微生物實驗室無菌操作技術(shù)規(guī)范

目的規(guī)范無菌操作流程,減少及避免發(fā)生染菌現(xiàn)象出現(xiàn)。使用范圍無菌室及潔凈區(qū)的操作。無菌操作技術(shù)原則環(huán)境要清潔,在每次無菌操作結(jié)束后都需要對環(huán)境進(jìn)行清理、清洗;且避免操作前進(jìn)行清掃。做好個人衛(wèi)生,進(jìn)入無菌室前需修剪指甲、洗手,穿好無菌服,帽子需遮住所有頭發(fā),口罩遮住口鼻。在無菌操作時,不可講話,打噴嚏,對懷疑染菌的無菌物品,不可使用。內(nèi)容準(zhǔn)備:工作人員著裝整潔,洗手、戴口罩、修剪指甲;備齊用物（如:接種針、接種環(huán)、酒精燈、斜面、平皿、搖瓶、75%酒精棉、無菌水等）;核對無菌用品,接種菌種的種類、型號。所有實驗使用的物品都需要進(jìn)行消毒、滅殺;進(jìn)入潔凈區(qū)前需要經(jīng)傳遞窗進(jìn)行紫外表面消毒30min以上;開始實驗前需要打開超凈臺的紫外燈,消毒半個小時以上;超凈臺避免放入過多的物品（一般只放入當(dāng)次的實驗所有的物品）,所使用的試劑和耗材都需事先進(jìn)行滅菌（滅菌日期超過4天的需重新消毒）。進(jìn)入潔凈區(qū)前關(guān)閉紫外燈,并打開風(fēng)機(jī),等待半個小時以上,使臭氧盡量排放干凈。除去手腕等部位的飾品,穿好無菌服,戴好頭套、口罩,做到“三不漏”:不暴漏頭發(fā),不暴漏口鼻,不暴漏軀干皮膚和衣物。雙手要進(jìn)行清洗、消毒。要經(jīng)風(fēng)淋室風(fēng)淋30秒后再進(jìn)入潔凈室。在局部百級區(qū)域操作要戴一次性無菌手套。實驗操作過程中應(yīng)盡量減少進(jìn)入潔凈區(qū)的人員（不超過4人/間）并盡量減少人員走動。所有要放入超凈工作臺的物品都需進(jìn)過消毒液噴灑擦拭消毒。無菌物品若取離超凈臺則視為已污染,不得放回再用;無菌液體在取離超凈臺前必須密封其開口;密封的無菌液體容器在放入超凈臺后,對其開口前須對開口在酒精燈火焰上燒烤。在拆開任何一次性無菌使用耗材的包裝時都要在超凈臺內(nèi)完成,并須同時保證與細(xì)菌直接接觸的使用端/面不得與超凈臺內(nèi)的任何物品發(fā)生觸碰。工作臺面上的用品要放置有序、布局合理,一般說酒精燈（當(dāng)工作不需要時也可不用）在中間,右手使用的物品在右側(cè),左手使用的物品在左側(cè)。工作時忌忙亂而要有序。開始操作前先用醫(yī)用酒精對雙手進(jìn)行消毒。點(diǎn)燃潔凈工作臺內(nèi)的酒精燈,在打開/關(guān)閉試劑瓶口、試管口時應(yīng)將瓶口或者試管口過火;接種針、接種環(huán)在使用前或在與臺面發(fā)生碰觸后應(yīng)經(jīng)過火焰的灼燒;接種針/接種環(huán)過火操作方法為:使其頭部到身部反正面在火焰上各烤燎通紅;燒過的器械要冷卻后才能使用,以免對細(xì)菌造成損傷。操作前試管（或搖瓶）口需要在火焰上方反轉(zhuǎn)鐐銬兩周。操作時左手拿試管（或搖瓶）,右手拇指、食指、中指操作接種針（接種環(huán)）,右手小指和無名指夾住瓶塞,取下瓶塞,瓶塞再反轉(zhuǎn)鐐銬兩周后開始操作。在超凈臺內(nèi),盡量避免瓶口長時間敞開直立。蓋封瓶口時,應(yīng)將瓶口和瓶蓋內(nèi)面各自在火焰上燎烤兩周再蓋上瓶蓋。實驗用膠塞、橡皮乳頭等橡膠和塑料用品在過火焰時也不能時間過長,以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體,危害培養(yǎng)的細(xì)胞。無菌液體標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)移程序:4.2.1無菌液體的轉(zhuǎn)移須在超凈臺進(jìn)行,轉(zhuǎn)移過程要盡量保持密閉,必須用移液管或移液器來完成操作;移液管上方口應(yīng)塞入棉絮（脫脂棉）,用牛皮紙包好進(jìn)行消毒滅殺;無菌液體瓶再封口時,須將瓶口和瓶蓋分別燎烤2周后再封蓋;封蓋后須貼上相應(yīng)的標(biāo)簽;在使用移液管轉(zhuǎn)移液體時,應(yīng)保證移液管尖端距移液器邊緣1cm以上;在使用移液管時,每次液體吸入量不應(yīng)超過移液管的警示標(biāo)記,更不能觸及移液管上方的防塵棉絮;在使用移液管移出廢液時,移液管尖端應(yīng)距廢液缸5cm以上;在將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中時，移液管尖端應(yīng)距培養(yǎng)瓶0.5cm以上；放置吸管時管口應(yīng)向下傾斜,以防液體倒流入橡皮乳頭內(nèi)而引起污染或者損壞電動移液槍;向離心管、細(xì)胞凍存管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿內(nèi)添加液態(tài)物質(zhì)時,所加入的量不應(yīng)超過管上所標(biāo)示的最大量;實驗人員在操作時,應(yīng)保證開口離心管或開口試劑的上方為不可逾越區(qū);嚴(yán)格禁止采用雙臂交叉的方式來拿取尚在開口狀態(tài)的離心管或試劑瓶;在面向操作臺工作時勿大聲講話或咳嗽,以免噴出的唾沫把細(xì)菌帶入工作臺面發(fā)生污染;在使用細(xì)胞刮刀時,手握部位應(yīng)盡量遠(yuǎn)離培養(yǎng)瓶口,以防污染;如果在轉(zhuǎn)移任何液態(tài)物質(zhì)的過程中出現(xiàn)滴漏,則應(yīng)立即使用消毒液浸泡的棉球或紗