基因工程抗體和抗體工程

第五節(jié)抗體工程抗體研究進(jìn)展3個(gè)階段：①1890年白喉抗毒素，多克隆抗體；②1975年雜交瘤技術(shù)單克隆抗體；③1994年基因工程抗體；Cgenescodefortheconstantregionsofimmunoglobulinproteinchains.

Vgeneissequencecodingforthemajorpartofthevariable(N-terminal)regionofanimmunoglobulinchain.Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes

Figure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesTable24.1EachimmunoglobulinfamilyconsistsofaclusterofVgeneslinkedtoitsCgene(s).Immunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytes

FamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>100098Figure24.5ThelambdaCgenesegmentisprecededbyaJsegment,sothatV-Jrecombinationgeneratesafunctionallambdalight-chaingene.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.6ThekappaCgenesegmentisprecededbymultipleJsegmentsinthegermline.V-JjoiningmayrecognizeanyoneoftheJsegments,whichisthensplicedtotheCgenesegmentduringRNAprocessing.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.7Heavygenesareassembledbysequentialjoiningreactions.FirstaDsegmentisjoinedtoaJsegment;thenaVgenesegmentisjoinedtotheDsegment.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.8ThelambdafamilyconsistsofVgenesegmentslinkedtoasmallnumberofJ-Cgenesegments.Thediversityofgermlineinformation

Figure24.9ThehumanandmousekappafamiliesconsistofVgenesegmentslinkedto5JsegmentsconnectedtoasingleCgenesegment.Thediversityofgermlineinformation

Figure24.10Asinglegeneclusterinmancontainsalltheinformationforheavy-chaingeneassembly.ThediversityofgermlineinformationFigure24.12Consensussequencesarepresentininvertedorientationateachpairofrecombiningsites.Onememberofeachpairhasaspacingof12bpbetweenitscomponents;theotherhas23bpspacing.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure24.13Breakageandreunionatconsensussequencesgeneratesimmunoglobulingenes.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure15.8Reciprocalrecombinationbetweendirectrepeatsexcisesthematerialbetweenthem;eachproductofrecombinationhasonecopyofthedirectrepeat.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure15.9Reciprocalrecombinationbetweeninvertedrepeatsinvertstheregionbetweenthem.一、噬菌體抗抗體庫(kù)技術(shù)的的

基本方法法⒈獲取目的基基因⒉抗體庫(kù)技術(shù)術(shù)的載體⒊淘篩⒋表達(dá)與鑒定定它是在PCR技術(shù)和PhageDisplay的基礎(chǔ)上上實(shí)現(xiàn)的。其其過(guò)程是把用用PCR法得得到的抗體基基因插入絲狀狀噬菌體的DNA，與噬噬菌體外殼蛋蛋白的基因相相連，在輔助助噬菌體的幫幫助下，噬菌菌粒包裝成絲絲狀噬菌體，，抗體分子通通過(guò)與PⅢⅢ或PⅧ相連連，在噬菌體體表面的一端端或分散分布布，然后可直直接對(duì)噬菌體體表面的抗體體分子進(jìn)行篩篩選。噬菌菌體體抗抗體體庫(kù)庫(kù)技技術(shù)術(shù)1990年年McCafferty等等成成功功地地建建立立了了噬噬菌菌體體表表面面展展示示系系統(tǒng)統(tǒng)，，通通過(guò)過(guò)將將抗抗溶溶菌菌酶酶單單鏈鏈抗抗體體基基因因克克隆隆于于fd噬噬菌菌體體基基因因3的的下下游游，，使使ScFv以以融融合合蛋蛋白白的的形形式式展展示示于于噬噬菌菌體體表表面面，，利利用用親親和和層層析析，，兩兩輪輪富富集集達(dá)達(dá)106倍。該技技術(shù)的成成功給抗抗體基因因的篩選選工作帶帶來(lái)了革革命性的的變革。。噬菌體表表面展示示系統(tǒng)(phagesurfacedisplaysystem)噬菌體表表面展示示文庫(kù)技技術(shù)的要要點(diǎn):外源基因因表達(dá)多多肽以融融合蛋白白形式展展示在外外殼蛋白白N端將基因組組合文庫(kù)庫(kù)插入噬噬菌體編編碼膜蛋蛋白的基基因g3或g8的的先導(dǎo)系系列的緊緊靠下游游隨機(jī)克隆隆入相應(yīng)應(yīng)載體形形成組合合文庫(kù)從免疫或或未被免免疫的B細(xì)胞中中PCR擴(kuò)增抗抗體全套套基因片片段用固相化化抗原經(jīng)經(jīng)“親和和結(jié)合一一洗脫一一擴(kuò)增””數(shù)個(gè)循循環(huán)直接接、方便便、簡(jiǎn)捷捷、高效效地篩選選出表達(dá)達(dá)特異性性好、親親和力強(qiáng)強(qiáng)的抗體體噬菌體體庫(kù)。使翻譯譯出的的抗體體分泌泌到細(xì)細(xì)菌的的質(zhì)周周腔內(nèi)內(nèi)，形形成游游離的的抗體體片段段，經(jīng)經(jīng)過(guò)純純化即即可獲獲得目目的抗抗體。。篩選到到的噬噬菌體體再將將基因因g3或g8切切除后后，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入大大腸桿桿菌，，該項(xiàng)技技術(shù)的的優(yōu)點(diǎn)點(diǎn):將抗體的的基因因型和和表型型緊密密聯(lián)系系起來(lái);可繞過(guò)過(guò)雜交交瘤技技術(shù)，，不需需要復(fù)復(fù)雜的的基因因工程程技術(shù)術(shù);抗體基基因篩篩選的的范圍圍廣;技術(shù)穩(wěn)穩(wěn)定、、可靠靠、生生產(chǎn)周周期短短;可可規(guī)模?；a(chǎn);適用范范圍廣廣，既既可用用于抗抗體制制備，，也適適用于于其它它蛋白白如激激素、、酶、、藥物物、隨隨機(jī)多多肽等等的生生產(chǎn)。。噬菌體體抗體體庫(kù)技技術(shù)的的發(fā)展展具有有很大大優(yōu)越越性。。它簡(jiǎn)簡(jiǎn)單易易行，，篩選選容量量大，，效率率高，，繞過(guò)過(guò)了細(xì)細(xì)胞融融合及及免疫疫等步步驟，，而且且在表表型一一基因因型的的統(tǒng)一一和識(shí)識(shí)別一一增殖殖過(guò)程程上模模擬了了B細(xì)細(xì)胞的的成熟熟過(guò)程程，從從而在在實(shí)際際應(yīng)用用上具具有很很大意意義。。二、噬噬菌體體抗體體庫(kù)技技術(shù)的的特特點(diǎn)⒈模擬擬天然然全套套抗體體庫(kù)⒉避開開了人人工免免疫和和雜交交瘤技技術(shù)⒊可獲獲得高高親和和力的的人源源化抗抗體單克隆隆抗體體噬噬菌體體抗體體雜雜交交瘤技技術(shù)展展示示技術(shù)術(shù)宿主細(xì)細(xì)胞:雜雜交瘤瘤細(xì)細(xì)菌菌篩選范范圍:~103107109時(shí)間:幾幾個(gè)個(gè)月幾幾周周操作:繁繁雜雜相相對(duì)簡(jiǎn)簡(jiǎn)單免疫:必必須可可避避免人源抗抗體:+費(fèi)用:高高低低生產(chǎn)量量:有有限限無(wú)無(wú)限基因獲獲取:再再克隆隆直直接應(yīng)用前前景:有有限不不可估估三、基因工工程抗體表表達(dá)⒈原核細(xì)胞胞表達(dá)⒉真核細(xì)胞胞表達(dá)⒊轉(zhuǎn)基因植植物表達(dá)⒋轉(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物表達(dá)第六節(jié)抗抗體診斷斷試劑一、血清學(xué)學(xué)鑒定用的的抗體類試試劑⒈鑒定病原原菌的抗體體試劑⑴常用診斷斷血清的品品種和用途途①沙門氏菌菌屬診斷血血清②志賀氏菌菌屬診斷血血清③病原性大大腸埃希氏氏菌診斷血血清⑵診斷血清清的制備步步驟①制備細(xì)菌菌抗原②免疫動(dòng)物物和制備抗抗體血清⑶診斷血清清診斷方法法⒉乙型肝炎炎病毒表面面抗原的反向被動(dòng)血血凝診斷試試劑⒊妊娠診斷斷試劑⒋抗ABO血型系統(tǒng)統(tǒng)血清二、免疫標(biāo)標(biāo)記技術(shù)用用的抗體類類試劑⒈熒光抗體體診斷試劑劑⑴熒光抗體體的制備⑵免疫熒光光測(cè)定方法法⒉免疫酶抗抗體診斷試試劑⑴免疫酶染染色法用抗抗體診斷試試劑⑵酶免疫測(cè)測(cè)定用抗體體診斷試劑劑①HBsAg酶標(biāo)診診斷試劑②HBeAg酶標(biāo)診診斷試劑③HAVAg（甲型型肝炎病毒毒抗原）酶標(biāo)診斷試試劑④測(cè)定HIV（人免免疫缺陷病病毒）抗原的酶標(biāo)抗抗體診斷試試劑⑤甲胎蛋白白（AFP）酶標(biāo)抗抗體診斷試劑⑥癌胚抗原原（CEA）的酶標(biāo)標(biāo)抗體診斷試劑⒊放射免疫疫用抗體診診斷試劑放射免疫技技術(shù)是將放放射性核素素分析的高高度靈敏性性與抗原抗抗體反應(yīng)的的特異性結(jié)結(jié)合起來(lái)建建立的檢測(cè)測(cè)技術(shù)。放射性核素素標(biāo)記抗體體的方法：：①氯胺-T法②Iodogen氏氏法抗原的測(cè)定定有：①夾心法②間接法③竟?fàn)幏?.競(jìng)爭(zhēng)法法Ag※Ag※Ab+AbAg(標(biāo)本本)(定定量)AgAbEE終止液標(biāo)本酶標(biāo)抗體底物顯色顯色固相固相標(biāo)本酶標(biāo)二抗底物1.夾心法2.間接法①HBsAg放射性核素素標(biāo)記抗體診斷試劑②HBeAg放射性核素素標(biāo)記抗體診斷試劑③HAV抗原原放射性核素素標(biāo)記抗體診斷試劑④AFP放射射性核素標(biāo)記記抗體診斷試劑⑤CEA放射射性核素標(biāo)記記抗體診斷試劑常用標(biāo)記抗體體試劑有：三、導(dǎo)向診斷斷藥物放射性核素標(biāo)標(biāo)記抗體腫瘤放射免疫疫顯像放射免疫顯像像優(yōu)點(diǎn)：①在體內(nèi)確切切腫瘤定位作作用，準(zhǔn)確性性達(dá)90%，，靈敏度達(dá)100%。②在體內(nèi)可檢檢出0.5cm大小的病病灶，并可檢檢出肺腦的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移灶。③小分子抗體體易到達(dá)腫瘤瘤部位，可顯著提高N/NT值。。④抗體體在腫腫瘤部部位可可保留留6～～9日日⑤能觀擦擦抗體體在血血中的的半衰衰期和和可能出出現(xiàn)的的不良良反應(yīng)應(yīng)。放射免免疫顯顯像定定位技技術(shù)將抗腫腫瘤單單克隆隆抗體體（Ab））與二二乙基基三胺胺五乙乙酸（（DTPA）在在體外外偶聯(lián)聯(lián)成Ab-DTPA，再再注入入體內(nèi)內(nèi)后，，就能能與體體內(nèi)組組織相相結(jié)合合。由由于抗抗體分分子量量大，，需3天完完成。。3天天后注注入放放射性性核素素In-113M（（半衰衰期100m）），因因DTPA是重重金屬屬離子子絡(luò)合合劑，，所以以In-113M可可以結(jié)結(jié)合到到DTPA分子子上，，使腫腫瘤組組織顯顯像。。這一一過(guò)程程在2小時(shí)時(shí)內(nèi)可可完成成。建立預(yù)定定位技術(shù)術(shù)需解決決3個(gè)問(wèn)問(wèn)題：①抗體在在腫瘤組組織滯留留要7天天以上。。②②Ab-DTPA偶偶聯(lián)物比比較穩(wěn)定定；③內(nèi)源性性金屬離離子對(duì)DTPA的封閉閉作用要小小。第六節(jié)抗抗體體治療藥藥物以抗體為為載體的的導(dǎo)向治治療藥物物，還不不成熟。。一、放射射性核素素標(biāo)記的的抗體治治療藥物物抗體作為為放射性性核素的的導(dǎo)向載載體，標(biāo)標(biāo)記操作作簡(jiǎn)便用用量小。。放射性性核素標(biāo)標(biāo)記的抗抗體對(duì)腫腫瘤細(xì)胞胞殺傷較較大。二、抗癌藥藥物偶聯(lián)的的抗體藥物物⒈常用的抗抗癌藥物氨甲喋呤（（MTX））、阿霉素素（ADM）、絲裂裂霉素（MMC）等等。以人血血漿白蛋白白作為中間間載體，可可明顯提高高每分子抗抗體所攜帶帶的MTX量，使體體外細(xì)胞毒毒性體高二二倍。⒉抗體類藥藥物逆轉(zhuǎn)耐耐藥性腫瘤細(xì)胞對(duì)對(duì)抗原藥物物可產(chǎn)生多多藥耐藥性性（MDR）。MDR是由由基因調(diào)控控的，其編編碼蛋白稱稱為P糖蛋蛋白，其中中P170是與腫瘤瘤耐藥相關(guān)關(guān)的主要蛋蛋白，由Mdr1基基因編碼，，1280氨基酸殘殘基，分子子量170K。認(rèn)為P蛋白白是ATP酶依賴性性藥泵，藥藥物進(jìn)入細(xì)細(xì)胞后與P蛋白結(jié)合合，利用ATP水解解釋放的能能量將藥物物泵出胞外外，使胞內(nèi)內(nèi)藥物蓄積積減少，因因而產(chǎn)生耐耐藥性。三、毒素素偶聯(lián)的的抗體藥藥物⒈免疫毒毒素及其其換代制制品在導(dǎo)向向藥物物中，，毒素素和抗抗體的的交聯(lián)聯(lián)物稱稱為免免疫毒毒素。。第一代代免疫疫毒素素是包包含有有A、、B鏈鏈完整整毒素素和抗抗體的的交聯(lián)聯(lián)物，，其中中B鏈鏈非特特異性性結(jié)合合，使使其僅僅在體體外應(yīng)應(yīng)用。。第二代代