免疫細(xì)胞及其功能檢驗(yàn)技術(shù)

免疫細(xì)胞及其功能檢驗(yàn)技術(shù)第一頁，共五十一頁，2022年，8月28日第二十三章

免疫細(xì)胞及其功能檢驗(yàn)技術(shù)第二頁，共五十一頁，2022年，8月28日單個核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞及其亞群的分離純化原理。T細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志和功能檢測。B細(xì)胞功能檢測的方法和原理。NK細(xì)胞的表面標(biāo)志及其功能檢測方法。中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能檢測。本章要點(diǎn)第三頁，共五十一頁，2022年，8月28日目錄免疫細(xì)胞的分離與純化1淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測2吞噬細(xì)胞功能檢測3第四頁，共五十一頁，2022年，8月28日免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等。通過分離、純化免疫細(xì)胞及其亞群，并對其數(shù)量和功能測定，可以判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)，對指導(dǎo)臨床實(shí)踐和科學(xué)研究具有重要意義。前言第五頁，共五十一頁，2022年，8月28日第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化免疫細(xì)胞的分離方法很多，主要根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志、理化性狀和細(xì)胞功能等特征。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⑺蛛x的目的細(xì)胞群種類、數(shù)量和純度等要求選擇分離方法。所用的方法應(yīng)力求操作簡便、盡量保持細(xì)胞活性兼顧細(xì)胞純度和獲得率。第六頁，共五十一頁，2022年，8月28日一、白細(xì)胞的分離（一）自然沉降法加抗凝血于試管中室溫或37℃中靜置（30-60min）分層結(jié)果示意圖第七頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）高分子聚合物沉降法抗凝血與等量3%明膠或6%右旋糖酐溶液混勻室溫或37℃中靜置（30～60min）分層結(jié)果與自然沉降法類似優(yōu)點(diǎn)：速度快、得率高不足：白細(xì)胞黏性增加第八頁，共五十一頁，2022年，8月28日二、外周血單個核細(xì)胞的分離外周血單個核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）主要是指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。PBMC是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的細(xì)胞群PBMC也是T、B細(xì)胞分離純化的細(xì)胞來源。第九頁，共五十一頁，2022年，8月28日細(xì)胞種類密度紅細(xì)胞1.093白細(xì)胞1.092淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞1.075~1.090血小板1.030~1.035人外周血中各類血細(xì)胞密度常用的分離液：Ficoll液和Percoll液尤以密度為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分層液（Ficoll液）最常用。第十頁，共五十一頁，2022年，8月28日（一）

Ficoll分離法注意：溫度以20℃最適宜，超過25℃影響細(xì)胞得率第十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）

Percoll分層液法連續(xù)密度梯度分離液（Percoll液+PBS，離心）加入PBMC懸液或抗凝全血1000×g離心20min結(jié)果示意圖第十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日三、淋巴細(xì)胞的純化及亞群的分離采用Ficoll和Percoll分離法獲得的細(xì)胞懸液成分仍然較為復(fù)雜、均一性不佳。通常需要進(jìn)一步分離純化淋巴細(xì)胞及其亞群。分離原理主要基于細(xì)胞的表面標(biāo)志和功能等性質(zhì)。淋巴細(xì)胞及其亞類的分離純化是免疫學(xué)檢驗(yàn)與研究的重要基礎(chǔ)技術(shù)。第十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日（一）淋巴細(xì)胞的純化去除紅細(xì)胞：低滲裂解法、氯化銨裂解法。去除血小板：多次洗滌離心法、胎牛血清梯度離心法。去除單核細(xì)胞：黏附法、羧基鐵吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法第十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）淋巴細(xì)胞的分離E花環(huán)沉降法該法簡便易行，主要用于T細(xì)胞的分離PBMC懸液與SRBC混合Ficoll法密度梯度離心收集管底細(xì)胞并低滲裂解第十五頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）淋巴細(xì)胞的分離尼龍棉分離法該法簡單快速，可分離T細(xì)胞和B細(xì)胞PBMC懸液加入尼龍棉柱37℃中靜置1～2小時預(yù)熱的含小牛血清培養(yǎng)液洗脫獲得T細(xì)胞冷培養(yǎng)液邊沖洗邊擠壓獲得B細(xì)胞第十六頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）淋巴細(xì)胞的分離免疫磁珠分離法第十七頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）淋巴細(xì)胞的分離流式細(xì)胞術(shù)分離法該法快速、細(xì)胞純度和獲得率高，可分離各種淋巴細(xì)胞及其亞群。第十八頁，共五十一頁，2022年，8月28日四、吞噬細(xì)胞的分離吞噬細(xì)胞包括兩類：一類是大吞噬細(xì)胞即單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（包括血液中的單核細(xì)胞以及組織器官中的巨噬細(xì)胞）；另一類是小吞噬細(xì)胞，即中性粒細(xì)胞。分離原理：主要根據(jù)其表面標(biāo)志和生物學(xué)特性。第十九頁，共五十一頁，2022年，8月28日（一）單核細(xì)胞的分離Percoll密度梯度分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法（常用方法）免疫磁珠分離法：分選CD14+細(xì)胞（常用方法）黏附法黏附法會影響單核細(xì)胞的功能，僅適用于去除單核細(xì)胞。第二十頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）巨噬細(xì)胞的分離斑蝥敷貼法：（用于分離人巨噬細(xì)胞）

操作要點(diǎn)：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的濾紙?zhí)笤谇氨蹆?nèi)側(cè)皮膚，4~5小時后見皮膚局部充血，48小時后出現(xiàn)水泡，吸取滲出液（主要為巨噬細(xì)胞）、離心洗滌。腹腔滲出液分離法：（用于分離動物巨噬細(xì)胞）

操作要點(diǎn)：少量液體石蠟注入動物腹腔內(nèi)，3~4天后沖洗出腹腔滲出液（70%~80%為巨噬細(xì)胞）。第二十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日（三）中性粒細(xì)胞的分離右旋糖酐沉降法：

操作要點(diǎn)：抗凝靜脈血與6%右旋糖酐溶液按比例混合，室溫條件垂直靜置一定時間后，紅細(xì)胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白細(xì)胞沉降速度慢位于上層，獲取上層細(xì)胞。第二十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測許多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能變化。數(shù)量檢測：根據(jù)淋巴細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志。功能測定：包括體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。第二十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日一、T細(xì)胞數(shù)量及功能檢測（一）T細(xì)胞的數(shù)量檢測根據(jù)T細(xì)胞表面CD分子檢測：（1）間接熒光免疫法（2）免疫組織化學(xué)法：①酶標(biāo)（ABC法、APAAP法）②金標(biāo)法（即IGSS法）第二十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日間接熒光免疫法第二十五頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）T細(xì)胞功能檢測T細(xì)胞增殖試驗(yàn)：形態(tài)學(xué)法、3H-TdR摻入法、MTT法CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)：51Cr釋放法抗原特異性T細(xì)胞定量檢測：MHC-抗原肽四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測：流式細(xì)胞術(shù)體內(nèi)試驗(yàn)：結(jié)核菌素試驗(yàn)、PHA皮膚試驗(yàn)第二十六頁，共五十一頁，2022年，8月28日PBMCPHA5％CO2、

37℃培養(yǎng)72h細(xì)胞涂片染色顯微鏡檢查該法簡便易行、容易在基層推廣，但主觀因素影響大。形態(tài)學(xué)法T細(xì)胞增殖試驗(yàn)第二十七頁，共五十一頁，2022年，8月28日未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（％）＝轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)計數(shù)的淋巴細(xì)胞總數(shù)X100％第二十八頁，共五十一頁，2022年，8月28日培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞抗凝全血分離液離心過濾測量放射性3H-TdR摻入法靈敏度高客觀性好第二十九頁，共五十一頁，2022年，8月28日原理：外周血T細(xì)胞

PHA發(fā)生增殖

MTT含藍(lán)色甲顆粒的T細(xì)胞

MTT

PHA有機(jī)溶劑測吸光度（A）值

計算SI判定細(xì)胞增殖結(jié)果(SI≧2具有意義)MTT法操作簡便無放射污染第三十頁，共五十一頁，2022年，8月28日51Cr釋放法淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr釋放測定γ射線CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)第三十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日原理根據(jù)T細(xì)胞活化的雙識別原理，用生物工程技術(shù)將MHC分子在體外組裝，并結(jié)合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物，結(jié)合流式細(xì)胞儀定量檢測抗原特異性T細(xì)胞。TMHC-抗原肽四聚體技術(shù)第三十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日MHC-肽四聚體技術(shù)第三十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日第三十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測實(shí)驗(yàn)原理:用刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾基體積聚，用流式細(xì)胞儀測定淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子種類，確定Th1/Th2細(xì)胞的百分率。第三十五頁，共五十一頁，2022年，8月28日分泌的細(xì)胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++Thl和Th2分泌的細(xì)胞因子第三十六頁，共五十一頁，2022年，8月28日二、B細(xì)胞數(shù)量及功能檢測（一）B細(xì)胞數(shù)量檢測根據(jù)B細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測：（1）mIg的檢測：免疫熒光、免疫組化（2）

CD分子的檢測：檢測CD19、CD20、CD21、CD22、

CD29以及CD5等（3）小鼠紅細(xì)胞受體的檢測：花環(huán)試驗(yàn)第三十七頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）B細(xì)胞功能檢測B細(xì)胞增殖試驗(yàn)：3H-TdR摻入法、MTT法（刺激物：小鼠用LPS；人用SPA的金黃色葡萄球菌菌體或抗IgM抗體）B細(xì)胞抗體產(chǎn)生能力檢測：溶血空斑試驗(yàn)、ELISPOT第三十八頁，共五十一頁，2022年，8月28日經(jīng)典溶血空斑試驗(yàn)1.SRBC致敏的B細(xì)胞與SRBC在凝膠介質(zhì)中混勻；2.抗體形成細(xì)胞(Antibodyformingcell,AFC)周圍的SRBC與AFC產(chǎn)生的抗體結(jié)合而被致敏；3.加入豚鼠新鮮補(bǔ)體，致敏SRBC激活補(bǔ)體而溶解，在AFC周圍出現(xiàn)肉眼可見的溶血空斑；4.計算溶血空斑的數(shù)目。第三十九頁，共五十一頁，2022年，8月28日溶血空斑試驗(yàn)第四十頁，共五十一頁，2022年，8月28日酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)抗體產(chǎn)生B細(xì)胞抗原包被酶聯(lián)抗抗體凝膠底物顯色可在單細(xì)胞水平上檢測B產(chǎn)生抗體和T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子第四十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日三、NK細(xì)胞數(shù)量及功能檢測（一）NK細(xì)胞數(shù)量檢測根據(jù)NK細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測：

CD分子的檢測：檢測CD3、CD56、CD16等（CD3-CD56+CD16+）

第四十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）NK細(xì)胞功能檢測形態(tài)學(xué)法酶釋法：LDH釋放法熒光法：時間分辨熒光免疫分析法放射性核素釋放法：51Cr釋放法、125I-UdR釋放法流式細(xì)胞術(shù)：PI染色NK靶細(xì)胞檢測熒光強(qiáng)度、cpm等K562細(xì)胞為人NK細(xì)胞殺傷功能檢測的常用靶細(xì)胞第四十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日第三節(jié)吞噬細(xì)胞功能檢測一、中性粒細(xì)胞功能檢測趨化功能檢測：體內(nèi)法（也稱皮膚窗口法）體外法（濾膜滲透法/

Boyden小室法、瓊脂糖平板法）吞噬功能檢測：（吞噬金黃色葡萄球菌或白色念珠菌）殺傷功能檢測：

溶菌法、硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)第四十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日體內(nèi)實(shí)驗(yàn)法--皮膚窗口法在受檢者前臂屈側(cè)中央3㎜范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2，5，8，12，24，36小時各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集開始時間、聚集程度等。健康正常人一般2～3小時后開始聚集，達(dá)50～100個，6小時可達(dá)1000個以上。（一）中性粒細(xì)胞趨化功能檢測第四十五頁，共五十一頁，2022年，8月28日體外法--Boyden小室法Boyden小室第四十六頁，共五十一頁，2022年，8月28日體外法--瓊脂糖平板法原理及