是提取核物質(zhì)，并且應(yīng)放在溶解DNA之前，D項(xiàng)明顯有誤。(3)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程三次用到NaCl溶液，第一次是溶解細(xì)胞核內(nèi)DNA,第二次是DNA黏稠物的再溶解；第三次是DNA的鑒定。前二次所用濃度均是2mol/L。第三次所用濃度為0.015mol/L。所用酒精最好是體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精。(4)鑒定DNA的存在有兩種方法，教材中的二苯胺加熱法的優(yōu)點(diǎn)在于易做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，另一種方法是把甲基綠溶液直接滴在有DNA絲狀物的載玻片或玻璃棒上。呈藍(lán)綠色反應(yīng)，即證明DNA的存在?！军c(diǎn)評(píng)】該實(shí)驗(yàn)是高中教材中操作最復(fù)雜，要求也是最嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)。類型二：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段例3、PCR一般要經(jīng)過(guò)三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，由引物I延伸而成的DNA單鏈作模板時(shí)( )A.仍與引物I結(jié)合進(jìn)行DNA子鏈的延伸B.與引物H結(jié)合進(jìn)行DNA子鏈的延伸C.同時(shí)與引物I和引物H結(jié)合進(jìn)行子鏈的延伸D.無(wú)需與引物結(jié)合，在酶的作用下從頭合成子鏈

【答案】B【解析】考查同學(xué)們對(duì)PCR反應(yīng)中的變性、復(fù)性、延伸的實(shí)質(zhì)是否理解。當(dāng)由引物I延伸而成MNA單鏈作模板時(shí)，此單鏈引物固定端為5,端，因此與它互補(bǔ)的子鏈應(yīng)從另一端開始合成，即與引物H結(jié)合延伸DNA子鏈?！九e一反三】：【變式一】引物的作用是（ ）A.打開DNA雙鏈B.催化合成DNA子鏈C.使DNA聚合酶能夠從引物的3,端開始復(fù)制D.提供模板【答案】C【解析】DNA分子的復(fù)制具有方向性，即只能從子鏈的5,?3,方向進(jìn)行復(fù)制。當(dāng)引物與DNA母鏈結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3,端開始延伸DNA鏈。所謂3，、5,是指脫氧核糖上C原子的位置。脫氧核糖的結(jié)構(gòu)圖如下圖所示。 「 「HOC凡/、OH【變式二】在PCR實(shí)驗(yàn)操作中，下列說(shuō)法不正確的是（ ）A.在微量離心管中添加各種試劑時(shí)，只需一個(gè)槍頭B.離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán)，防止液體外溢C.用手指輕彈離心管壁的目的是使反應(yīng)液充分混合D.離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果【答案】A【變式三】PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、緩沖溶液以及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是（）。A.反復(fù)洗滌 B.用酒精擦洗 C.高壓滅菌 D.在一20℃儲(chǔ)存【答案】C【解析】為了避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在一20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需的試劑從冰箱內(nèi)拿出，放在冰塊上緩慢融化。例4、（2015福建高考）GDNF是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。對(duì)損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。研究人員構(gòu)建了含GDNF基因的表達(dá)載體（如圖所示），并導(dǎo)入到大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中，用于干細(xì)胞基因治療的研究。請(qǐng)回答:

COVF基因(700bp)bp表不堿基對(duì)；載體和基因片段上的小箭號(hào)示相關(guān)限制1?的靜切位點(diǎn)(6000bp)重組載體正向連接COVF基因(700bp)bp表不堿基對(duì)；載體和基因片段上的小箭號(hào)示相關(guān)限制1?的靜切位點(diǎn)(6000bp)重組載體正向連接(6700bp)反向連接載體酶切電泳分析圖譜注:一表示電泳條帶①、②、③表示電泳泳道（1）在分離和培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的過(guò)程中，使用胰蛋白酶的目的是 。（2）構(gòu)建含GDNF基因的表達(dá)載體時(shí)，需選擇圖1中的限制酶進(jìn)行酶切。（3）經(jīng)酶切后的載體和GDNF基因進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)篩選得到的載體主要有三種：?jiǎn)蝹€(gè)載體自連、GDNF基因與載體正向連接、GDNF基因與載體反向連接（如圖1所示