基因工程的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)

基因工程的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)第一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日1、有毒試劑基因工程實(shí)驗(yàn)安全溴化乙錠（EB）：

DEPC(焦碳酸二乙酯):強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)變性劑丙烯酰胺：有毒，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)

過硫酸酸銨：對(duì)粘膜和上呼吸道、眼睛和皮膚有較大危害性，吸入可致命。

第二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日2、紫外線紫外分析儀紫外滅菌3、放射線放射性同位素氯化銫：（重金屬）可因吸入、咽下或皮膚吸收而危害健康。

甲醛：毒性較大且易揮發(fā)，也是一種致癌劑酚、氯仿：蛋白質(zhì)變性劑4、轉(zhuǎn)基因生物5、水電安全第三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日需注意防止污染1、微生物污染2、DNA、RNA污染3、其他污染第四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日儀器的正確操作微量移液器離心機(jī)滅菌鍋蒸餾水器電子天平第五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的提純有很多方法。一

DNA的提取與純化第六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（一）、質(zhì)粒DNA的提取第七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.GenomicDNA第八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強(qiáng)堿中性第九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。變性第十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（2）

所用的試劑作用①

溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。第十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日③EDTAMg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS:溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白—SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。第十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。用來中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥

乙醇DNA用于沉淀DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。⑤NaAc-HAc緩沖液第十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日⑦RNaseA降解RNA。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。

Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。第十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。⑨

酚-氯仿選用以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。第十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（3）堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟

SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA第十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日溶液II

破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）第十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日最重要的是：2.影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素菌株的遺傳背景，質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。一般要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。（1）受體菌株endA基因編碼核酸內(nèi)切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的寡核苷酸片斷。第十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。（3）質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。（2）質(zhì)粒拷貝數(shù)質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定。第十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日若干常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量質(zhì)粒名分子大小bp拷貝數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)量g/ml

pGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.12第二十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（二）、基因組或其他DNA的提取1.細(xì)菌基因組DNA的制備大腸桿菌基因組DNA第二十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日

一般過程及原理：

（1）細(xì)胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37℃溫育。不用NaOH!第二十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。（2）DNA純化CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。苯酚2次酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶11次氯仿∶異戊醇24∶11次第二十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日

一般過程及原理：動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。

組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）組織粉碎2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的抽提第二十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50℃溫育。（2）細(xì)胞裂解（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。也是蛋白質(zhì)變性劑。苯酚2次酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶11次氯仿∶異戊醇24∶11次第二十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（5）除去RNA污染用RNase。用2倍體積的無水乙醇。（4）沉淀DNA（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）第二十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日

一般過程及原理：

（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。3.從植物組織中制備

DNA（2）細(xì)胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）?；?%SDS和蛋白酶K。

65℃溫育。第二十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日CTAB即十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑，在高離子強(qiáng)度的溶液里，CTAB與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于從大量產(chǎn)生粘多糖的有機(jī)體如植物以及某些革蘭氏陰性菌（包括E.coli的某些株）中制備純化DNA。

巰基乙醇作為還原劑使多酚氧化酶失活，可以防止酚類的氧化。第二十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日用0.6倍體積的異丙醇（-20℃）。（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）。第二十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（三）、DNA的定量和純度測定1.紫外光譜法DNA（或

RNA）在260nm波長處有特異的紫外吸收峰。用微量比色杯（10l）在紫外分光光度計(jì)直接測定。原理：蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰第三十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日2第三十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日濃度測定步驟一、用無菌TE或雙蒸水將待測樣品稀釋20倍或更高。二、用無菌TE或雙蒸水做對(duì)照，將紫外分光光度計(jì)260nm、280nm、310nm調(diào)到零點(diǎn)。三、加入DNA稀釋液在260nm、280nm、310nm測定OD值。四、計(jì)算DNA濃度ssDNA：[ssDNA]=33×（OD260—OD310）×稀釋倍數(shù)dsDNA：[dsDNA]=50×（OD260—OD310）×稀釋倍數(shù)ssRNA：[ssRNA]=40×（OD260—OD310）×稀釋倍數(shù)第三十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日衡量提取DNA的純度OD260/OD280＞1.8可能有RNA污染OD260/OD280＜1.8可能有蛋白質(zhì)污染再進(jìn)行酶消化處理，酚氯仿抽提去酶第三十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā)

紅色熒光。2.瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)原理：與已知濃度的DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對(duì)比，就可以估計(jì)出DNA含量。第三十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對(duì)比得知。DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。（四）、DNA分子量的估計(jì)MarkerMarker第三十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日DNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarker第三十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日

自從瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠被引進(jìn)核酸研究以來，凝膠電泳已經(jīng)發(fā)展成為一種分析重組DNA分子的重要技術(shù)手段，同時(shí)也被廣泛地應(yīng)用于DNA的核酸內(nèi)切酶消化片段的分析、分離和純化以及蛋白質(zhì)的分析和純化等方面的工作。二凝膠電泳技術(shù)第三十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日1.帶電荷的分子在電場中會(huì)以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng)，速度稱為電泳遷移率。2.電泳遷移率同電場的強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。3.電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。

（一）、電泳的基本原理第三十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日4.如果電場強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）：分子在電場中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和形狀。形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān):分子量越大，移動(dòng)越慢。摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度有關(guān)。5.第三十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日Relaxed

supercoiled

Increasingdegreeofsupercoiling

相同分子量的DNA:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，線性分子次之，伸展開環(huán)狀最慢。第四十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日超螺旋線性開環(huán)第四十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第四十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第四十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（二）、瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。

濃度高空隙小第四十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日瓊脂糖的濃度（%）分離DNA的片斷大?。╞p）0.30.71.450000—100020000—10006000—300空隙小，分辨率高：小分子較易通過，而大分子難通過；空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。3.瓊脂糖凝膠的分辨力空隙大小決定其分辨分子大小的能力。第四十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日帶電顆粒在電場作用下移動(dòng)的速度叫做電泳遷移率。（1）DNA分子的大小。（2）DNA的構(gòu)象。（3）瓊脂糖濃度。（4）溴化乙錠使DNA遷移率下降15%。（5）電壓。（6）電泳緩沖液的成分及濃度。何為電泳遷移率？影響DNA瓊脂糖凝膠電泳遷移率的因素有哪些？第四十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片斷大小（bp）4.010.020.01000—100500—2550—1（三）

、聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳：分離300—50000bp聚丙烯酰胺凝膠電泳：分離1—1000bp第四十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第四十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（四）、凝膠染色1.染料溴化乙錠。Ethidiumbromide（EB）第四十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強(qiáng)度與DNA含量及大小成正比。2.原理第五十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第五十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日

第五十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第五十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日UVP全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)第五十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日OMEGA8-LOGO全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)第五十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（五）、聚丙烯酰胺凝膠銀鹽染色法銀鹽染色法靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收。銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色。

第五十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日具體步驟1、固定液固定：2.5ml95%乙醇、2.5ml冰醋酸定容到500ml2、染色液染色：1克硝酸銀定容至500ml3、顯色液顯色：7.5克NaOH加5.4ml甲醛定容至500ml第五十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日DNA-DNA或DNA-RNA鏈雜交。用放射性同位素（32P或125I）標(biāo)記的DNA或RNA探針。三

核酸的分子雜交

第五十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（一）、Southernblot用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。第五十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第六十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第六十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日Southernblot篩選結(jié)果第六十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（二）、Northernblot用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。第六十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（三)、

原位雜交對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。需要目的基因的探針。第六十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第六十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日四

基因擴(kuò)增技術(shù)---PCR(一)、基因擴(kuò)增（geneamplification)指生物體內(nèi)或體外人工方式使基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。有下列五種方式：1.環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增2.基因的程序性擴(kuò)增5.PCR擴(kuò)增3.基因組進(jìn)化擴(kuò)增4.基因工程擴(kuò)增第六十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日1.環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增如氨甲喋呤誘發(fā)二氫葉酸還原酶基因擴(kuò)增。在環(huán)境因子的誘發(fā)下，某些基因產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增。在發(fā)育的某個(gè)階段，某些基因的大量擴(kuò)增。2.基因的程序性擴(kuò)增如非洲爪蟾卵子形成過程中rRNA基因的擴(kuò)增。第六十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日生物進(jìn)化過程中基因組中某些基因的拷貝數(shù)增加，結(jié)果相關(guān)的基因聚集成簇。5.PCR擴(kuò)增應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）技術(shù)，在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因。3.基因組進(jìn)化擴(kuò)增4.基因工程擴(kuò)增載體攜帶目的基因在寄主細(xì)胞中大量復(fù)制。第六十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（1）1.PCR的發(fā)明(二)、PCR技術(shù)1971年Khorana提出體外人工復(fù)制DNA的設(shè)想。當(dāng)時(shí)由于引物和DNA聚合酶及DNA測序技術(shù)都沒有解決，設(shè)想未能實(shí)現(xiàn)。PolymeraseChainReaction聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）技術(shù)是利用酶促反應(yīng)在體外指導(dǎo)特定DNA序列擴(kuò)增的方法，以熱變性的雙鏈DNA分子為模板，利用引物和四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）為原料在DNA聚合酶的作用下大量擴(kuò)增了特定的DNA片段。

第六十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（2）Mullis由此獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1985年Cetus公司的科學(xué)家K.B.Mullis發(fā)明了PCR，使這一設(shè)想變成現(xiàn)實(shí)。第七十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（3）TaqDNA聚合酶1988年

R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反應(yīng)中。使

PCR自動(dòng)循環(huán)儀成為可能。（4）PCR儀1988年

Cetus公司發(fā)明自動(dòng)熱循環(huán)儀。1986年

H.A.Erilish從嗜熱

水生菌分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段（37℃)，PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。第七十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第七十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日PCR儀第七十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日2.PCR技術(shù)的原理模板DNA變性引物DNA復(fù)性引物DNA延伸第七十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日雙鏈DNA在受熱后，配對(duì)堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開成為單鏈。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

TAGAACTTGACGTACGTA95℃（1）DNA模板變性模板模板（template）95℃第七十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日TGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

人工合成的單鏈DNA小片段，堿基順序分別與所要擴(kuò)增的模板DNA雙鏈的5’端相同。（2）DNA模板與引物復(fù)性模板模板ATCTTGAAC5’

3’

ACGTACGTA5’

3’

引物引物引物（primer）:40-65℃第七十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日DNA聚合酶按堿基配對(duì)原則在模板上延伸DNA鏈。（3）DNA鏈的延伸TGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

模板模板ATCTTGAAC5’

ACGTACGTA5’

TaqTaq72℃第七十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日理論上25-30次循環(huán)就可以合成225-230條DNA。變性—復(fù)性—延伸。（5）1個(gè)循環(huán)的結(jié)果（4）新一輪循環(huán)開始第七十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日3.PCR的過程（1）第一步預(yù)變性（denature）94-95℃下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。（2）第二步

循環(huán)（circle）94℃下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。①變性（denature）第七十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日72℃下1-2分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的3’端上加上核苷酸。③

延伸（extend）②復(fù)性（anneal）50-60℃下1分鐘，引物優(yōu)先與模板復(fù)性。①引物的濃度高②引物的鏈短。（3）第三步

補(bǔ)齊（fill）72℃下10分鐘，TaqDNA聚合酶在非全長片段的3’端上加上核苷酸使之成為全長片段。第八十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第二步——第三步——第四步復(fù)性延伸變性95℃5min50℃1min72℃2min94℃1min溫度循環(huán)72℃10min第八十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日PCR儀的溫度循環(huán)程序第八十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第八十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日需要的模板量極低。4.PCR的特點(diǎn)（1）特異性強(qiáng)

①PCR使用專門合成的DNA引物。②延伸過程是在高溫下進(jìn)行。（2）敏感性高

這就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特異性。理論上只要一條模板鏈，32次循環(huán)就可合成約109條！第八十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日RT-PCR：對(duì)模板的純度要求低。（5）可以擴(kuò)增mRNA（4）簡便

先用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。（3）快速

整個(gè)PCR過程約4小時(shí)即可完成。不需要純化，甚至可以直接用細(xì)菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。第八十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日自從H.A.Erilish分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37℃)，PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。（1）TaqDNA聚合酶

5.影響

PCR的因素TaqDNA聚合酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過程的反復(fù)高溫變性要求。①

熱穩(wěn)定性第八十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日最適溫度：

75-80℃

延伸速度：

約35-150nt/s.酶分子最長延伸長度：6.7kb②

最適溫度高③Taq酶的功能缺點(diǎn)具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但沒有3’

5’外切酶活性。因此不能修復(fù)錯(cuò)誤的堿基配對(duì)！

合成超過600bp長度的DNA就有可能出現(xiàn)錯(cuò)配，用于克隆基因時(shí)必須測序。第八十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日金屬離子敏感（尤其是Mg2+

）。當(dāng)dNTP（能結(jié)合Mg2+）的濃度為時(shí)，MgCl2的最佳濃度應(yīng)是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活劑50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。第八十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（2）其它耐熱的

DNA聚合酶

①TthDNA聚合酶無3’5’DNA外切酶活性，但高溫下能逆轉(zhuǎn)錄cDNA，又能擴(kuò)增DNA。②VENTDNA聚合酶有3‘5’外切酶活性，能夠校正堿基的錯(cuò)配。能耐受100℃高溫。第八十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日③PfuDNAPolymerase④

TaqPlusDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。但PCR產(chǎn)物為平端！

是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA聚合酶中出錯(cuò)率最低的。是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。

Taq的PCR產(chǎn)物3’端往往帶有一個(gè)A。第九十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日與待擴(kuò)增的模板DNA區(qū)段的兩3’端序列互補(bǔ)（

5’端相同）的短DNA。（3）引物（primer)①位置3’

3’

第九十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日即2.751011bp的基因組中有一次完全與19個(gè)核苷酸的序列相同的機(jī)會(huì)（或機(jī)會(huì)是約2×10-11）。②引物的長度理論計(jì)算：419=2.751011。一般引物設(shè)計(jì)為長15—30bp。第九十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日③引物的堿基序列

5’端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè)內(nèi)切酶的切點(diǎn)順序、RNA聚合酶識(shí)別序列、突變位點(diǎn)或生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’

3’GCTAGCTACTTAAG5’

3‘端必須與模板正確配對(duì)，5’端可以不配對(duì)。templateprimer第九十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力，堿基隨機(jī)分布,一般G+C%含量宜在45-55%左右。④引物的堿基組成避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列.

5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’

GACGG5’

T發(fā)卡結(jié)構(gòu)1）2）第九十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日3）避免形成引物二聚體（dimer）兩個(gè)引物之間不能有兩個(gè)以上的連續(xù)堿基序列互補(bǔ)。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer第九十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日4）引物3`端堿基最好選T,C,G而不選A,這樣有利于延伸;

5）為了便于后續(xù)的克隆可以在5`端加保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)。第九十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2當(dāng)引物中的（G+C）含量低于50%時(shí)，復(fù)性溫度低于55℃。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。實(shí)際復(fù)性溫度選擇低于Tm值5℃。手工計(jì)算：一般估計(jì)：第九十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日⑥引物的濃度一般使用終濃度各0.5mol/L。⑦簡并引物如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來的，就必須考慮密碼的簡并性。需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個(gè)或幾個(gè)堿基差異。這樣的混合引物稱簡并引物。第九十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日設(shè)計(jì)多組引物，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。引物設(shè)計(jì)現(xiàn)在多用專業(yè)軟件

⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer5.0等第九十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日Primer5.0第一百頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百零一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百零二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百零三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百零四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百零五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百零六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百零七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百零八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百零九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百一十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百一十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百一十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA酶、Mg2+的螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。（4）模板（template)②

模板的量：不能太多，100l反應(yīng)體系中100ng足夠。①

純度：PCR對(duì)模板DNA的純度要求不高。第一百一十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日

dNTPs是

dATP、dTTP、dCTP和dGTP的總稱。（5）dNTPs一般反應(yīng)體系中dNTP混合液終濃度用0.2mmol/L。濃度過高會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加錯(cuò)配率。第一百一十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶要求有游離的Mg2+

。（6）Mg2+

的濃度

所以Mg2+濃度不能太低。但太高會(huì)增加非特異產(chǎn)物（雜帶）。一般用的MgCl2終濃度。第一百一十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系1、引物各0.1umol2、4種dNTP各200umol/L3、10×buffer10ul2.5ul4、模板DNA

0.1～2ug0.025～0.5ug5、Taq酶2.5u0.625u6、Mg2+1.5mmol/L7、ddH2O加至100ul加至25ul100ul25ul第一百一十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日6.PCR技術(shù)的延伸技術(shù)（1）熒光實(shí)時(shí)定量PCR常規(guī)PCR電泳鑒定產(chǎn)物的量缺憾1無法對(duì)初始模板精確定量2無法實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增情況3跑膠繁瑣、易污染第一百一十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日借助于熒光信號(hào)來檢測PCR產(chǎn)物?？梢宰龅絇CR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)Ct值確定起始DNA的拷貝數(shù)，做到真正意義上的DNA定量。

Real—time

PCR（或TaqMan

PCR）Ct值：樣品到達(dá)閾值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

第一百一十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日ThresholdlineC(t)value

閾值：熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)。

C(t)值：熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。第一百一十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日熒光強(qiáng)度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210

設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量unknown104103Ct值模板量到達(dá)閾值的循環(huán)數(shù)閾值第一百二十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日擴(kuò)增兩個(gè)引物外側(cè)的未知序列（2）反向PCR把線性DNA模板轉(zhuǎn)變成環(huán)形分子。templatetemplate3’

5’

5’

3’

（傳統(tǒng)PCR只擴(kuò)增兩個(gè)引物質(zhì)之間的已知序列）。技術(shù)關(guān)鍵：第一百二十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日使引物的外側(cè)序列“轉(zhuǎn)變”成內(nèi)側(cè)序列。第一百二十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日低濃度的引物（限制引物）首先被用完，隨后只有高濃度的引物，繼續(xù)合成單鏈DNA。最后產(chǎn)物中99%是單鏈DNA。（3）不對(duì)稱PCR3’

5’

5’

3’

引物少用于擴(kuò)增單鏈DNA，單鏈DNA更適于測序。技術(shù)關(guān)鍵：兩個(gè)引物的濃度相差100倍。第一百二十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日擴(kuò)增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。（4）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)Temin,H.發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶，1975諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)關(guān)鍵：利用反轉(zhuǎn)錄酶，把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第一百二十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日RNAtemplate3’

5’

下游引物cDNAfirststrand3’

5’

上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’

5’

3’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶第一百二十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日(5)巢式PCR（Nest-PCR）巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5'RACE）的特異性。P1P3P4P2第一百二十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（6）原位PCR(in-situPCR)原位PCR是Hasse等于1990年建立的技術(shù)，就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù)。原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實(shí)用價(jià)值。

第一百二十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（7）錨定PCR（anchoredPCR）錨定PCR：擴(kuò)增已知序列側(cè)翼未知序列的一種PCR方法，未知的3’端添加一同聚物尾（polyG)，以互補(bǔ)的同聚物引物（polyC)和按已知序列設(shè)計(jì)的引物一起作PCR擴(kuò)增。關(guān)鍵：利用末端轉(zhuǎn)移酶在未知一端創(chuàng)造引物結(jié)合位點(diǎn)第一百二十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日已知序列末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC未知序列5’3’第一百二十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日7.PCR技術(shù)的應(yīng)用（1）擴(kuò)增某一段DNA從基因組中擴(kuò)增；從載體上擴(kuò)增；組織樣本原位擴(kuò)增；微量殘留DNA擴(kuò)增；分析模板序列；第一百三十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復(fù)、插入、替換等）。（2）基因的體外誘變

技術(shù)關(guān)鍵：利用引物的5‘端序列不要求與模板嚴(yán)格配對(duì)，設(shè)計(jì)引物時(shí)引入突變序列。第一百三十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日設(shè)計(jì)引物定點(diǎn)誘變第一百三十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日利用6bp長度的隨機(jī)序列引物擴(kuò)增細(xì)胞中的總DNA，將會(huì)得到許多非特異性產(chǎn)物，反映了該引物序列在基因組中的分布狀況。（3）基因組的比較研究

比較不同物種之間的基因組特征和相似性。限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）分析。RAPD(RandomamplifiedpolymorphismDNA)第一百三十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百三十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日1970年人們就有足夠的理論知識(shí)來提出目前所用的快速DNA序列分析法。但當(dāng)時(shí)在認(rèn)識(shí)上和技術(shù)上存在兩個(gè)問題：當(dāng)時(shí)沒有能把不同長度的核苷酸片段分離開的技術(shù)。當(dāng)時(shí)的分析思路局限于RNA序列分析法。五

DNA序列分析（1965年Cornell大學(xué)的S.W.Holley等首次測定了75bp的酵母丙氨酸t(yī)RNA全序列。使用的是降解片段法）。第一百三十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日Sanger等1977年發(fā)明。(一)、雙脫氧鏈終止法FrederickSanger,1980年NobelPrize化學(xué)獎(jiǎng)第一百三十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（1）DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按堿基配

對(duì)的原則進(jìn)行的。（2）脫氧核糖的連接是以3’5’磷酸二脂鍵。（3）復(fù)制反應(yīng)可以在體外進(jìn)行。（4）2’和3’雙脫氧的ddNTP會(huì)使復(fù)制反應(yīng)終

止。1.原理

第一百三十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百三十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百三十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日（1）制備單鏈DNA模板2.技術(shù)要點(diǎn)

就是待測序的

DNA鏈。①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性；②與模板的親和力高，不會(huì)提前脫離模板。

（2）特殊的DNA多聚酶dNTP/ddNTP=100/1

（3）制備2’和3’雙脫氧的ddNTP時(shí),DNA電泳帶譜的分離效果最好，可讀出200多個(gè)核苷酸序列。第一百四十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日需帶有放射性或熒光標(biāo)記。（4）制備一小段單鏈引物（DNA或RNA）第一百四十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日3.Sanger雙脫氧終止法測序過程第一百四十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百四十三頁，共一百七十頁，2022年，8月28日模板序列第一百四十四頁，共一百七十頁，2022年，8月28日1977年，哈佛大學(xué)的A.M.Maxam和W.Gilbert發(fā)明。(二)、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法WalterGilbert,1980年NobelPrize化學(xué)獎(jiǎng)第一百四十五頁，共一百七十頁，2022年，8月28日末端放射性標(biāo)記的DNA片單鏈長度只差一個(gè)核苷酸的DNA鏈混合物化學(xué)試劑處理凝膠電泳放射性自顯影閱讀堿基順序特定的堿基中引入化學(xué)基團(tuán)DNA在被修飾的核苷酸位置斷裂1.原理

第一百四十六頁，共一百七十頁，2022年，8月28日堿基特異修飾方法GpH8.0,用硫酸二甲脂對(duì)N7進(jìn)行甲基化，使C8-C9鍵對(duì)堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0,哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化，從而導(dǎo)致脫嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán)，后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易于除去C在1.5mol/LNaCl存在時(shí)，可用肼除去胞嘧啶2.堿基特異的化學(xué)修飾法

第一百四十七頁，共一百七十頁，2022年，8月28日反應(yīng)切割堿基修飾修飾堿基的轉(zhuǎn)移DNA鏈的斷裂R1G>A硫酸二甲脂pH7.0加熱氫氧化鈉R2A>G硫酸二甲脂酸氫氧化鈉R3C+T肼六氫吡啶六氫吡啶R4C肼+鹽六氫吡啶六氫吡啶R5G硫酸二甲脂六氫吡啶六氫吡啶R6G+A酸酸六氫吡啶R7C+T肼六氫吡啶六氫吡啶R8C肼+鹽六氫吡啶六氫吡啶R9A>C氫氧化鈉六氫吡啶六氫吡啶R10G>A硫酸二甲脂pH7.0加熱六氫吡啶R11G亞甲藍(lán)六氫吡啶六氫吡啶R12T四氧化鋨六氫吡啶六氫吡啶3.堿基特異的化學(xué)切割法

第一百四十八頁，共一百七十頁，2022年，8月28日4.測序過程

第一百四十九頁，共一百七十頁，2022年，8月28日每組反應(yīng)只針對(duì)特定的堿基，共有4組反應(yīng)，可分別顯示G、A+G、C、C+T的終止位置。特點(diǎn)：讀出的序列就是要測的序列。Sanger測序法讀出的序列是新合成的互補(bǔ)鏈序列。第一百五十頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百五十一頁，共一百七十頁，2022年，8月28日第一百五十二頁，共一百七十頁，2022年，8月28日測序讀片第一百五十三頁