典型發(fā)酵過程的特性與工業(yè)控制

典型發(fā)酵過程的特性與工業(yè)控制第一頁，共四十五頁，2022年，8月28日第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)第二頁，共四十五頁，2022年，8月28日動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的總體差異內(nèi)容微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞壁普遍存在存在生長速率0.1~0.5h-10.01~0.05h-1需氧量高低營養(yǎng)要求普遍簡單復(fù)雜CO2需求一些微生物需CO2許多需要CO2形成緩沖液環(huán)境影響小大大小范圍100~2000nm10000~100000nm接種濃度低高（10-5.ml-1）生長濃度高（109~1010.ml-1）低（106.ml-1）第三頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指在合適的培養(yǎng)條件下，動(dòng)物細(xì)胞離體生長和增殖，并保持其特性和功能的技術(shù)，這些細(xì)胞不再形成組織。第四頁，共四十五頁，2022年，8月28日

1細(xì)胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素

2細(xì)胞大，無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差

3需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌

4群體生長效應(yīng)，貼壁生長（錨地依賴性）

5培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高

6原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡

第五頁，共四十五頁，2022年，8月28日兩個(gè)專業(yè)術(shù)語細(xì)胞系：首次分離組織的培養(yǎng)稱之為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代成功后即成細(xì)胞系。細(xì)胞株：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)記的培養(yǎng)物稱為細(xì)胞株。第六頁，共四十五頁，2022年，8月28日細(xì)胞生長的類型貼壁依賴性來自動(dòng)物實(shí)體組織的大多數(shù)細(xì)胞需要貼壁單層生長。只要它們沒有轉(zhuǎn)化為非貼壁依賴性的必須貼伏在合適的固體介質(zhì)上并鋪展，才能生長。非貼壁依賴性細(xì)胞無需貼附到固體介質(zhì)上就能生存和生長的細(xì)胞。來自血液、淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞常為非貼壁依賴性的，它們形態(tài)呈圓形。第七頁，共四十五頁，2022年，8月28日生長特性：貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。

第八頁，共四十五頁，2022年，8月28日貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：

●容易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。

●當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長基質(zhì)時(shí)，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。

●同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。

●適用于所有類型細(xì)胞。

第九頁，共四十五頁，2022年，8月28日.貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)：與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大；

●占地面積大；

●不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長；

第十頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、細(xì)胞培養(yǎng)物的獲得原代培養(yǎng)物在無菌條件下，用鑷子和剪刀將切下的組織碎成小塊，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶處理，使組織解離成單個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)容器中無菌培養(yǎng)。這種原代培養(yǎng)物中含有各種不同分化的細(xì)胞類型，它們的生長速率不同，成纖維細(xì)胞最易生長，常會(huì)在此后的傳代培養(yǎng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。仔細(xì)控制培養(yǎng)基的成分，可以選擇性地支持某些細(xì)胞類型的生長。第十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日第十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化細(xì)胞正常細(xì)胞經(jīng)過一個(gè)轉(zhuǎn)化的過程，喪失了對(duì)生長控制的敏感性。轉(zhuǎn)化伴隨著染色體模式的改變，二倍體變成異倍體。更典型的表現(xiàn)是，貼壁依賴性細(xì)胞對(duì)貼壁的依賴及細(xì)胞密度的抑制發(fā)生改變，雖然也許細(xì)胞仍需貼壁生長，但可能生長到不止單層。細(xì)胞轉(zhuǎn)化有四種主要途徑：①有些細(xì)胞在培養(yǎng)中自發(fā)轉(zhuǎn)化②化學(xué)轉(zhuǎn)化。某些化學(xué)致癌物會(huì)增加轉(zhuǎn)化頻率③病毒轉(zhuǎn)化。④致瘤因子轉(zhuǎn)化第十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于有無限壽命，在培養(yǎng)中更易生長，被廣泛用于生成生物制品，如重組蛋白藥物、病毒疫苗等。但是，人們對(duì)她們的安全性仍然非常關(guān)心，對(duì)可能造成的生物危害性進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)和控制。第十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞使來自于腫瘤組織的細(xì)胞或經(jīng)腫瘤細(xì)胞與其它細(xì)胞融合產(chǎn)生的細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞。與轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，它們是惡性的，基本上是非貼壁依賴性的。腫瘤細(xì)胞有很好的增殖特性，生長速率高。對(duì)生長因子的依賴程度低，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求也不那么苛刻。。腫瘤細(xì)胞的致癌性是造成其難以用于體內(nèi)治療產(chǎn)品生產(chǎn)的主要原因。由于近年來分離純化技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)這些細(xì)胞致瘤性的深刻認(rèn)識(shí)，對(duì)其在生產(chǎn)中的應(yīng)用有所松動(dòng)，如雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體已用于體內(nèi)治療，C127細(xì)胞生成重組蛋白的研究也形成了規(guī)模。第十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日體外培養(yǎng)所需的一般條件適宜的培養(yǎng)皿血清成分370CCO25％95～100％濕度抗生素第十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基培養(yǎng)基配置考慮的因素的pH多數(shù)細(xì)胞系在pH7.4下生長得很好。一些正常的成纖維細(xì)胞系以7.4~7.7最好，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系以pH7.0~7.4更合適。緩沖在高細(xì)胞密度下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系產(chǎn)生大量二氧化碳和乳酸，引起pH下降，需要在培養(yǎng)基中加入緩沖作用的試劑，如碳酸氫鈉、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonicacid])第十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日溫度低溫下CO2溶解度增加，引起pH變化。黏度培養(yǎng)基的黏度主要受血清含量的影響。在攪拌條件下黏度大則細(xì)胞受損傷小。加入羧甲基纖維素或聚己烯基吡咯烷增加培養(yǎng)基黏度第十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成1、水細(xì)胞培養(yǎng)用的各種液體都要用水來配置，對(duì)水的純度要求很高。通常細(xì)胞培養(yǎng)用水的污染物標(biāo)準(zhǔn)可參考醫(yī)藥上注射用水標(biāo)準(zhǔn)，單原則上應(yīng)高于注射用水標(biāo)準(zhǔn)。2、能源和碳源主要是糖和糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺。細(xì)胞能用的糖主要是六碳糖，特別是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為乳酸。昆蟲細(xì)胞更偏愛蔗糖。在多數(shù)培養(yǎng)基中谷氨酰胺作為主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的問題是它的自發(fā)降解，降解量與時(shí)間、溫度、血清和磷酸濃度有關(guān)，降解產(chǎn)物為氨，對(duì)細(xì)胞有毒性。第十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日3、氮源氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是細(xì)胞合成復(fù)雜含氮化合物的前體，還作為必不可少的能源物質(zhì)。不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的種類和濃度有不同的要求，但除了前面提到的谷氨酰胺外，還有12種氨基酸不能在細(xì)胞內(nèi)合成，必須依靠從培養(yǎng)基中攝取。幾乎所有培養(yǎng)基中都含有全部必須氨基酸，根據(jù)需要補(bǔ)充適量非必需氨基酸。非必須氨基酸含量低時(shí)常會(huì)增加必須氨基酸的消耗量。增加氨基酸的濃度可以提高培養(yǎng)的細(xì)胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率。第二十頁，共四十五頁，2022年，8月28日4、維生素維生素是維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)的一種重要生物活性化合物，在細(xì)胞中多形成酶的輔基或輔酶，對(duì)細(xì)胞的代謝過程有重要影響。5、無機(jī)離子無機(jī)離子分為兩組，一種是含量較高的，，包括維持膜電勢(shì)的（Na+，K+），維持滲透壓平衡（Na+，Cl－），作為酶的輔因子（Mg2+），促進(jìn)細(xì)胞貼附（Mg2+Ca2+），起緩沖作用（HPO42-，HCO3-）；另一種勢(shì)微量元素，如鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅。第二十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日6、脂類和磷脂前體在使用血清的細(xì)胞培養(yǎng)中，脂類來自血清，在無血清培養(yǎng)中，有些細(xì)胞需要添加脂類，如膽固醇、脂肪酸、磷脂。特別是缺陷型細(xì)胞，對(duì)某種脂類有很高的依賴性。非營養(yǎng)性物質(zhì)1、抗生素細(xì)胞培養(yǎng)中，特別是原代細(xì)胞培養(yǎng)中，常使用抗生素抑制微生物的污染。2、pH緩沖劑最常用的緩沖劑是碳酸氫鈉，常用濃度26mmol/L，接近血中濃度，必須與5％～10％CO2平衡，否則培養(yǎng)基迅速變堿。HEPES是緩沖能力很強(qiáng)的化合物，但由于它相當(dāng)昂貴，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中很少使用。第二十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日3、酚紅酚紅普遍作為培養(yǎng)基的pH指示劑4、保護(hù)劑細(xì)胞保護(hù)劑指保護(hù)細(xì)胞免受由滲透壓變化、剪切、毒性金屬和氧化劑所引起的損傷的物質(zhì)。在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)受到機(jī)械攪拌和氣泡運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切損傷，某些大分子化合物，如甲基纖維素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、PluronicF68、血清白蛋白，能夠減輕這種損傷。5、還原劑某些還原劑在細(xì)胞培養(yǎng)中有特殊作用。β－巰基乙醇在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中能刺激抗體分泌，并促進(jìn)胱氨酸利用。第二十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日血清常用的血清是小牛血清、胎牛血清、馬血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清是極其復(fù)雜的混合物，含有食物物質(zhì)、代謝物、激素、血漿蛋白、破碎細(xì)胞釋放物質(zhì)、采血中引入的污染物。由于歷史原因，商業(yè)培養(yǎng)基大都是按添加血清來設(shè)計(jì)的，使用血清技術(shù)也很成熟，盡管使用血清有許多缺點(diǎn)，仍將其作為細(xì)胞培養(yǎng)最重要的添加劑普遍采用。第二十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日三、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定

培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。

第二十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。

用臺(tái)盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。

第二十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日四、培養(yǎng)物的污染及防止污染途徑

1空氣：空氣流動(dòng)性大，如果培養(yǎng)操作場(chǎng)地于外界隔離不嚴(yán)格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場(chǎng)所。無菌操作應(yīng)在凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作時(shí)要帶口罩

第二十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日2器材：各種培養(yǎng)器皿

3操作：實(shí)驗(yàn)操作無菌觀念不強(qiáng)，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等，都可以造成污染。

4血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。

5組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞細(xì)胞生長。

第二十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日五、動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)（一）培養(yǎng)環(huán)境1、溫度溫度是細(xì)胞在體外生存的基本條件之一，來源不同的動(dòng)物細(xì)胞，其最適的生長溫度不同。例如昆蟲細(xì)胞的最適溫度是25～280C，人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最適溫度是370C，細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比，超出最適溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長將會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致死亡。第二十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日2、pH大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)影響培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定性的主要因素有三種：（1）緩沖液的緩沖能力及種類（2）對(duì)流空間大?。?）葡萄糖濃度培養(yǎng)液中正常的緩沖系統(tǒng)是NaHCO3/CO2系統(tǒng)，它是一種弱緩沖系統(tǒng)，其pK為6.1，低于生理學(xué)最佳要求。這種緩沖系統(tǒng)要求在培養(yǎng)液上面的對(duì)流空間加入CO2以防止它的丟失及增加羥基離子。第三十頁，共四十五頁，2022年，8月28日也可使用磷酸緩沖液，但磷酸對(duì)動(dòng)物細(xì)胞有毒害作用。HEPES生物緩沖劑也曾被加入NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)中，這是由于HEPES的pK為7.0，HEPES被加入后，其緩沖能力為pH6.8～7.2。。但是當(dāng)HEPES濃度高于25mmol/L時(shí)，它對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都有毒害作用。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)常有幾種方法來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的pH：（1）在培養(yǎng)基中添加NaHCO3作為緩沖劑及通入含CO2的空氣進(jìn)行調(diào)節(jié)第三十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)要求低攪拌和弱混合，利用NaOH或HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)會(huì)發(fā)生局部過酸或過堿的現(xiàn)象，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此這種調(diào)節(jié)方法在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不太合適。通常通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中NaHCO3用量及通氣中CO2濃度來控制發(fā)酵過程的pH。第三十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日3、溶解氧大規(guī)模培養(yǎng)中如何提供足夠的氧是非常重要的。通氣得得目的有兩個(gè)：一是提供細(xì)胞代謝所需的足夠的氧；二是使發(fā)酵液處于均勻懸浮狀態(tài)，有利于傳質(zhì)過程。第三十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日（三）培養(yǎng)容器1、多孔板、Petri培養(yǎng)皿和組織培養(yǎng)方瓶都是常用的靜止培養(yǎng)容器，體積小，操作方便，很容易放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、滾瓶也是一種重要的培養(yǎng)容器，培養(yǎng)時(shí)放在滾瓶機(jī)上緩慢滾動(dòng)，但培養(yǎng)條件很接近于靜止培養(yǎng)。它體積交大，接種后放入溫室或?qū)ｉT的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)依賴性貼壁培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需加入微載體以增加培養(yǎng)表面積。3、生物反應(yīng)器是大規(guī)模培養(yǎng)中最重要的培養(yǎng)設(shè)備。它有各種不同形式，容積可以從1升到幾十立方米。第三十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日微載體微載體是指直徑在60～250μm、適合于動(dòng)物細(xì)胞貼附和生長的微珠。微載體法培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞有很多好處;①可在反應(yīng)器中提供大的比表面積②可采用均勻懸浮培養(yǎng)，簡化了各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，提高了培養(yǎng)系統(tǒng)的重演性③可用普通顯微鏡觀察細(xì)胞在微載體上的生長情況④容易放大⑤適合于多種貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)⑥容易收獲細(xì)胞。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是：①細(xì)胞生長在微載體表面，易受到剪切損傷，不適合貼壁不牢的細(xì)胞生長②微載體價(jià)格較貴，一般不能重復(fù)使用③需要較高的細(xì)胞接種量。第三十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)指細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長的過程，主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與微生物過程比較接近，但由于動(dòng)物細(xì)胞對(duì)攪拌和通氣造成的流體剪切很敏感，在反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和操作上又有特殊要求如利用螺旋帶葉輪減小生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中的剪切作用，并通過表面充氣及誘導(dǎo)表面氣泡產(chǎn)生具有雙層濾網(wǎng)的新型攪拌器，它提高了氧傳遞速率第三十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日目前，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)器、螺旋膜反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。第三十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器與其它反應(yīng)器相比，結(jié)構(gòu)簡單，無轉(zhuǎn)動(dòng)部件，細(xì)胞損傷率低，減少了污染的機(jī)會(huì)；產(chǎn)生的湍動(dòng)溫和而均勻，剪切力相當(dāng)??；當(dāng)大容易；直接通氣供氧，氧傳遞速率高，供氧充分；液體循環(huán)量大，細(xì)胞和營養(yǎng)成分混合均勻。存在問題：由于液體混合的能量唯一來自通入的氣體，因而通氣量大，泡沫多，而且氣泡破碎造成嚴(yán)重的細(xì)胞機(jī)械損傷第三十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日通氣攪拌生物反應(yīng)器根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，要求攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)混合性能好，產(chǎn)生的剪切力小，氣泡產(chǎn)生的不利影響小。設(shè)計(jì)有多種形式的攪拌器，應(yīng)用最多的是籠式攪拌器?；\式攪拌器有兩個(gè)由200目不銹鋼絲網(wǎng)圍成的籠式腔。下部的是通氣腔，上部的是消泡腔，之間有細(xì)管相通。氣體交換在通氣腔內(nèi)進(jìn)行，其中的液體通過絲網(wǎng)與腔外的液體進(jìn)行交換。在氣體鼓泡中形成的泡沫經(jīng)細(xì)管進(jìn)入消泡腔，經(jīng)絲網(wǎng)破碎分成氣液兩部分，既做到深層通氣，又避免泡沫在反應(yīng)器中積累。

第三十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日攪拌器有三個(gè)導(dǎo)流筒，與攪拌器中心的垂直空腔相通，當(dāng)導(dǎo)流筒隨攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，由于離心力的作用，攪拌器中心的空腔產(chǎn)生負(fù)壓，使培養(yǎng)基從底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再從三個(gè)導(dǎo)流筒排出，繞攪拌器外緣螺旋式下降。懸浮細(xì)胞或貼附有細(xì)胞的微載體的密度接近于培養(yǎng)基，被培養(yǎng)基所裹脅，反復(fù)循環(huán)，充分混合。在微載體法培養(yǎng)貼壁動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，一般攪拌轉(zhuǎn)速在30～60r/min范圍內(nèi)，混合時(shí)間為12～24s。第四十頁，共四十五頁，2022年，8月28日中空纖維生物反應(yīng)器用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。其原理是：模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細(xì)胞近似生理?xiàng)l件的體外生長微環(huán)境，使細(xì)胞不斷生長。中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛細(xì)管，培養(yǎng)時(shí)纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無血清培養(yǎng)液，管外壁則供細(xì)胞黏附生長，營養(yǎng)物質(zhì)通過半透膜從管內(nèi)滲透出來供細(xì)胞生長；對(duì)于血清等大分子營養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，否則會(huì)被半透膜阻隔不能被細(xì)胞利用；細(xì)胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內(nèi)，